<ol>
	<li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon:+Dynamic+Characteristic.">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li><li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+voltage+clamp+to+record+small,+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li><li>Dempski, R. 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E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Measurements+of+Intermolecular+Distances+between+the+&#945;-+and+&#946;-Subunits+of+the+Na+/K+-ATPase.">Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the &#945;- and &#946;-Subunits of the Na+/K+-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).</li><li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na+,K+-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li><li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Na+/K+-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li><li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties.">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li><li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K++Channel+Complexes.">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li><li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein.">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li><li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+movement+by+the+Na/K+pump+in+Xenopus+oocytes.">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li><li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation.">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K++channel.">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li><li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li><li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlasMapper:+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps.">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A abordagem experimental que descrevemos combina site-specific rotulagem fluoróforo e duas de tensão eletrodo grampo para investigar a relação entre estrutura e função de proteínas da membrana. Esta técnica pode ser usada para obter tempo resolvido informações sobre a dinâmica conformacional de proteínas da membrana durante o transporte de íons. Além disso, esta abordagem pode ser adaptada para trabalhar com várias proteínas, tais como bombas de íons, canais iônicos e transportadores. Além de investigar a dinâmica de conformação de um resíduo específico, também é possível utilizar a transferência de energia de ressonância de fluorescência para determinar restrições de distância dentro de uma holoenzima. A determinação de distâncias entre os resíduos, bem como medir o movimento relativo entre subunidades pode ajudar a resolver questões fundamentais que envolvem mecanismos de propagação.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente / Equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Reagente / Equipamentos </th><th> Companhia </th></tr><tr><td> Fonte de Luz 100W Tungsten </td><td> Carl Zeiss microfilmagem </td><td> fluoresceína-5-maleimida </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 1B150F-4 </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> Alto-Pure Kit de Extração PCR </td><td> Roche </td></tr><tr><td> 3,0-4,0 Ethicon Vicryl </td><td> Johnson &amp; Johnson </td><td> mMessage mMachine Kit </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> 475AF40 filtro de excitação </td><td> Omega Optical </td><td> MS-222 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> 505DRLP dichroic espelho </td><td> Omega Optical </td><td> Nucleospin Kit Plasmid </td><td> Macherey-Nagel </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel </td><td> Omega Optical </td><td> Nanodrop 2000c Sprectrophotometer </td><td> Thermo Scientific </td></tr><tr><td> 535DF50 filtro de excitação </td><td> Omega Optical </td><td> PC-10 Micropipeta Puller </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> 560DRLP dichroic espelho </td><td> Omega Optical </td><td> pCLAMP 10 Software </td><td> Axon Instruments </td></tr><tr><td> 565ALP filtro de emissão </td><td> Omega Optical </td><td> PfuTurbo DNA polimerase </td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLP filtro de emissão </td><td> Omega Optical </td><td> PIN-022A Photodiode </td><td> United Technologies Detector </td></tr><tr><td> 570DRLP dichroic espelho </td><td> Omega Optical </td><td> Filtros polarizados </td><td> Linos Phtonics Inc. </td></tr><tr><td> Linos Phtonics Inc. </td><td> Omega Optical </td><td> QuickChange Site-Directed Mutagenisis Kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Axio Examiner microscópio de fluorescência </td><td> Carl Zeiss microfilmagem GMBH </td><td> RC-10 Câmara de fluorescência </td><td> Warner Instruments </td></tr><tr><td> Warner Instruments </td><td> Life Technologies </td><td> tetrametilrodamina-6-maleimida </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Digidata 1440A sistema de aquisição de dados </td><td> Axon Instruments </td><td> TOP10 Células Electrocompetent </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Dpn I </td><td> New England Biolabs </td><td> Turbo amplificador Tec-05X </td><td> npi </td></tr></tbody></table>

examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling

Dois eletrodos de voltagem clamp eletrofisiologia (TEVC) é uma ferramenta poderosa para investigar o mecanismo de ion transportes1 para uma grande variedade de proteínas da membrana incluindo canais iônicos 2, bombas de íons 3, 4 e transportadores. Os desenvolvimentos recentes têm combinado site-specific rotulagem fluoróforo ao lado TEVC, em simultâneo, analisar a dinâmica conformacional em resíduos específicos e função dessas proteínas na superfície de células individuais. Vamos descrever um método para estudar a dinâmica conformacional de proteínas da membrana, simultaneamente, o monitoramento de mudanças de fluorescência e de tensão atual usando clamp-fluorometria. Esta abordagem pode ser usada para examinar o movimento molecular de proteínas da membrana do local especificamente substituição cisteína seguinte e-site dirigido fluoróforo rotulagem 5,6. Além disso, este método fornece uma abordagem para determinar restrições de distância entre os resíduos específicos 7,8. Isto é conseguido através seletivamente anexando fluoróforos doador e receptor de dois resíduos de cisteína mutantes de interesse. Em suma, essas experiências são realizadas conforme expressão funcional da proteína desejada na superfície dos oócitos Xenopus Leavis. A grande área de superfície desses oócitos permite medições fáceis funcional e um sinal robusto fluorescência 5. Também é possível facilmente alterar as condições extracelulares como ligante pH, ou cátions / ânions, que podem fornecer informações adicionais sobre o mecanismo de proteínas da membrana 4. Finalmente, os desenvolvimentos recentes têm também permitiu a manipulação de selecionar íons interna após a co-expressão com uma segunda proteína 9. Nosso protocolo é descrito em várias partes. Primeiro, mutagênese cisteína digitalização passou por rotulagem fluoróforo é concluída em resíduos localizados na interface dos domínios transmembrana e extracelular. Experimentos subseqüentes são projetados para identificar resíduos que demonstram grandes mudanças na intensidade de fluorescência (&lt;5%) 3 em cima de uma mudança conformacional da proteína. Em segundo lugar, estas mudanças na intensidade de fluorescência são comparados com os parâmetros cinéticos da proteína de membrana, a fim de correlacionar a dinâmica conformacional para a função da proteína 10. Isto permite uma análise rigorosa biofísicos do movimento molecular da proteína-alvo. Por último, dois resíduos da holoenzima podem ser rotulados com um dador e receptor fluoróforo a fim de determinar restrições de distância usando métodos photodestruction doador. Também é possível monitorar o movimento relativo das subunidades da proteína seguintes rotulagem com um doador e aceitador fluoróforo.

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Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Vamos descrever um método que mede a cinética de transporte de íons de proteínas da membrana juntamente com site-specific análise das mudanças conformacionais usando fluorescência em células individuais. Esta técnica é adaptável a canais iônicos, transportadores e bombas de íons e pode ser utilizado para determinar restrições de distância entre as subunidades da proteína.

Examinando o Dynamics Conformacional de Proteínas de Membrana In situ Com Labeling-Site dirigido Fluorescência

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

examining-conformational-dynamics-membrane-proteins-situ-with-site

Research

JoVE Journal

Biology

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

14.5K visualizações.  Worcester Polytechnic Institute. Vamos descrever um método que mede a cinética de transporte de íons de proteínas da membrana juntamente com site-specific análise das mudanças conformacionais usando fluorescência em células individuais. Esta técnica é adaptável a canais iônicos, transportadores e bombas de íons e pode ser utilizado para determinar restrições de distância entre as subunidades da proteína.