Los autores desean agradecer a Zoiray Technologies Inc., un socio co-patrocinador y la comercialización, por su apoyo.

1. Preparación del soporte <ol><li> Escudo de capas de silicio SiO2 sustratos con auto-adsorción copoli (DMA-NAS-MAPS): <ol><li> La síntesis de copolímero, estructura química, y el proceso de recubrimiento se publican en: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Caracterización de un recubrimiento polimérico adsorbida para las diapositivas de cristal de ADN Microarray. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358. </li><li> En pocas palabras, preparar una solución de polímero mediante la adición de 100 mg de polímero a 5 ml de agua desionizada (DI) y añadir 5 ml de sulfato de amonio 40% de grasa saturada ((NH 4) 2SO 4) solución para llegar a una concentración final de 0,92 M. </li><li> Chips de sumergirse en la solución durante 30 minutos en un agitador y luego enjuague bien con agua destilada. Secar bien con argón / N 2 gas. </li><li> Chips de hornear a 80 º C durante 15 min. </li></ol></li><li> Tienda recubiertos con polímeros sustratos / chips en un ambiente seco (desecador de vacío) para un máximo de 3 meses hasta que la sonda manchado procedimiento. </li></ol> 2. Preparación de la matriz de la sonda: anticuerpos, antígenos, ss / dsDNA, RNA, etc <ol><li> Diluir la sonda (s) a la concentración adecuada en el buffer deseado. Este paso puede variar considerablemente, pero un experimento típico utiliza antígeno o de IgG en una concentración de 0,5 mg / ml (rango de 0.1-1 mg / ml) en tampón fosfato salino (PBS) a pH ≈ 7,4. </li><li> Soluciones a cabo en un 96 - o 384 y placa (o la placa de la fuente estándar para el observador que se utiliza) </li><li> Configuración de los parámetros de localización para la matriz de impresión deseada: determinar los parámetros apropiados para la detección de la superficie y las soluciones que se utilizan (tiempos de espera, las velocidades de aproximación, etc.) Determinar el número de réplicas de cada condición por la red, el diseño de cuadrícula, el número de redes de replicar, y la ubicación que desee detectar en el chip. Sustratos lugar y la placa de la fuente en los lugares apropiados, compruebe que las botellas de residuos y el suministro está listo, y comenzar a ejecutar la impresión. </li><li> Después de ver terminado sustratos a cabo en un ambiente de alta humedad durante la noche (18.04 horas) para permitir que el proceso de inmovilización y la desactivación de proceder. </li><li> Lavado de sustratos: colocarlos en las siguientes soluciones para tres minutos para tres lavados por separado: PBS con 0,1% de Tween (PBST), PBS, y finalmente el agua desionizada (DI). Dependiendo del tipo de experimento (húmedo vs seco), seca el chip completamente con gas Argón y comenzar la incubación o el lugar en el chip de una cámara de flujo y de montar. </li><li> Desactivar restantes grupos NHS en la superficie de copolímero al sumergir las fichas en una solución 50 mM de etanolamina con el pH ajustado a 7,4 durante 30 minutos mientras que en un agitador de placas. Una amina primaria compuesto que contiene como hidroxilamina o Tris también se puede utilizar, siempre la solución preparada es seguro de usar con las proteínas. Enjuague bien la solución de desactivación con PBS entonces el agua DI. </li><li> Paso opcional (dependiendo de la química de la superficie que se emplea): superficie del bloque con una solución de BSA, la caseína o leche rehidratada por 30 minutos. Para la química de la superficie actual de polímeros que utilizamos, no realice este paso como el esqueleto del polímero actúa para evitar la unión no específica de proteínas. </li></ol> 3. Adquisición de Datos e Incubación de procedimiento: formato de punto final <ol><li> Prepare una solución de la meta de interés en el buffer deseado. En este caso, será una solución de la concentración adecuada de anti-BSA en PBS (por ejemplo: hacer 1-10 ml de un 10 ng / ml de solución de anti-BSA en PBS). Además, asegúrese de disponer de una cantidad equivalente de tampón (sin objetivo) para la incubación de control negativo. </li><li> Disfrutar de un escaneo espejo de silicio para la normalización de todos los datos recogidos posteriormente. </li><li> Busque en la serie de la sonda preparada con el sistema IRIS antes de la etapa de incubación para determinar la altura inicial de óptica (masa) en cada punto. Esto permitirá un análisis adecuado de los cambios en la masa en la superficie, es decir, el nivel de unión, después de la incubación. Aquí, algunos parámetros se ajustan para el experimento actual, tales como el tiempo de exposición, el campo de visión, centrándose prosperando, etc </li><li> Sumerja chip (s) de solución preparada para 1 hora en un agitador de placas. El