Esta investigación fue apoyada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana para la Investigación) con el número de subvención FO 315/4- y el Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) bajo contrato de subvención No. SALUD-F2-2009 hasta 241.778 a CF.

1. Siembra de las células endoteliales en Well Plates <ol><li> Cultivar las células endoteliales microvasculares del cerebro murino (CEND) en un matraz de cultivo T75, cambiando el medio (DMEM que contenía 10% de FCS, 50 U / ml de penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina) dos veces a la semana, hasta que se alcanzó confluencia. (Para la generación y la inmortalización de las células endoteliales microvasculares cerebrales, consulte Burek et al, 2012;. Förster et al, 2005 21,19.). </li><li> Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Retire el PBS y trypsinize las células con 2 ml de solución de tripsina-EDTA caliente. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C durante 5 min o hasta que se dispersa la capa de células. </li><li> Añadir 8 ml de medio de cultivo en las células. Toque en el frasco varias veces para separar las células. </li><li> Ver las células bajo el microscopio para asegurar total desapego del matraz. </li><li> Medio de pipetas con células desprendidas de arriba abajo. Agitar el matraz para mezclar el Suspensiòn celularen. </li><li> Tomar 20 l de la suspensión celular, poner en un hemocitómetro y contar el número de células. </li><li> Determinar la densidad celular y de las semillas 20.000 células / cm 2 en el pozo. </li><li> Transferir la suspensión celular en collagen1 6 pocillos recubiertas previamente flexibles de fondo placas de cultivo de 57,75 cm (2) en un volumen total de 3 ml / pocillo. Cada pozo tiene una superficie de 9,62 cm2. </li><li> Cultivar las células a 37 ° C durante una semana hasta la confluencia. Cambiar el medio de cultivo dos veces por semana. </li></ol> 2. Diferenciación Celular Antes de la lesión por estiramiento inducido <ol><li> Cambiar el medio de cultivo de las células con medio de diferenciación (DMEM que contenía 1% de suero de ternera fetal de suero despojado (ssFCS), 50 U / ml de penicilina / estreptomicina). </li><li> Se incuban las células a 37 ° C durante 24 hr. </li></ol> 3. Lesiones inducidas por el estiramiento de las células endoteliales <ol><li> Encienda el dispositivo controlador de lesión celular. </li><li> Ajuste el retardo de 50 ms. </li><li> Ajuste el regulador de presión de 15 psi y apriete el gatillo un par de veces hasta que la presión máxima registrada se estabilice. </li><li> Ajuste el regulador de presión hasta el valor deseado. Utilice la Tabla 1 como una guía para la generación de varios grados de lesión por estiramiento. </li><li> Coloque la placa de cultivo de fondo flexible de 6 pocillos (57,75 cm 2) en el soporte de la bandeja. Asegúrese de que el selector también se establece en el tamaño y correcta (es decir, grande también). </li><li> Coloque el conector del adaptador firmemente sobre el pozo. Sujete el enchufe firmemente en su lugar con una mano mientras la otra mano empuja el gatillo. </li><li> Anote la presión máxima generada. </li><li> Ponga inmediatamente la placa de nuevo en la 37 ° C incubadora durante el período de tiempo deseado o utilizar de inmediato para tener éxito experimentos o evaluación. </li></ol> 4. Evaluación de la lesión por estiramiento por ensayo de absorción del tinte <ol><li> Inmediatamente después de que las células fueron strgrabado al agua fuerte (paso 3.7), añadir 30 l de una mg / ml de solución de la viabilidad mancha 1 que actúa como un marcador de la citotoxicidad (por favor, véase la tabla suplementaria de materiales y equipo) para el medio de cultivo celular (Nota: 10 l de la solución de colorante es para ser utilizado por cada ml de medio de cultivo celular). </li><li> Después de la adición del colorante a las células, ver inmediatamente bajo un microscopio de fluorescencia. </li></ol> 5. Evaluación de la lesión por estiramiento por la lactato deshidrogenasa (LDH) de lanzamiento <ol><li> Inmediatamente después del estiramiento de las células (paso 3.7), eliminar 200 l de medio de cultivo celular del pozo. Haga lo mismo con cada punto de tiempo después de la lesión que le gustaría incluir en su investigación de la liberación de LDH (es decir, por ejemplo, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, etc.) </li><li> Se centrifuga el medio de cultivo celular en el ajuste más alto de una microcentrífuga durante 5 min para eliminar los residuos de células. Eliminar el sobrenadante y con ello a los pasos siguientes. </li><li> Una vez que have terminó paso 5.1 y se han tomado las muestras necesarias que le gustaría tener de los diferentes puntos de tiempo que le gustaría investigar, lisis de las células por medio de la solución de lisis incluido en el kit de ensayo de LDH (ver tabla complementaria de materiales y equipos). </li><li> Ponga 100 l de medio de ensayo se incluye en el ensayo de Kitto cada pocillo de una placa de 96 pozos proporcionado en el kit. </li><li> Ponga 100 l de medio de cultivo celular libre de células en dos pocillos paralelos de una placa de 96 pozos incluido en el kit de ensayo. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Leer la absorbancia a 492 nm. </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

