Los autores desean agradecer a las fuentes de financiación: Ejército-UNL Centro de Mecánica de Trauma (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr. Chandra nama), Premio Layman UNL (26-1110-0033 -001 , PI: Lim).

1. Cultivo de células neuronales <ol><li> Las células del cerebro, incluyendo las células neuronales, los astrocitos, y sus compañeros de la cultura-puede ser utilizado como un modelo de celular. Como una demostración de viabilidad, la presurización impulsivo de la línea celular las células neuronales se presenta. </li><li> SH-SY5Y células de neuroblastoma humano (ATCC CRL-2266) se cultivaron en cubreobjetos de vidrio 18 mm de diámetro. Las células se sembraron a una densidad de 3 × 10 3 células / cm 2 a través de los medios de cultivo compuesto por DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10% y el 1% de penicilina-estreptomicina. Diapositivas de células cultivadas de vidrio se mantienen en un 5% de CO 2 humidificado incubadora a 37 ° C. </li><li> Para obtener la diferenciación de las células neuronales de la SH-SY5Y células, las células se tratan con los medios de comunicación más suplementado con 10 mM de ácido retinoico (RA) durante 7 días con los medios de comunicación cambian cada dos días. El día 7, las células están listos para ser presurizada. </li></ol> 2. Equipos de presurización: Kolsky Bar <ol><li> La barra de Kolsky, desarrollado por Kolsky 1 en 1949, se ha utilizado para medir las propiedades mecánicas de un material a una velocidad de carga muy alta. El aparato consiste en dos barras con una muestra de puesta en contacto entre las barras. Una onda de tensión, creado en la barra incidente, se propaga a la muestra, donde la ola se divide en una onda reflejada y transmitida. El estrés en la muestra es proporcional a la onda transmitida. En este estudio, utilizamos una cámara de presurización de células que se coloca entre las dos barras de la Kolsky set-up. </li><li> Las dos barras de aleación de aluminio (de largo cada uno de 6 m) están suspendidos por cojinetes de bronce alineados, y uno en la cámara de presurización de células in vitro se encuentra entre las barras. La barra de arriba es la barra incidente con una masa de 130 libras sujeta en un extremo. Una abrazadera de la fricción se coloca en una posición que le dará la duración del pulso deseado. Al participar de la abrazadera y el endurecimiento de un gato tijera entre la masa y un soporte de carga, la sección de pinza de masa de la barra incidente es pre-comprimido al nivel deseado. Obligar a un tornillo con muescas que bloquea la pinza a una ruptura repentina con un sistema hidráulico libera la compresión pre-almacenar rápidamente y por lo tanto genera un pulso de presión. Esta se propaga a través de la barra incidente, impulsa el pistón cámara de prueba, y presuriza el líquido y células dentro de la cámara de forma impulsiva. La presurización de la cámara a su vez inicia un pulso de presión que se propaga en el bar de abajo de transmisión. Las tensiones asociadas con los pulsos de presión en las barras se miden con indicadores compuestos de alta resistencia a la deformación emocionados de 45 voltios. Las señales de calibre se registran con un osciloscopio digital con una frecuencia de 1 MHz como una historia de carga. </li><li> En la cámara de presurización de células in vitro se compone de un cilindro-pistón. El cilindro cuenta con 2,6 cm de diámetro interior y 3,8 cm de diámetro exterior, y tiene un pequeño agujero roscado en la base de la cavidad. El orificio sirve como un aire y la salida el exceso de líquido durante la instalación de células de la muestra. El pistón es de 7,5 cm de largo y está hecha de la materia misma barra. El pistón se envuelve con dos o tres capas de (teflón) cinta de plomero que sirven como sello de baja fricción. La tapa es de 32 mm de largo y tiene dos pequeños tornillos de acero inoxidable que aseguran el cubreobjetos de vidrio (en el que las células son cultivadas) durante la carga. </li></ol> 3. La presurización impulsivo de las células neuronales <ol><li> Todas las partes de la cámara de presurización se esterilizan utilizando el autoclave y se mantienen bajo la luz ultravioleta. El montaje de la cámara se lleva a cabo dentro de la campana de cultivo celular. El tornillo de purga en la cámara es ligeramente involucrados en la toma de aire en la base de la cavidad. Pre-caliente (37 ° C) medio fresco de