tiempo de incubación puede variar considerablemente en función del nivel de agitación, la concentración de la meta de ser detectado, las características del transporte de la cámara de flujo (si es un modo de detección en tiempo real se está utilizando), las afinidades de la pareja de objetivos de la sonda, etc . </li><li> Después de la incubación, repita el procedimiento de lavado descrito en el paso 2.5) </li><li> Exploración de la matriz misma sonda con el sistema IRIS y obtener imágenes post-incubación para la comparación de pre-incubación. </li><li> Repita este proceso para diferentes etapas de incubación, si es necesario, por ejemplo, en un formato de ensayo de tipo sándwich donde se utiliza un anticuerpo secundario. </li></ol> 4. Análisis de Datos <ol><li> Ajustar las imágenes recogidas para cada escaneo del iris (la secuencia de imágenes de intensidad), utilizando el software de laboratorio desarrollado para proproducir una imagen de la matriz que contiene la información de la sonda espesor óptico. Un rápido análisis cualitativo de la unión puede realizarse restando (registrada) post-y pre-incubación de las imágenes. Vinculante aparecerá como un cambio en la intensidad en esos puntos donde los cambios se observaron en masa. Para el análisis cuantitativo, determinar la densidad de la masa de cada punto en comparación con el fondo de un promedio de espesor óptico de la información para cada píxel en un lugar y un anillo exterior de la mancha y hacer una comparación directa de estas dos áreas. </li></ol> 5. Los resultados representativos: La figura 1 muestra un esquema ejemplo de la capa de Si-SiO 2 sustrato IRIS visto con una amplia representación de anticuerpos. Cada conjunto de anticuerpos se detecta en replicar con la especificidad de un epítopo diferente orientación proteínas diferentes. Dos virus diferentes y toda una proteína viral se presentan como objetivos de ejemplo. Anticuerpos negativos de control dependen de la prueba y pueden ser no específicos y / o específicas de virus. La figura 2 muestra la unión de la albúmina sérica humana (HSA) de anticuerpos específicos para una serie de manchas HSA y el conejo puntos IgG (control). Como se ve aquí, después del montaje y la determinación del espesor óptico de las imágenes pre y post incubación, una imagen de diferencia de la matriz de unión se pueden crear para evaluar cualitativamente vinculante. El análisis cuantitativo revela que un 2,05 y 0,13 nanómetros significa cambiar la altura de óptica se observó para la HSA y los puntos de IgG de conejo, respectivamente, para una concentración de incubación anti-HSA de 500 ng / mL. La Figura 3 muestra una medición de la dependencia IRIS piel de unión a proteínas en la concentración de proteínas y la longitud de ADN de doble cadena de oligómeros. El gráfico superior muestra las mediciones de altura absoluta óptica para inicial inmovilizado alturas oligómero de la sonda y post-incubación, encuadernación de piel. Aumento de las concentraciones de la piel (50, 100, 200 nM) dio lugar a un aumento de unión a las sondas de ADN. La longitud de los oligómeros también afecta unión con secuencias más largas de piel que resulta en un carácter más vinculante. En este caso, las barras de error representan una desviación estándar de la media. La trama parte inferior muestra dímero calcula proteína piel de enlace por cadena ADN de doble cadena. Dímero vinculante, fue significativamente superior a la concentración de proteínas de piel de 200 Nm que sugiere un alto nivel de la unión no específica. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Esquema de una matriz sonda ejemplo normalmente utilizado en un experimento para detectar virus específicos y componentes virales en forma multiplexada con el sistema IRIS. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Post-incubación imagen de diferencia para la unión de la albúmina sérica humana de anticuerpos específicos para HSA visto recogidos con este sistema sin etiqueta en una concentración de 500 ng / mL. La densidad de masa biomaterial para cada punto se determina por un promedio de espesor óptico de la información en un lugar y luego compararlo con el promedio de un anillo alrededor de la mancha que representa el fondo. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Parcela de enlace de datos para las interacciones proteína piel con manchas de doble cadena oligómeros con una secuencia de consenso conocidos basados ​​en la duración de oligómeros, la ubicación de la secuencia de consenso dentro del oligómero, y la concentración de la proteína Fur. Información acerca de la cantidad absoluta de la proteína de piel atado a cada secuencia visto (arriba) se puede utilizar para estimar el número de dímeros de piel atado a cada tipo de oligómero (abajo).