Los efectos de una lesión mecánica in vitro se han estudiado y se han establecido métodos para astrocitos, neuronas, células gliales y células endoteliales aórticas 8, 9, 22. Hay, sin embargo, hasta la fecha todavía no es conocido ningún modelo in vitro de lesión por estiramiento en las células endoteliales cerebrales cultivadas. Los modelos celulares de trauma proporcionan ventajas valiosas sobre modelos animales ya que el entorno mecánico de las células puede ser controlada con precisión 6. Por lo tanto, un modelo in vitro de trauma por lesión tramo utilizando células cerebrales endoteliales cultivadas que actúan como modelo de la barrera hematoencefálica (BBB), como lo que nuestros regalos de protocolo puede llegar a ser útil. Este protocolo hace uso de las células CEND, un modelo de acreditación establecido en nuestro laboratorio. Desde BBB ruptura suele documentarse en pacientes con TCE y TBI suele estar relacionada con la interrupción de la acreditación que puede dar lugar a la formación de edema 23, 24, el método presentando específicamente aquí pueden ser utilizados en la realización de estudios de BBB en relación a la lesión cerebral traumática. En este modelo, es importante cuidar de la cantidad se aplica grado de lesión por estiramiento de las células. En la medida que las células se lesionan, en cualquier caso, y con cualquier cantidad de presión que se aplica, el grado de lesión que puede afectar las células endoteliales se diferencian mucho en gran medida de otros tipos de células. Células endoteliales aórticas son más resistentes a estirar lesiones que los astrocitos o células gliales mixtos 9. Además, se reparan más rápidamente después de la lesión en comparación con los otros tipos de células. Por lo tanto, para las células endoteliales cerebrales, particularmente células de CEND, mayor cantidad de lesión por estiramiento que se necesita para producir un alto grado de lesión. Se podría alcanzar el grado deseado de lesiones mediante la aplicación de la presión correspondiente se indica en la Tabla 1. Para las células CEND, sin embargo, se prefiere lesiones graves debido a su resistencia a la tensión. Los LDH ensayos realizados mostraronque a medida que aumenta el grado de estiramiento, más LDH se secreta en el sobrenadante. En contraste, las células que fueron dados una baja cantidad de lesión por estiramiento producen LDH en una cantidad similar a las células de control. Como se ha mencionado en el protocolo, se debe tener cuidado de que la cantidad apropiada de medio se utiliza ya que un aumento o disminución en la cantidad de medio pueden dar lugar a diferencias en la presión pico aplicado a los pozos. Por ejemplo, un pocillo que contiene 5 ml de fluido registra un pico de presión en la media de 4,0 psi, mientras que un pocillo vacío registra un promedio de 3,8 psi cuando se aplica presión de 45 psi. Por lo tanto, lo mejor es empujar el gatillo varias veces durante un pocillo de control para asegurar que el pico de presión que se genera corresponde a la cantidad deseada. En nuestros experimentos se utilizó una tinción de viabilidad para determinar el efecto de estiramiento a la permeabilidad de la membrana celular. La óptica de las placas de cultivo flexibles de fondo que utilizamos nos permite VIew las células teñidas directamente bajo el microscopio. Sin embargo, cuando se quiere llevar a cabo estudios de inmunomarcaje directamente después del estiramiento de la lesión, pueden surgir dificultades. En primer lugar, el tamaño y el grosor de la placa pueden plantear un problema con algunas plataformas de observación del microscopio. En segundo lugar, la óptica de la membrana flexible del pozo pueden ser un obstáculo para borrar la visualización. A pesar de las limitaciones mencionadas anteriormente, sin embargo, el procedimiento descrito se puede utilizar como un modelo de lesión mecánica en in vitro de la BBB. La lesión cerebral traumática (TBI) tiene dos componentes, a saber, la isquemia y trauma. La isquemia puede producirse como una lesión secundaria después de un TCE en casos en los que hay una pérdida grave de la sangre resultante de la presión sanguínea baja o como resultado de la inflamación del cerebro restringir el suministro de oxígeno al cerebro. Se considera como un retraso, el daño no mecánica que representa procesos patológicos consecutivos iniciados en el momento de la lesión 25. La ocurrencia de una hipoxiaespués severa lesión cerebral traumática es común 26. Privación de glucosa de oxígeno (OGD) es el método que se utiliza actualmente para modelo de isquemia in vitro. Por lo tanto, sometiendo las células a OGD como un insulto secundario a las células después del estiramiento puede imitar la incidencia de la lesión cerebral traumática seguido por la isquemia. Por lo tanto, para mejorar nuestra actual modelo in vitro de lesión cerebral traumática y el patrón que lo más cerca posible a una lesión cerebral traumática real, ya que se produce in vivo, en el futuro vamos a OGD también emplear en combinación con lesión por estiramiento.