crecimiento es una pipeta en la cámara sin hacer burbujas. Entonces, un portaobjetos de vidrio cultivo celular se recoge, y se coloca en la tapa del pistón (las células que enfrentan fuera). La celebración de pequeños tornillos se aprietan hacia abajo en la diapositiva para mantenerlo en su lugar. El pistón con una lámina de vidrio cultivo celular se introduce un poco en la cavidad de la cámara y el montaje se inclina con el respiradero está en el punto más alto. El tornillo de purga se elimina y el émbolo se empuja en la primera cavidad forzar las burbujas de aire, el exceso de líquido. Una referencia de marca o de una plantilla se utiliza como una guía para asegurar la misma cultura volumen de los medios para cada prueba. La dimensión axial de los medios de comunicación en la cámara es de unos 6 mm. Desinfectar el tornillo de purga y reemplazarlo para que el agua cámara hermética. La cámara no debería filtrarse bajo esta carga estática, si lo hace, la envoltura de teflón debe ser sustituida o reforzada. </li><li> En este punto, el sistema de barras Kolsky se restablece. La gran masa se mueve hacia atrás a la posición original y un perno de bloqueo nueva reemplaza a la usada (rota) una. Participar el perno de cierre nuevo con el sistema hidráulico de alrededor de 200 psi. Use el gato tijera para comprimir la sección de pre-carga de la barra incidente hasta un poco de presión más alta que el valor deseado, y luego otra vez que fuera a participar de la fricción total deltornillo de gato. La adquisición de datos está ahora armado. </li><li> La cámara de presurización celular ensamblado se instala en el sistema. Se coloca en un bloque V con el apoyo de pequeño gato tijera de laboratorio y en línea con las dos barras. Grasa cada interfaz con una capa de grasa de la luz y frote la superficie de embestir juntos para eliminar los vacíos de aire en el medio. </li><li> La prueba está listo para proceder. El tornillo de bloqueo del cabezal se ve obligado a romper rápidamente el bombeo por el conductor pinza hidráulica. La pinza se separarán y la adquisición de datos debe mostrar los resultados. La historia de presurización celular se determina a partir de las mediciones del indicador de barra de transmisión. Si la barra de transmisión utilizado es el tiempo suficiente, esto sólo debería ser a partir de la primera perturbación al punto en que las mediciones muestran una presión negativa. La duración del pulso transmitido puede ser inferior a la del pulso incidente si una burbuja se encuentra atrapada. La magnitud no puede llegar a que el pulso incidente, pero debería haber una meseta bastante largo antes de la descarga. De lo contrario, ya sea una gran burbuja de aire en la cámara sellada o un desajuste entre la asamblea y un bar podría haber ocurrido. </li><li> La cámara de presurización de células se retira y desmontar el interior de la campana de cultivos celulares. El tornillo de purga se elimina y el pistón se desprendió de la cámara. La lámina de vidrio cultivo celular se toma del extremo del pistón. </li></ol> 4. Evaluar el comportamiento celular a presión <ol><li> Después de la presurización, las células pueden ser inspeccionados inmediatamente o se incubaron para su posterior examen. Con una adecuada operación de los procesos de asepsia, a largo plazo después de la incubación es posible. </li><li> Las células a presión puede ser examinada por todas las técnicas de biología molecular y celular. Específicamente para la presurización de las células neuronales, para investigar la fisiología celular y molecular de las condiciones de TBI, los ensayos de evaluación de la presión inducida por los cambios en el crecimiento de las neuritas, cambiar los microtúbulos del citoesqueleto, la expresión génica neuronal, apoptosis, etc, se puede realizar. Como muestras de control de células, las células que se cultivan los mismos, mantienen en el interior de la cámara de presurización para el mismo período de tiempo, pero no a presión se utilizan (llamado así, el control de la cámara). </li><li> Para evaluar los cambios en el crecimiento de las neuritas, las células de control de presión y la cámara se examinan con el microscopio óptico inmediatamente después de la presurización y 1 y 24 horas de post-incubación. Un ejemplo de las imágenes de las células neuronales se muestran en la sección &quot;Resultados Representante&quot; (Figura 2). El cambio de longitud neurite