<ol>
	<li>&#214;zkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+and+dynamic+detection+of+biomolecular+interactions+for+high-throughput+microarray+applications.">Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).</li><li>&#214;zkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microarray+imaging+for+direct+detection+of+DNA+hybridization+and+single-nucleotide+mismatches.">Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).</li><li>&#214;zkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+reflectance+imaging+for+a+multiplexed,+high-throughput,+label-free,+and+dynamic+biosensing+platform.">Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).</li><li>Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., &#214;zkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+multiplexed+virus+detection+using+spectral+reflectance+imaging.">Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. , (2011).</li></ol>

La plataforma IRIS es un sistema rápido y sencillo de utilizar para la recogida de alto rendimiento del enlace de datos en un formato de microarrays. Al inmovilizar covalentemente diferentes sondas de ADN o la proteína funcional en una superficie, los antígenos diana / biomarcadores / etc. puede ser capturado de la solución, como en un inmunoensayo. La medición de estas interacciones a través de las condiciones de la sonda en un extremo o el formato en tiempo real con el sistema IRIS permite que la información altamente sensible y cuantitativo que deben recopilarse para cada interacción. El experimento representativo detallada aquí es sólo un ejemplo de los tipos de interacciones que pueden ser estudiados con esta técnica. La detección de factores de transcripción, los antígenos virales y virus completos se ha demostrado previamente, y representa sólo algunos ejemplos de los tipos de análisis que el IRIS puede manejar fácilmente.

<ol><li> Obleas de silicio con 500 nm de dióxido de silicio crecido térmicamente, Silicon Valley Microelectrónica, la orden de encargo <li> Polvo de sulfato de amonio, Sigma-Aldrich cat. # A5132 <li> Tampón fosfato salino (PBS) se concentran 10 veces más listo, Fisher gato científico. # BP665-1 <li> De anticuerpos a la albúmina sérica humana (Anti-HSA), Sigma-Aldrich cat. # A0433 <li> Albúmina sérica humana (HSA), Sigma-Aldrich cat. # A9511 <li> Argón o nitrógeno gas (ultra alta pureza), el gato Airgas. # AR UHP300 o # NI UHP300 <li> Placas de Petri de 60 mm x 15 mm, gato Fisher Scientific. # 0875713A <li> Scienceware ® desecador de vacío, Sigma-Aldrich cat. # Z119016 <li> Tubos de microcentrífuga, Fisher gato científico. # 05-408-120 <li> Placas de 96 pozos, baja unión a la célula, Nalgene Nunc International Cat. # 145399 <li> BioOdyssey calígrafo MiniArrayer, Bio-Rad <li> Tween-20, Sigma-Aldrich # P1379 <li> Etanolamina, Sigma-Aldrich # 398136 <li> Hidroxilamina, Thermo gato científico. # 26103 <li> De usos múltiples de los rotadores, Thermo Scientific (Barnstead International), el modelo # 2314, cat. # 2314Q <li> Retiga 2000R cámara, gato QImaging. # 01-RET-2000R-FM-12 <li> Fuente de iluminación AcuLED, PerkinElmer, la orden de encargo <li> Los componentes ópticos (lentes, objetivos, aberturas, rieles, postes, etc), Thorlabs </ol>

biomolecular detection employing the interferometric reflectance imaging sensor (iris)