La lesión cerebral traumática (TBI) es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Unos 10 millones de personas se ven afectadas anualmente por TBI por lo que es uno de los principales problema de salud y médico 1. Debido a esto, varios in vivo e in vitro en modelos de lesión cerebral traumática se han establecido y desarrollado para estudiar sus mecanismos 2,3,4. Una mejor comprensión de la lesión cerebral traumática puede ayudar a mejorar el tratamiento del paciente y disminuir la mortalidad asociada, morbilidad, y el costo. Existen muchos modelos de lesión cerebral que utilizan tanto in vivo e in vitro. En modelos in vivo podría imitar el caso real de lesión en la cabeza. Sin embargo, debido a la complejidad de la situación in vivo, la accesibilidad para el tejido de interés se vuelve limitado 2. En la comprensión de la respuesta fisiológica de las células individuales como resultado de la lesión infligida, es importante que las células se aíslan de los efectos sistémicos quepueden inhibir o alterar su respuesta individual 5. Por esta razón, los modelos celulares de trauma proporcionan ventajas valiosas sobre modelos animales ya que el entorno mecánico de las células puede ser controlada con precisión 6. En sistemas in vitro que emplean el uso de la carga mecánica a las células o tejidos para determinar alteraciones inducidas por tal método de lesiones se han desarrollado. Por ejemplo, un método para estudiar el efecto de lesión mecánica a las células se ha establecido para astrocitos, neuronas, células gliales y células endoteliales aórticas 7,8,9. El traumatismo en el modelo in vitro establecido para el estudio de roedor y reactividad astrocito humano 10 empleado un dispositivo de control de presión idéntico a lo que utilizamos para nuestro modelo. El mismo método se aplicó para inducir la lesión a través de estiramiento en las células endoteliales de microvasos de cerebro de ratón (bEnd3) 11 y las neuronas corticales 12,13, así como, endoth cerebralcélulas Elial de los lechones recién nacidos 14. El dispositivo se deforma la parte inferior del pocillo de cultivo produciendo por ello un perjuicio estiramiento mecánico 10. Se inflige daño sobre las células cultivadas mediante la aplicación de presión de aire por encima de las células. Esta presión puede desviar la membrana sobre la cual las células están creciendo, estirando así las células. Varios grados de estiramiento (es decir, &quot;bajo,&quot; moderado &quot;o&quot; grave &quot;) se puede lograr mediante el establecimiento de la duración del pulso de presión de aire y la intensidad en consecuencia. Este método de lesiones inducidas por el estiramiento se ha correlacionado con lesión traumática in vivo 7. Además , este método de la lesión permite el control preciso del medio ambiente extracelular y se puede reproducir fácilmente. Aunque un enfoque similar se ha utilizado para muchos otros tipos de células del cerebro incluyendo bEnd3, nuestro modelo es de la ventaja de que se hace uso de las células endoteliales microvasculares del cerebro murino (CEND) generadoen nuestro laboratorio. Esta línea celular es un modelo muy adecuado de la barrera hematoencefálica (BHE). En cultivos celulares in vitro utilizados como modelos de BBB deben poseer características que les permitan servir como pantalla de permeabilidad. Un criterio importante para un modelo de células in vitro a ser un predictor de la permeabilidad de la BHE es que debe poseer la arquitectura celular fisiológicamente realista 15. A pesar de que presentan las células bEnd3 distintivo husillo morfología similar escamosas en la cultura 16, que presentan un comportamiento irregular morfogenética in vitro mediante el cual se forman cavidades quísticas en lugar de las estructuras tubulares regulares en geles de fibrina 17. Por otra parte, cuando las células fueron inyectadas en embriones de ratones y del recién nacido, se indujeron tumores de rápido crecimiento letales de embriones de ratones, pero no en ratones recién nacidos y joven. Por tanto, se sugirió que uno o más procesos que regulan normal de crecimiento endotelial, la migración, y diferenciación han sido alterados o eliminandoed en esta línea celular 18. Por otro lado, morfológica, la evaluación inmunocitoquímica de las mediciones de flujo endoteliales y la expresión de marcadores acreditación, bioeléctrica, y paracelular demuestran que nuestro modelo de