<ol>
	<li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon:+Dynamic+Characteristic.">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li><li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+voltage+clamp+to+record+small,+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li><li>Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+the+Na+/K+-ATPase+follows+the+conformational+state+of+the+holoenzyme.">The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.</a> J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).</li><li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters.">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> BBA - Biomembranes. 1465, 343-358 (2000).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Voltage-Dependent+Conformational+Changes+in+the+Shaker+K++Channel+with+Fluorescence.">Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K+ Channel with Fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Physical+Measure+of+Conformational+Rearrangement+Underlying+Potassium+Channel+Gating.">Direct Physical Measure of Conformational Rearrangement Underlying Potassium Channel Gating.</a> Science. 271, 213-216 (1996).</li><li>Koch, H. P., Larsson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+molecular+motions+accomplish+glutamate+uptake+in+human+glutamate+transporters.">Small-scale molecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 25, 1730-1736 (2005).</li><li>Dempski, R. E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Measurements+of+Intermolecular+Distances+between+the+&#945;-+and+&#946;-Subunits+of+the+Na+/K+-ATPase.">Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the &#945;- and &#946;-Subunits of the Na+/K+-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).</li><li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na+,K+-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li><li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Na+/K+-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li><li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties.">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li><li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K++Channel+Complexes.">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li><li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein.">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li><li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+movement+by+the+Na/K+pump+in+Xenopus+oocytes.">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li><li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation.">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K++channel.">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li><li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li><li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlasMapper:+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps.">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li></ol>

El método experimental que se describe combina sitios específicos de etiquetado fluoróforo y dos electrodos de voltaje abrazadera para investigar la relación entre estructura y función de proteínas de membrana. Esta técnica se puede utilizar para obtener tiempo de resolverse la información sobre la dinámica de conformación de las proteínas de membrana en el transporte de iones. Además, este enfoque puede ser adaptado para trabajar con varias proteínas, tales como las bombas iónicas, los canales iónicos y transportadores. Además de investigar la dinámica de conformación de un residuo específico, también es posible utilizar la transferencia de energía de resonancia fluorescente para determinar las limitaciones distancia dentro de una holoenzima. La determinación de las distancias entre los residuos, así como medir el movimiento relativo entre las subunidades puede ayudar a resolver las cuestiones clave relacionadas con los mecanismos de activación periódica.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo / Equipo </th><th> Empresa </th><th> Reactivo / Equipo </th><th> Empresa </th></tr><tr><td> Tungsteno de 100W Fuente de luz </td><td> Carl Zeiss MicroImaging </td><td> fluoresceína-5-maleimida </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 1B150F-4 </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> Alta-Pure PCR kit de extracción de </td><td> Roche </td></tr><tr><td> 3.0-4.0 Ethicon Vicryl </td><td> Johnson &amp; Johnson </td><td> mMessage mMachine Kit </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> 475AF40 excitación filtro </td><td> Omega Optical </td><td> MS-222 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> 505DRLP espejo dicroico </td><td> Omega Optical </td><td> Nucleospin plásmido Kit </td><td> Macherey-Nagel </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel </td><td> Omega Optical </td><td> Nanodrop 2000c Sprectrophotometer </td><td> Thermo Scientific </td></tr><tr><td> 535DF50 excitación filtro </td><td> Omega Optical </td><td> PC-10 Micropipeta Extractor </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> 560DRLP espejo dicroico </td><td> Omega Optical </td><td> pCLAMP 10 Software </td><td> Axon Instruments </td></tr><tr><td> 565ALP emisión de filtro </td><td> Omega Optical </td><td> PfuTurbo ADN polimerasa </td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLP emisión de filtro </td><td> Omega Optical </td><td> PIN-022A fotodiodo </td><td> Unidos Detector Tecnologías </td></tr><tr><td> 570DRLP espejo dicroico </td><td> Omega Optical </td><td> Los filtros polarizados </td><td> Linos Phtonics Inc. </td></tr><tr><td> Linos Phtonics Inc. </td><td> Omega Optical </td><td> QuickChange mutagénesis sitio-dirigida Kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Axio examinador microscopio de fluorescencia </td><td> Carl Zeiss MicroImaging GMBH </td><td> RC-10 fluorescencia Cámara </td><td> Warner Instrumentos </td></tr><tr><td> Warner Instrumentos </td><td> Tecnologías de la Vida </td><td> tetrametilrodamina-6-maleimida </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Digidata 1440A sistema de adquisición de datos </td><td> Axon Instruments </td><td> TOP10 células electrocompetentes </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Dpn I </td><td> New England Biolabs </td><td> Turbo Tec-05X Amplificador </td><td> npi </td></tr></tbody></table>

examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling

Dos electrodos de pinza de voltaje de electrofisiología (TEVC) es una herramienta poderosa para investigar el mecanismo de ion transporte1 para una amplia variedad de proteínas de membrana, incluidos los canales de iones de 2, 3 bombas de iones y transportadores 4. Los acontecimientos recientes han combinado sitios específicos de etiquetado fluoróforo junto TEVC para examinar al mismo tiempo la dinámica de conformación de residuos específicos y la función de estas proteínas en la superficie de las células individuales. Vamos a describir un método para estudiar la dinámica de conformación de las proteínas de membrana, simultáneamente, monitorear los cambios de fluorescencia y actual con voltaje-clamp fluorometría. Este enfoque puede ser utilizado para examinar el movimiento molecular de las proteínas de membrana sitio específicamente sustitución cisteína siguientes y dirigida a un sitio fluoróforo etiquetado 5,6. Además, este método ofrece un enfoque para determinar las limitaciones a la distancia entre los residuos específicos 7,8. Esto se logra mediante una selección de conectar fluoróforos donante y el receptor de dos residuos de cisteína mutantes de interés. En resumen, estos experimentos se llevan a cabo después de la expresión funcional de la proteína deseada en la superficie de los ovocitos de Xenopus Leavis. La gran superficie de estos ovocitos permite mediciones fáciles funcional y una señal potente de fluorescencia 5. También es posible cambiar fácilmente las condiciones extracelulares, tales como el pH, ligando o cationes / aniones, que pueden proporcionar más información sobre el mecanismo de cuatro proteínas de la membrana. Finalmente, los acontecimientos recientes también han permitido la manipulación de seleccionar los iones internos tras la co-expresión con una segunda proteína 9. El protocolo se describe en varias partes. En primer lugar, la mutagénesis de cisteína de exploración procedió, mediante el etiquetado fluoróforo se ha completado en los residuos ubicados en la interfase de los dominios transmembrana y extracelular. Experimentos posteriores han sido diseñados para identificar los residuos que muestran grandes cambios en la intensidad de fluorescencia (&lt;5%) 3 a un cambio conformacional de la proteína. En segundo lugar, estos cambios en la intensidad de la fluorescencia se comparan con los parámetros cinéticos de la proteína de membrana con el fin de correlacionar la dinámica de conformación de la función de la proteína 10. Esto permite un análisis riguroso biofísica del movimiento molecular de la proteína diana. Por último, dos residuos de la holoenzima se puede etiquetar con un donante y un fluoróforo aceptor con el fin de determinar las limitaciones de distancia, utilizando métodos de donantes fotodestrucción. También es posible controlar el movimiento relativo de las subunidades de la proteína después de marcar con un donante y un fluoróforo aceptor.

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling at JoVE.com

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Vamos a describir un método que mide la cinética del transporte de iones de proteínas de membrana junto con el sitio específico de análisis de los cambios conformacionales con fluorescencia en células individuales. Esta técnica se adapta a los canales iónicos, transportadores y bombas iónicas y pueden ser utilizados para determinar las limitaciones distancia entre subunidades de la proteína.

Examinar la dinámica conformacional de las proteínas de membrana In situ Sitio-dirigida con fluorescencia de etiquetado

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

examining-conformational-dynamics-membrane-proteins-situ-with-site

Research

JoVE Journal

Biology

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

14.5K vistas.  Worcester Polytechnic Institute. Vamos a describir un método que mide la cinética del transporte de iones de proteínas de membrana junto con el sitio específico de análisis de los cambios conformacionales con fluorescencia en células individuales. Esta técnica se adapta a los canales iónicos, transportadores y bombas iónicas y pueden ser utilizados para determinar las limitaciones distancia entre subunidades de la proteína.