La medición sensible de interacciones biomoleculares tiene su uso en muchos campos y las industrias básicas como la biología y la microbiología, la vigilancia del medio ambiente / agrícola / biodefensa, la nanobiotecnología, y mucho más. Para aplicaciones de diagnóstico, la vigilancia (detección) la presencia, ausencia, o la expresión anormal de biomarcadores proteómicos humanos o dirigidos genómico en las muestras del paciente se puede utilizar para determinar los métodos de tratamiento o eficacia de la terapia. En el campo de la investigación, la información sobre las afinidades moleculares y las características específicas son útiles para caracterizar completamente el sistema bajo investigación. Muchos de los sistemas actuales utilizados para determinar las concentraciones moleculares o las afinidades se basan en el uso de etiquetas. Ejemplos de estos sistemas incluyen inmunoensayos, como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los ensayos de electroforesis en gel y espectrometría de masas (MS). Por lo general, estas etiquetas son fluorescentes, radiológicos o colorimétrica en la naturaleza y están directa o indirectamente conectado a la diana molecular de interés. Aunque el uso de etiquetas es ampliamente aceptado y tiene algunas ventajas, también hay desventajas que están estimulando el desarrollo de nuevas etiquetas sin métodos de medición de estas interacciones. Estas desventajas incluyen aspectos prácticos tales como el costo del ensayo mayor, el reactivo de la vida útil y facilidad de uso se refiere, el almacenamiento y la seguridad, la pérdida de tiempo y esfuerzo en el etiquetado, y la variabilidad entre los distintos reactivos, debido a los procesos de etiquetado o de las etiquetas de sí mismos. Sobre una base de investigación científica, el uso de estas etiquetas también pueden introducir dificultades en lo que respecta a los efectos sobre la funcionalidad de la proteína / estructura debido a la presencia de las etiquetas adheridas y la imposibilidad de medir directamente la interacción en tiempo real. Que aquí se presenta es el uso de una nueva etiqueta sin biosensor óptico que puede ser objeto de estudios de microarrays, denominado sensor de reflectancia de imágenes interferométricas (IRIS), para la detección de proteínas, ADN, material antigénico, patógenos enteros (viriones) y otros materiales biológicos. El sistema IRIS se ha demostrado que tienen una alta sensibilidad, precisión y reproducibilidad de las interacciones biomoleculares diferentes [1-3]. Los beneficios incluyen la capacidad múltiple de imágenes en tiempo real y capacidades de punto final de medición, y otras de alto rendimiento de atributos tales como el consumo de reactivos reducida y una reducción en los tiempos de ensayo. Además, la plataforma IRIS es fácil de usar, requiere un equipo de bajo costo, y utiliza componentes basados ​​en silicio sólido ensayo de fase por lo que es compatible con muchos enfoques contemporáneos de la superficie de la química. A continuación, presentamos el uso del sistema IRIS, desde la preparación de las matrices de la sonda de la incubación y la medición del objetivo vinculante para el análisis de los resultados en un formato de punto final. El modelo de sistema será la captura de anticuerpos de destino que son específicos para la albúmina sérica humana (HSA) en la HSA con manchas sustratos.

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Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Cuantitativo, de alto rendimiento, en tiempo real, y sin etiquetas de detección biomolecular (ADN, proteínas, etc) sobre SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Superficies se puede lograr utilizando una técnica sencilla de interferometría, que se basa en la iluminación LED, un mínimo de componentes ópticos, y una cámara. El sensor de reflectancia de imágenes interferométricas (IRIS) es barato, fácil de usar, y es susceptible a los microarrays de formatos.

Biomoleculares de detección utilizando el sensor de reflectancia de imágenes interferométricas (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

biomolecular-detection-employing-interferometric-reflectance-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

14.5K vistas.  Boston University. Cuantitativo, de alto rendimiento, en tiempo real, y sin etiquetas de detección biomolecular (ADN, proteínas, etc) sobre SiO 2 Superficies se puede lograr utilizando una técnica sencilla de interferometría, que se basa en la iluminación LED, un mínimo de componentes ópticos, y una cámara. El sensor de reflectancia de imágenes interferométricas (IRIS) es barato, fácil de usar, y es susceptible a los microarrays de formatos.

