<ol>
	<li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon:+Dynamic+Characteristic.">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li><li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+voltage+clamp+to+record+small,+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li><li>Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+the+Na+/K+-ATPase+follows+the+conformational+state+of+the+holoenzyme.">The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.</a> J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).</li><li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters.">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> BBA - Biomembranes. 1465, 343-358 (2000).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Voltage-Dependent+Conformational+Changes+in+the+Shaker+K++Channel+with+Fluorescence.">Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K+ Channel with Fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Physical+Measure+of+Conformational+Rearrangement+Underlying+Potassium+Channel+Gating.">Direct Physical Measure of Conformational Rearrangement Underlying Potassium Channel Gating.</a> Science. 271, 213-216 (1996).</li><li>Koch, H. P., Larsson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+molecular+motions+accomplish+glutamate+uptake+in+human+glutamate+transporters.">Small-scale molecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 25, 1730-1736 (2005).</li><li>Dempski, R. E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Measurements+of+Intermolecular+Distances+between+the+&#945;-+and+&#946;-Subunits+of+the+Na+/K+-ATPase.">Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the &#945;- and &#946;-Subunits of the Na+/K+-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).</li><li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na+,K+-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li><li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Na+/K+-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li><li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties.">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li><li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K++Channel+Complexes.">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li><li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein.">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li><li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+movement+by+the+Na/K+pump+in+Xenopus+oocytes.">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li><li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation.">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K++channel.">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li><li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li><li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlasMapper:+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps.">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li></ol>

L&#39;approche expérimentale que nous décrivons combine étiquetage fluorophore spécifique au site et de deux électrodes de tension de serrage pour étudier la relation entre structure et fonction des protéines membranaires. Cette technique peut être utilisée pour obtenir résolue en temps des informations sur la dynamique conformationnelle des protéines membranaires lors du transport d&#39;ions. Par ailleurs, cette approche peut être adaptée pour travailler avec diverses protéines, comme les pompes ioniques, les canaux ioniques et des transporteurs. En plus d&#39;enquêter sur la dynamique conformationnelle à un résidu de spécifique, il est également possible d&#39;utiliser Fluorescence Resonance Energy Transfer pour déterminer les contraintes de distance dans un holoenzyme. La détermination des distances entre les résidus ainsi que de mesurer le mouvement relatif entre sous-unités peuvent aider à résoudre des questions clés concernant les mécanismes de déclenchement.

<table border="1"><tbody><tr><th> Réactif / Equipement </th><th> Société </th><th> Réactif / Equipement </th><th> Société </th></tr><tr><td> Source de lumière tungstène 100W </td><td> Carl Zeiss </td><td> fluorescéine-5-maléimide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 1B150F-4 </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> Haute-Pure PCR kit d&#39;extraction </td><td> Roche </td></tr><tr><td> 3,0 à 4,0 Ethicon Vicryl </td><td> Johnson &amp; Johnson </td><td> mMessage mMachine Kit </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> 475AF40 filtre d&#39;excitation </td><td> Omega Optical </td><td> MS-222 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> 505DRLP miroir dichroïque </td><td> Omega Optical </td><td> Nucleospin Kit Plasmid </td><td> Macherey-Nagel </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel </td><td> Omega Optical </td><td> Nanodrop 2000c Sprectrophotometer </td><td> Thermo Scientific </td></tr><tr><td> 535DF50 filtre d&#39;excitation </td><td> Omega Optical </td><td> PC-10 Micropipette Puller </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> 560DRLP miroir dichroïque </td><td> Omega Optical </td><td> pClamp 10 Logiciel </td><td> Axon Instruments </td></tr><tr><td> 565ALP filtre d&#39;émission </td><td> Omega Optical </td><td> PfuTurbo ADN polymérase </td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLP filtre d&#39;émission </td><td> Omega Optical </td><td> PIN-022A Photodiode </td><td> United Technologies Détecteur </td></tr><tr><td> 570DRLP miroir dichroïque </td><td> Omega Optical </td><td> Filtres polarisés </td><td> Linos Phtonics Inc </td></tr><tr><td> Linos Phtonics Inc </td><td> Omega Optical </td><td> QuickChange Site-Directed Kit mutagenèse </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Axio Examiner fluorescence microscope </td><td> Carl Zeiss GMBH </td><td> RC-10 Chambre fluorescence </td><td> Warner Instruments </td></tr><tr><td> Warner Instruments </td><td> Life Technologies </td><td> tétraméthylrhodamine-6-maléimide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Digidata 1440A système d&#39;acquisition de données </td><td> Axon Instruments </td><td> TOP10 cellules électrocompétentes </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> J&#39;ai Dpn </td><td> New England Biolabs </td><td> Turbo Tec-05X Amplificateur </td><td> npi </td></tr></tbody></table>

examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling

Deux électrodes de tension pince électrophysiologie (TEVC) est un outil puissant pour étudier le mécanisme de l&#39;ion transports1 pour une grande variété de protéines membranaires dont 2 canaux ioniques, pompes ioniques à 3, 4 et les transporteurs. Les développements récents ont combiné spécifique au site d&#39;étiquetage fluorophore côtés TEVC d&#39;examiner simultanément la dynamique conformationnelle au niveau des résidus spécifiques et la fonction de ces protéines à la surface des cellules individuelles. Nous allons décrire une méthode pour étudier la dynamique conformationnelle de protéines membranaires par simultanément la surveillance des changements en cours en utilisant la fluorescence et voltage-clamp fluorométrie. Cette approche peut être utilisée pour examiner le mouvement moléculaire des protéines membranaires site-spécifique de remplacement cystéine suivantes et dirigée vers un site fluorophore étiquetage 5,6. Par ailleurs, cette méthode fournit une approche pour déterminer les contraintes de distance entre les résidus spécifiques 7,8. Ceci est réalisé de manière sélective la fixation des fluorophores donneur et accepteur de deux résidus cystéine muté d&#39;intérêt. En bref, ces expériences sont réalisées suivant l&#39;expression fonctionnelle de la protéine désirée sur la surface des ovocytes de Xenopus leavis. La grande surface de ces ovocytes permet faciles mesures fonctionnelles et un signal de fluorescence robuste 5. Il est également possible de changer facilement les conditions telles que le pH extracellulaire, un ligand ou de cations / anions, qui peuvent fournir de plus amples informations sur le mécanisme de 4 protéines membranaires. Enfin, les développements récents ont également permis à la manipulation de sélectionner les ions interne à la suite co-expression avec une seconde protéine 9. Notre protocole est décrit en plusieurs parties. Tout d&#39;abord, la mutagenèse de balayage cystéine procédé par étiquetage fluorophore est complétée au niveau des résidus situés à l&#39;interface de l&#39;domaines transmembranaires et extracellulaires. Des expériences ultérieures sont conçus pour identifier les résidus qui démontrent de grands changements dans l&#39;intensité de fluorescence (&lt;5%) 3 lors d&#39;un changement conformationnel de la protéine. Deuxièmement, ces changements dans l&#39;intensité de fluorescence sont comparés aux paramètres cinétiques de la protéine membranaire, afin de corréler la dynamique conformationnelle de la fonction de la protéine 10. Cela permet une analyse rigoureuse biophysiques du mouvement moléculaire de la protéine cible. Enfin, deux des résidus de l&#39;holoenzyme peut être marqué avec un fluorophore accepteur et de donneur afin de déterminer les contraintes de distance en utilisant des méthodes photodestruction donateurs. Il est également possible de suivre le mouvement relatif des sous-unités protéiques suivantes étiquetage avec un donneur et fluorophore accepteur.

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Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Nous allons décrire une méthode qui mesure la cinétique de transport des ions des protéines membranaires spécifiques au site aux côtés de l&#39;analyse des changements conformationnels à l&#39;aide de fluorescence sur des cellules individuelles. Cette technique est adaptable aux canaux ioniques, les transporteurs et les pompes ioniques et peut être utilisé pour déterminer les contraintes distance entre sous-unités protéiques.

L&#39;examen de la dynamique conformationnelle des protéines membranaires In situ Avec site-dirigé marquage fluorescent

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

14.5K vues.  Worcester Polytechnic Institute. Nous allons décrire une méthode qui mesure la cinétique de transport des ions des protéines membranaires spécifiques au site aux côtés de l'analyse des changements conformationnels à l'aide de fluorescence sur des cellules individuelles. Cette technique est adaptable aux canaux ioniques, les transporteurs et les pompes ioniques et peut être utilisé pour déterminer les contraintes distance entre sous-unités protéiques.