se puede cuantificar mediante tinción de actina de inmunofluorescencia y análisis de imágenes. Las células se fijan con una solución de paraformaldehído al 4% w / v, se aclara con un 0,05% v / v de Tween-20 tampón de lavado, y permeabilized con un 0,1% v / v Triton X-100 solución. Después de bloquear con una solución al 1% w / v de albúmina sérica bovina, las células se incubaron con isotiocianato tetrametilrodamina (TRITC)-conjugado phalloidin. Imágenes de inmunofluorescencia de las células son tomadas con un microscopio de fluorescencia y las longitudes de los axones de las células a presión y el control se cuantificó mediante el software ImageJ (NIH). </li><li> Las neuritas pueden ser identificados como los axones o dendritas. Para evaluar los cambios morfológicos en los axones o dendritas, los experimentos descritos anteriormente pueden ser repetidos por el uso de anticuerpos para detectar cada estructura, es decir, neurofilamentos (NF) de anticuerpos de los axones y la proteína asociada a los microtúbulos (MAP2) de anticuerpos de las dendritas. </li><li> Los microtúbulos son uno de los principales componentes del citoesqueleto de las neuronas, y el daño a los microtúbulos se ha utilizado como un marcador de lesión neuronal. 2 microtúbulos se puede visualizar immunofluorescently el uso del anticuerpo β-tubulina. Las células se fijan después de 0 y 24 horas de post-presurización, teñidas con anticuerpos β-tubulina, y observada por el microscopio de fluorescencia. </li><li> Para evaluar el efecto de la presurización impulsiva sobre la expresión genética neuronal y apoptosis, el ARN total se extrae de las células de presión y control. La expresión génica puede ser examinada mediante la realización de RT-PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR, similar a los protocolos publicados. 3 </li></ol> 5. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Un ejemplo de perfil de presión aplicado a las celdas dentro de la cámara de presurización. El aparato de barra Kolsky éxito genera nivel 2 MPa, para un pulso único de presurización tipo impulsivo, con una duración de alrededor de 0,7 ms. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Un ejemplo de la respuesta neuronal a la presurización impulsivo. SH-SY5Y células expuestas a la presurización impulsivo a 2 MPa muestran distintas neurita / axón ruptura en relación con las células de control de la cámara. 6. Dificultades y soluciones <ol><li> Cámara de sellado es uno de los principales obstáculos a superar. Es porund que los discos de ancho, con juntas tóricas tiene un problema de la especulación y el aumento de la fricción. Con el fin de eliminar los efectos de fricción, así como prevenir la especulación, un simple método de grabación de pistón con cinta de teflón fontanero se utiliza. Esto resuelve los problemas y produce el nivel deseado de presión y la duración. </li><li> Comportamiento a presión de las células neuronales, especialmente cuando se evalúa mecanismo secundario TBI o efectos a más largo plazo, deben ser examinados después de un largo post-tiempo de incubación. La cámara de la celda que contiene está expuesta a condiciones potencialmente no estéril mientras se mueve a la barra de Kolsky, presionar y mover de nuevo a la capilla de cultivo celular. Con la pre-esterilización de las piezas de cámara y un funcionamiento adecuado en el montaje / desmontaje de la diapositiva cultivo celular y la cámara interior de la campana de cultivo de células, a largo plazo después de la incubación es posible hasta varias semanas. </li><li> La reproducibilidad de los datos es un parámetro importante en el celular experimentos de estimulación mecánica. De nuestro dispositivo, la reproducibilidad de la respuesta de las células neuronales se determina cómo el perfil deseado de presurización impulsivo, en el nivel de presión y la duración, se obtuvo reiteradamente. Ya que registrar el perfil de presión obtenidos para cada uno de presurización, los datos de respuesta de las células del perfil de presión no deseados se pueden excluir manualmente después. </li><li> Los pasos de presurización todo, incluido el montaje de cámara, transferencia y montaje en la barra de Kolsky, presurización, traslado de regreso, y la cámara de desmontaje, en menos de 10 min. La diapositiva de células cultivadas siguiente se puede presurizar inmediatamente después de la presurización anterior. Por lo tanto, un número suficiente de ensayos de presurización se puede completar de manera eficiente. Nuestra puesta a punto utiliza 18 mm cubreobjetos de vidrio de diámetro. Uno de los experimentos de presurización no proporciona suficientes proteínas para inmunotransferencia debido al tamaño de sustrato (y también en parte porque algunas de las células a presión están muertos). Alrededor de tres experimentos de presurización repetidos proporcionar la cantidad de proteínas necesarias para inmunotransferencia. Una vez más, la reproducibilidad se comprueba cada vez con el perfil de presión. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading.">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li><li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity,+microtubule+disassembly,+and+axon+degeneration.">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li><li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics.">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury.">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li><li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explosive+blast+neurotrauma.">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li><li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+percussion+barotrauma+chamber:+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury.">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li><li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li><li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment.">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li><li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials.">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Muchas técnicas experimentales in vitro se hayan realizado para estudiar el daño de las células cerebrales en las condiciones de TBI. Estos incluyen la neurona / astrocito estiramiento, inducida por el flujo esfuerzo cortante, bajar de peso, laceración lápiz láser transección, litotricia, etc 4,5 Se ha asumido que la corta duración de sobrepresión es un factor dominante física para la LCT. Especialmente 6,7 , la onda expansiva de la explosión TBI tiene una duración de pulso de una orden de milisegundos. 4 Basado en esta hipótesis y la observación, la cámara de barómetro capaz de presurización transitorio ha sido desarrollado y utilizado para evaluar el comportamiento de las células cerebrales en condiciones de TBI. Por ejemplo, en el líquido de la cámara de percusión barotrauma un impulso de presión con 20-30 ms de duración larga y un pico de presión de hasta 0,5 MPa se utilizó para examinar el comportamiento humano de células gliales en la LCT. 6 Recientemente, VandeVord et al. 7 metal usado bola de cámara sorprendente barómetro para examinar el comportamiento celular de astrocitos en TBI pero la bola de metal en huelga produce pulsos de presión múltiple. En este estudio, hemos desarrollado un dispositivo de presurización de la célula nueva que genera un solo pulso de presurización de tipo impulsivo. El dispositivo fue desarrollado sobre la base de la barra de Kolsky puesta en marcha, que ha sido utilizada como un aparato de ensayo de materiales en la 8 y los estudios de otros. El 1,9 bar Kolsky la capacidad de ensayo de materiales en la tasa de carga muy alta se ha modificado para poder aplicar un solo pulso de sobrepresión tipo en las células cultivadas dentro de la cámara de presurización (Figura 1). Con éxito puede controlar la magnitud y la duración de la sobrepresión impulsivo. Como una respuesta de células representativas, hemos demostrado que la presión en MPa 2 SH-SY5Y células neuronales pantalla neuritas importante y la pérdida axonal en comparación con las células sin presión cámara de control. En conclusión, hemos desarrollado un novedoso aparato impulsivo presurización de células utilizando un dispositivo especialmente diseñado Kolsky bar y demostró su potencial uso en la investigación de la respuesta neuronal en condiciones de TBI. También tomamos nota de que esta técnica es muy versátil en el que cualquier tipo de células pueden estar expuestos a las presiones impulsivas en varios niveles y la duración. Por lo tanto, el dispositivo se puede utilizar para investigar el impulsivo presión inducida por el comportamiento mecanotransducción celular, no sólo por causar lesiones a las células, sino también para estimular las células de manera positiva en su función y determinar el destino.