acreditación CEND es de hecho un modelo adecuado de la acreditación 19. Endotelio cerebral in vivo se caracteriza por una permeabilidad muy apretado con resistencia eléctrica trans-endotelial (TEER) que van desde 2.000-5.000 Ωcm 2. Para los estudios de las propiedades de barrera microvasculatura del cerebro a los productos farmacéuticos, deberían considerarse restrictivo paracelular y el apriete de las células. En la mayoría de las células endoteliales capilares cerebrales (BCEC), esto no se conserva como la exposición de las células TEER que van desde 50 hasta 100 Ωcm 2 20. El cerebro endotelial bEnd3 línea celular inmortalizada genera valores TEER de no más de 60 Ωcm 2 15. En contraste diferenciación de las células CEND con medio que contiene suero reducido pantallaValores TEER que van desde 300 hasta 500 Ωcm 2 19,21. Hasta la fecha, en modelos in vitro de lesión por estiramiento en las células endoteliales cerebrales cultivadas son escasos. Por lo tanto, un modelo in vitro para el trauma a través de lesión por estiramiento usando células endoteliales cerebrales cultivadas que actúan como modelo de la acreditación puede llegar a ser útil. En este protocolo, se presenta un modelo in vitro que podría imitar el impacto real que las células cerebrales, células endoteliales microvasculares específica del cerebro de la acreditación, reciben durante TBI. La principal ventaja de este modelo es que la cantidad de daño aplicado a las células, así como el medio extracelular se puede controlar fácilmente, de manera precisa lo que facilita la reproducibilidad del montaje experimental.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cell Injury Controller II</td>
			<td style="width:351px;">Custom Design and Fabrication, Virginia, USA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:431px;"></td>
			<td style="width:435px;">http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Remarks</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflex Culture Plate - Collagen Type I</td>
			<td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td>
			<td>BF - 3001C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5796</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">A15110-1333</td>
			<td style="width:431px;">final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 &#176;C)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0282</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MEM Vitamin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0373</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Na-pyruvate</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">L0473</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Nonessential amino acids (NEA)</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0293</td>
			<td style="width:431px;">Storage at 4 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">A2212</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS)</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>12676-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td>L11-004</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image-iT DEAD Green</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>I10291</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C, protected from light</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4744926001</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier

Debido a la alta incidencia de mortalidad provocada por una lesión cerebral traumática (TBI), los métodos que permitan a comprender mejor los mecanismos subyacentes implicados en ella son útiles para el tratamiento. Hay tanto in vivo como in vitro en los métodos disponibles para este propósito. En modelos in vivo pueden imitar lesión en la cabeza real, ya que se produce durante la lesión cerebral traumática. Sin embargo, las técnicas in vivo no puede ser explotado para realizar estudios a nivel de fisiología celular. Por lo tanto, en los métodos in vitro son más ventajosa para este propósito, ya que proporcionan un acceso más fácil a las células y el medio ambiente extracelular para la manipulación. Nuestro protocolo presenta un modelo in vitro de lesión cerebral traumática usando lesión por estiramiento en las células endoteliales microvasculares del cerebro. Se utiliza la presión aplicada a las células cultivadas en pozos flexibles de fondo. La presión aplicada se puede controlar fácilmente y puede producir lesiones que va de menos a más grave. El murinocélulas endoteliales microvasculares cerebrales (CEND) generados en nuestro laboratorio es un modelo bien adaptado para la barrera hematoencefálica (BBB), proporcionando así una ventaja a otros sistemas que emplean una técnica similar. Además, debido a la simplicidad del método, los montajes experimentales se duplican fácilmente. Por lo tanto, este modelo se puede utilizar en el estudio de los mecanismos celulares y moleculares implicados en la LCT en la acreditación.

