<ol>
	<li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon:+Dynamic+Characteristic.">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li><li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+voltage+clamp+to+record+small,+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li><li>Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+the+Na+/K+-ATPase+follows+the+conformational+state+of+the+holoenzyme.">The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.</a> J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).</li><li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters.">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> BBA - Biomembranes. 1465, 343-358 (2000).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Voltage-Dependent+Conformational+Changes+in+the+Shaker+K++Channel+with+Fluorescence.">Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K+ Channel with Fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Physical+Measure+of+Conformational+Rearrangement+Underlying+Potassium+Channel+Gating.">Direct Physical Measure of Conformational Rearrangement Underlying Potassium Channel Gating.</a> Science. 271, 213-216 (1996).</li><li>Koch, H. P., Larsson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+molecular+motions+accomplish+glutamate+uptake+in+human+glutamate+transporters.">Small-scale molecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 25, 1730-1736 (2005).</li><li>Dempski, R. E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Measurements+of+Intermolecular+Distances+between+the+&#945;-+and+&#946;-Subunits+of+the+Na+/K+-ATPase.">Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the &#945;- and &#946;-Subunits of the Na+/K+-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).</li><li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na+,K+-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li><li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Na+/K+-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li><li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties.">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li><li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K++Channel+Complexes.">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li><li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein.">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li><li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+movement+by+the+Na/K+pump+in+Xenopus+oocytes.">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li><li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation.">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K++channel.">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li><li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li><li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlasMapper:+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps.">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li></ol>

Der experimentelle Ansatz, den wir beschreiben, kombiniert ortsspezifische Fluorophor Kennzeichnung und zwei Elektroden Voltage-Clamp, um die Beziehung zwischen Struktur und Funktion von Membranproteinen zu untersuchen. Diese Technik kann verwendet werden, um zeitaufgelöste Informationen über die konformative Dynamik von Membranproteinen während Ionentransport zu erhalten. Darüber hinaus kann dieser Ansatz zugeschnitten, mit verschiedenen Proteinen wie Ionenpumpen, Ionenkanäle und Transporter zu arbeiten. Neben der Untersuchung der konformativen Dynamik zu einem bestimmten Rest, ist es auch möglich, Fluorescence Resonance Energy Transfer verwenden, um Abstand Einschränkungen innerhalb eines Holoenzym zu bestimmen. Die Bestimmung der Entfernungen zwischen den Resten sowie die Messung der relativen Bewegung zwischen Untereinheiten können zur Lösung Kernfragen mit Gating-Mechanismen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagenz / Equipment </th><th> Firma </th><th> Reagenz / Equipment </th><th> Firma </th></tr><tr><td> 100W Tungsten Light Source </td><td> Carl Zeiss MicroImaging </td><td> Fluorescein-5-Maleinimid </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 1B150F-4 </td><td> World Precision Instruments </td><td> High-Pure PCR Extraction Kit </td><td> Roche </td></tr><tr><td> 3,0-4,0 Ethicon Vicryl </td><td> Johnson &amp; Johnson </td><td> mMessage mMachine Kit </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> 475AF40 Anregungsfilter </td><td> Omega Optical </td><td> MS-222 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> 505DRLP dichroitischen Spiegel </td><td> Omega Optical </td><td> NucleoSpin Plasmid Kit </td><td> Macherey-Nagel </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel </td><td> Omega Optical </td><td> Nanodrop 2000c Sprectrophotometer </td><td> Thermo Scientific </td></tr><tr><td> 535DF50 Anregungsfilter </td><td> Omega Optical </td><td> PC-10 Micropipette Puller </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> 560DRLP dichroitischen Spiegel </td><td> Omega Optical </td><td> pCLAMP 10 Software </td><td> Axon Instruments </td></tr><tr><td> 565ALP Emissionsfilter </td><td> Omega Optical </td><td> PfuTurbo DNA Polymerase </td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLP Emissionsfilter </td><td> Omega Optical </td><td> PIN-022A Photodiode </td><td> United Detector Technologies </td></tr><tr><td> 570DRLP dichroitischen Spiegel </td><td> Omega Optical </td><td> Polarisierte Filter </td><td> Linos Phtonics Inc. </td></tr><tr><td> Linos Phtonics Inc. </td><td> Omega Optical </td><td> QuickChange Site-Directed Mutagenese Kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Axio Examiner Fluoreszenz-Mikroskop </td><td> Carl Zeiss MicroImaging GmbH </td><td> RC-10 Fluoreszenz-Kammer </td><td> Warner Instruments </td></tr><tr><td> Warner Instruments </td><td> Life Technologies </td><td> Tetramethylrhodamin-6-Maleinimid </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Digidata 1440A Datenerfassungssystem </td><td> Axon Instruments </td><td> TOP10 Elektrokompetente Cells </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Dpn I </td><td> New England Biolabs </td><td> Turbo Tec-05X-Verstärker </td><td> npi </td></tr></tbody></table>

examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling

Zwei Elektroden Voltage-Clamp-Elektrophysiologie (TEVC) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um den Mechanismus von Ionen-Transport1 für eine Vielzahl von Membranproteinen einschließlich Ionenkanäle 2, Ionenpumpen 3 und Transporter 4 Untersuchen. Die jüngsten Entwicklungen haben ortsspezifische Fluorophor Kennzeichnung neben TEVC, gleichzeitig untersuchen Konformationsdynamik an bestimmten Rückständen und Funktion dieser Proteine ​​auf der Oberfläche der einzelnen Zellen zusammen. Wir beschreiben eine Methode, um die konformative Dynamik von Membranproteinen durch die gleichzeitige Überwachung Fluoreszenz und aktuellen Änderungen mit Voltage-Clamp-Fluorometrie zu studieren. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um die molekulare Bewegung von Membranproteinen ortsspezifisch folgenden Cystein Ersatz-und ortsspezifische Fluorophor Kennzeichnung 5,6 untersuchen. Darüber hinaus liefert diese Methode eine Annäherung an Einschränkungen bei den spezifischen Rückstände 7,8 ermitteln. Dies wird durch selektives Anbringen Donor und Akzeptor Fluorophore zu zwei mutierte Cystein-Reste von Interesse erzielt. In Kürze sind diese Versuche folgende funktionelle Expression des gewünschten Proteins auf der Oberfläche des Xenopus-Oozyten leavis durchgeführt. Die große Oberfläche dieser Eizellen ermöglicht einfache funktionelle Messungen und eine robuste Fluoreszenzsignal 5. Es ist auch möglich, ohne Änderung der extrazellulären Bedingungen wie pH, Liganden oder Kationen / Anionen, die weitere Informationen über den Mechanismus von Membranproteinen 4 kann liefern. Schließlich haben die jüngsten Entwicklungen auch die Manipulation der Auswahl der internen Ionen folgenden Co-Expression mit einem zweiten Protein 9 aktiviert. Unser Protokoll ist in mehreren Teilen beschrieben. Zunächst ging Cystein-Scanning-Mutagenese von Fluorophor Kennzeichnung auf Rückstände an der Schnittstelle der Transmembran-und extrazellulären Domänen befindet sich abgeschlossen ist. Nachfolgende Experimente sind so konzipiert, Rückstände, die großen Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität (&lt;5%) 3 zeigen, auf eine Konformationsänderung des Proteins zu identifizieren. Zweitens sind diese Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität auf die kinetischen Parameter des Membranproteins verglichen, um die konformative Dynamik, um die Funktion der Protein 10 zu korrelieren. Dies ermöglicht eine konsequente biophysikalische Analyse der molekularen Bewegung des Zielproteins. Schließlich können zwei Reste der Holoenzym mit einem Donor-und Akzeptor Fluorophor markiert werden, um Abstand Einschränkungen mit Spendersamen Photozerstörung Methoden zu bestimmen. Es ist auch möglich, die relative Bewegung von Protein-Untereinheiten nach Markierung mit einem Donor-und Akzeptor Fluorophor zu überwachen.

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling at JoVE.com

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Wir beschreiben eine Methode, die die Kinetik von Ionen-Transport von Membranproteinen Maßnahmen neben site-spezifische Analyse von Konformationsänderungen mittels Fluoreszenz an einzelnen Zellen. Diese Technik ist anpassungsfähig an Ionenkanälen, Transportern und Ionenpumpen und kann genutzt werden, um Einschränkungen bei den Protein-Untereinheiten zu bestimmen.

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

examining-conformational-dynamics-membrane-proteins-situ-with-site

Research

JoVE Journal

Biology

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

14.5K Aufrufe.  Worcester Polytechnic Institute. Wir beschreiben eine Methode, die die Kinetik von Ionen-Transport von Membranproteinen Maßnahmen neben site-spezifische Analyse von Konformationsänderungen mittels Fluoreszenz an einzelnen Zellen. Diese Technik ist anpassungsfähig an Ionenkanälen, Transportern und Ionenpumpen und kann genutzt werden, um Einschränkungen bei den Protein-Untereinheiten zu bestimmen.