Este método puede ayudar en la preselección de clones de cromosomas por cepas Pichia pastoris que expresan proteínas recombinantes en condiciones de desprimida por un simple cultivo de matraz de batido antes de la escala. La principal ventaja de esta técnica es que la expresión de proteína libre de metanol de alto nivel se puede lograr utilizando Pichia pastoris, que se apoya en el monitoreo en línea exacto de parámetros de cultivo importantes. Generalmente, los individuos nuevos en este método pueden tener problemas porque el punto de tiempo para iniciar el alimento de crecimiento de vidrio tiene que adaptarse a las características de crecimiento de la cepa de producción específica.
Antes de establecer el cultivo principal, sembrar una sola colonia fresca de la cepa de expresión de interés en 5 ml de pepto de levadura y caldo de dextrosa en un tubo cónico de 50 ml. Deje la tapa ligeramente abierta para permitir una aireación adecuada. Que, colocar el cultivo en una coctelera a 28 grados centígrados, 80% de humedad y 100 a 130 RPM durante la noche.
A la mañana siguiente, inicie el software para conectar los dispositivos a través de Bluetooth. A continuación, pulse el botón plata en la parte frontal del dispositivo de medición de biomasa para activar la conexión Bluetooth al dispositivo y haga clic en Buscar dispositivos en el software de monitoreo de computadora. Arrastre y suelte los dispositivos encontrados a los cuadrados de la bandeja de medición y haga clic en Conectar.
Cuando se realiza una conexión correcta, aparecerá una pantalla de control. Para configurar un experimento, haga clic en Iniciar medición. Asigne un nombre al experimento y compruebe si están habilitados todos los parámetros necesarios para la supervisión.
Establezca el intervalo en tres minutos y los puntos de medición promedio en 11. Introduzca los nombres de las muestras y omita la calibración del ángulo. Mida la densidad celular del cultivo nocturno diluido en una proporción de uno a veinte en el medio de cultivo en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nanómetros.
Inocular 50 ml del medio con el cultivo nocturno a una D.O. 600 de 05. Que, coloque los matraces en los detectores a 28 grados celsius, 130 RPM y 80% de humedad durante cinco minutos. Haga clic en Iniciar medición en el software.
Cuatro horas después de la inoculación, utilice una muestra de 2 ml para la medición de la densidad celular como acaba de demostrar. Cuando la concentración de oxígeno se acerca a cero y las células están en la fase de crecimiento exponencial añadir cuatro discos de alimentación de glicerol a cada matraz en condiciones estériles. Que, devolver los frascos a la incubadora de agitación durante 60 a 90 horas adicionales.
Tome muestras cada 24 horas para monitorear la densidad celular y la expresión de proteínas mediante el ensayo de elección. Al final del cultivo, transferir los cultivos a 50 ml tubos cónicos para la centrifugación. Exporte los datos de medición en línea como un archivo de hoja de cálculo desde el software para su posterior análisis.
En este cultivo representativo, la concentración inicial de glicerol fue del 5%Aunque los discos de alimentación se añadieron cuando la biomasa estaba aumentando exponencialmente, el oxígeno disminuyó a casi cero. Las concentraciones más bajas de glicerol redujeron el efecto de las limitaciones de oxígeno a corto plazo y, por lo tanto, se recomiendan para la expresión de proteínas descoprimidas. En este experimento representativo en el que la hormona de crecimiento humano se expresó bajo el control de una fuente de carbono reprimida promotor sobre el agotamiento del glicerol la expresión de proteína por la de-represión se aseguró mediante la adición de cuatro discos de alimentación por matraz.
Como se esperaba, la expresión de la hormona de crecimiento humano y el desarrollo de la biomasa aumentaron con el tiempo en presencia de los discos de alimentación de glicerol, mientras que la expresión de la proteína disminuyó con el tiempo y la biomasa se mantuvo constante en ausencia del suplemento de glicerol. Al intentar este procedimiento, es importante recordar observar cuidadosamente los parámetros de cultivo para determinar una hora de inicio óptima de la expresión. Siguiendo este procedimiento se pueden realizar otros métodos como el análisis de manchas occidentales de determinación de proteínas o ensayos de actividad para la evaluación del rendimiento proteico, así como experimentos de biorreactor a pequeña escala para responder preguntas adicionales sobre el rendimiento de la cepa individual a mayor escala.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la expresión de proteína recombinante libre de metanol exploraran una alternativa prometedora al promotor AOX1 dependiente del metanol de uso común en Pichia pastoris.