<ul>
	<li>SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) human neuroblastoma cells</li>
	<li>18 mm diameter glass coverslips</li>
	<li>Cell culture media: DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin</li>
	<li>Retinoic acid (10 &mu;M) for inducing neurogenesis</li>
	<li>Kolsky bar impulsive pressurization device</li>
	<li>Piston-cylinder cell pressurization chamber</li>
	<li>Stainless steel screws for securing cell cultured coverslip on the piston</li>
	<li>Grease for interfaces between cell chamber and Kolsky bar</li>
	<li>General molecular biology supplies for assessing cell response to pressurization (fixative, antibody, fluorescent dye, PCR supplies, etc.)</li>
</ul>

impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study

Un nuevo experimento impulsivo presurización celular se ha desarrollado utilizando un dispositivo de bar Kolsky para investigar explosión inducida por lesiones cerebrales traumáticas (TBI). Se demuestra en este artículo cómo explosión de vídeo TBI relevantes para la presurización impulsivo se aplica a las células neuronales in vitro. Esto se logra mediante el uso de un buen control de presión de pulso creado por un equipo especializado Kolsky bar, con la historia completa de presión dentro de la cámara de presurización celular registrado. Presurizado células neuronales son inspeccionados inmediatamente después de la presurización, o se incubaron para examinar los efectos a largo plazo de la presurización de impulsivo en neurite / axonal, la expresión génica neuronal, apoptosis, etc Hemos observado que la presurización impulsivo en alrededor de 2 MPa induce la pérdida de relación distinta de neuritas a las células sin presión. Nuestra técnica ofrece un nuevo método para investigar los mecanismos moleculares / celulares de la explosión TBI, a través de la presurización impulsivo de las células del cerebro en una magnitud de presión bien controlada y la duración.

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Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Un nuevo experimento impulsivo presurización celular se ha desarrollado utilizando un dispositivo de bar Kolsky para investigar los mecanismos moleculares / celulares de la explosión inducida por la lesión cerebral traumática.

La presurización impulsivo de las células neuronales para el Estudio de lesión cerebral traumática

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

impulsive-pressurization-neuronal-cells-for-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K vistas.  University of Nebraska-Lincoln. Un nuevo experimento impulsivo presurización celular se ha desarrollado utilizando un dispositivo de bar Kolsky para investigar los mecanismos moleculares / celulares de la explosión inducida por la lesión cerebral traumática.

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Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Superficies micropatterned para estudiar las interacciones de ácido hialurónico con células de cáncer

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Investigación

Bioingeniería

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

Un dispositivo de cámara de flujo tridimensional Novel para el Estudio de quimioquinas-dirigida extravasación de células circulantes en condiciones de flujo fisiológicas

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

La luminiscencia de energía de resonancia de transferencia para estudiar cambios conformacionales en proteínas de membrana expresado en células de mamífero

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper extremity function and are able to maintain upright balance using forearm crutches. To ambulate in an exoskeleton, the user must acquire the ability to maintain balance while standing, sitting and appropriate weight shifting with each step. This can be a challenging task for those with deficits in sensation and proprioception in their lower extremities. This manuscript describes screening criteria and a training program developed at the James J. Peters VA Medical Center, Bronx, NY to teach users the skills needed to utilize these devices in institutional, home or community environments. Before training can begin, potential users are screened for appropriate range of motion of the hip, knee and ankle joints. Persons with SCI are at an increased risk of sustaining lower extremity fractures, even with minimal strain or trauma, therefore a bone mineral density assessment is performed to reduce the risk of fracture. Also, as part of screening, a physical examination is performed in order to identify additional health-related contraindications. 
Once the person has successfully passed all screening requirements, they are cleared to begin the training program. The device is properly adjusted to fit the user. A series of static and dynamic balance tasks are taught and performed by the user before learning to walk. The person is taught to ambulate in various environments ranging from indoor level surfaces to outdoors over uneven or changing surfaces. Once skilled enough to be a candidate for home use with the exoskeleton, the user is then required to designate a companion-walker who will train alongside them. Together, the pair must demonstrate the ability to perform various advanced tasks in order to be permitted to use the exoskeleton in their home/community environment.

Training a person with paralysis to ambulate using a powered exoskeleton may present challenges. The goals are to present the candidate selection criteria and the training procedures for exoskeletal-assisted walking and other mobility skills that can be progressed as the participant's skill level improves.

La formación de las personas con lesión de la médula espinal de deambular El uso de un exoesqueleto

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Escritura de Electrospinning de andamios Poly(ε-caprolactone) tridimensional con morfologías controlables para aplicaciones de ingeniería de tejidos del derretimiento

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

Dirigidos a los tractos de fibras neuronales para la terapia de estimulación cerebral profunda mediante modelos interactivos, específico para cada paciente

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Ácido hialurónico basado en hidrogeles de 3 dimensiones cultura de células de Glioblastoma derivados del paciente

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...