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Investigación

Bioingeniería

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Hollow Microneedle basado en sensores para la detección electroquímica multiplexado transdérmica

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrana Fabrication por la bicapa lipídica (SALB) Método-Solvente asistida

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Design and Fabrication of an Elastomeric Unit for Soft Modular Robots in Minimally Invasive Surgery

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in unstructured environments. At the same time, new procedures and techniques have been developed to reduce the invasiveness of surgical operations. Minimally Invasive Surgery (MIS) has been successfully employed for abdominal interventions, however standard MIS procedures are mainly based on rigid or semi-rigid tools that limit the dexterity of the clinician. This paper presents a soft and high dexterous manipulator for MIS. The manipulator was inspired by the biological capabilities of the octopus arm, and is designed with a modular approach. Each module presents the same functional characteristics, thus achieving high dexterity and versatility when more modules are integrated. The paper details the design, fabrication process and the materials necessary for the development of a single unit, which is fabricated by casting silicone inside specific molds. The result consists in an elastomeric cylinder including three flexible pneumatic actuators that enable elongation and omni-directional bending of the unit. An external braided sheath improves the motion of the module. In the center of each module a granular jamming-based mechanism varies the stiffness of the structure during the tasks. Tests demonstrate that the module is able to bend up to 120&#176; and to elongate up to 66% of the initial length. The module generates a maximum force of 47 N, and its stiffness can increase up to 36%.

This paper describes the design and fabrication of a soft unit for surgical manipulators. The base module includes three flexible fluidic actuators to achieve omnidirectional bending and elongation, and a granular jamming-based mechanism to enable stiffness control. A complete mechanical characterization is also reported.

Diseño y fabricación de una Unidad de elastómero de suaves modulares Robots en Cirugía Mínimamente Invasiva

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Síntesis microondas impulsada de nanopartículas de óxido de hierro para la detección rápida de la aterosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

El uso de un análisis de biosensores conductimétricos β-lactamase-base para detectar las interacciones biomoleculares

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab and industrial scale. However, due to its toxicity and flammability, there is a desire to avoid methanol while maintaining the high productivity of P. pastoris. Small scale bioreactor cultivations (0.5-5 L working volume) are commonly used to evaluate a strain and its protein production characteristics since microscale cultivation in deep well plates can be hardly controlled or relies on expensive equipment. Furthermore, traditional protocols for the cultivation and induction of P. pastoris were established for constitutive expression or methanol induction and so far, no reliable protocols were described to screen P. pastoris expression strains with derepressible promoters in (controlled and monitored) parallel cultivations. To simplify such initial cultivations to characterize and compare new protein production strains, we established a simple shake flask cultivation system for methanol free expression that simulates bioreactor conditions including a constant slow glycerol feed and online monitoring, thereby coming closer to the real conditions in bioreactors compared to mostly applied small scale batch cultivations. To drive recombinant protein expression in P. pastoris, the carbon source repressed promoters PDC and PDF were applied. Polymer discs with embedded carbon source, releasing a constant amount of glycerol, assured a feed rate delivering the necessary energy for maintaining the promoters active while keeping the biomass generation low.

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

This method for the first time describes reliable experimental procedures for efficient inducible methanol-free recombinant protein production in Pichia pastoris (Komagataella phaffii), employing the carbon source regulated promoters PDCand PDF in small scale experiments while cultivation parameters can be monitored online, and a constant glycerol feed is applied.

Expresión independiente de metanol por Pichia Pastoris empleando tecnologías de la represión

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many cell functions and behaviors. To calibrate and image integrin tension with high force sensitivity and spatial resolution, we developed an integrative tension sensor (ITS), a DNA-based fluorescent tension sensor. The ITS is activated to fluoresce if sustaining a molecular tension, thus converting force to fluorescent signal at the molecular level. The tension threshold for ITS activation is tunable in the range of 10&#8211;60 pN that well covers the dynamic range of integrin tension in cells. On a substrate grafted with an ITS, the integrin tension of adherent cells is visualized by fluorescence and imaged at submicron resolution. The ITS is also compatible with cell structural imaging in both live cells and fixed cells. The ITS has been successfully applied to the study of platelet contraction and cell migration. This paper details the procedure for the synthesis and application of the ITS in the study of integrin-transmitted cellular force.

Integrin tension plays important roles in various cell functions. With an integrative tension sensor, integrin tension is calibrated with picoNewton (pN) sensitivity and imaged at submicron resolution.

Proyección de imagen integrina tensión y fuerza celular en la resolución del Submicron con un Sensor de tensión integradora

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

Evaluación de comportamientos fotosintéticos mediante mediciones simultáneas de la reflectancia de la hoja y análisis de fluorescencia de clorofila

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...