Las células cultivadas en colágeno I recubrieron previamente placas de cultivo de fondo de 6 pocillos flexibles (57,75 cm 2) se sometieron a diversos grados de lesión por estiramiento utilizando el dispositivo de camilla celular. Después de someter las células a la herida, que se examinaron bajo el microscopio en busca de los efectos de las lesiones inducidas por el estiramiento de la morfología celular. Se observó que se aplicó como un mayor grado de estiramiento de las células también se pudo observar un mayor grado de distorsión de la célula (Figura 1). Como se muestra en la Figura 1A, las células de control que no estaban sometidos a lesiones aparecen células endoteliales cerebrovasculares como de forma regular (CEND) sin ninguna indicación de hinchazón celular o la distorsión. Cuando se aplicó lesión por estiramiento (Figuras 1B-D), la deformación se puede observar bajo el microscopio de luz. Después de estirar las células gravemente con un pico de presión entre 3.5 a 4.5 psi, las células cend parecían notablemente retraídos, hinchados y deformados con no<html> espacios intercelulares capaces. Además, la absorción de la viabilidad mancha (100 nM concentración final) también aumentó a medida que aumentaba el grado de lesión por estiramiento (Figura 2). La viabilidad mancha utilizado es un medio de contraste para impermeable a las células sanas que se convierte en permeable cuando se ve comprometida la integridad de la membrana plasmática de las células. El colorante fue excluido de la mayor parte de las células de control, por lo tanto, sólo algunas de las células se tiñeron (Figura 2A) en comparación con células estiradas (Figuras 2B-D). Más células fluoresció verde con un mayor grado de lesión por estiramiento. Como un marcador bioquímico de lesiones, la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) enzima también se examinó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Figura 3 muestra que un aumento de lesión por estiramiento celular causado el aumento de la liberación de LDH. 928/50928fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; Figura 1. Examen de microscopía de luz de las células normales vs lesionada. (A) normal sin estirar monocapa celular confluente istightly lleno y alargada. Cuando las células se estiraron mediante la aplicación de un impulso de presión pico de 1,8-2,0 psi (es decir, bajo estiramiento) que aparecen menos compacta, espacios indicados por las flechas (B). Cuando las células fueron moderadamente heridos con un impulso de presión pico de 2,5-3,0, algunos de ellos parecían hinchadas y deformadas (C). Las células se vuelven retraídos con estiramiento severa de 3.5 a 4.5 psi, como se indica por la flecha (D). Un aumento de 100X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Flúorescencia examen microscópico de las células normales vs lesionado células tratadas con tinción de viabilidad 2 horas después de la lesión A: las células de control sin estirar BD: células estiradas (B - bajo, C - moderada, D - grave).... Un aumento de 100X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. Lactato deshidrogenasa de liberación (LDH) enzima en el sobrenadante después de la lesión por estiramiento. LDH liberada en el medio de cultivo se midió a diversos intervalos de tiempo después de la lesión inducida por estiramiento. LDH se expresó como un porcentaje de la LDH total liberable (LDH en los medios de comunicación más células). Los valores son ± SEM. El n para cada punto de tiempo es 5, excepto para el 0 hr valor sometido a estiramiento severa donde n = 3. La liberación de LDH a partir de células que fueron sometidos a estiramiento bajo y moderado no difirió significativamente de la de los controles no estiradas y el uno del otro. Las células que fueron severamente extendían liberan una cantidad significativamente mayor de la LDH en comparación con todas las demás muestras, excepto para la muestra moderadamente estirado a 1 hr. (P &lt;0,05, un factor ANOVA, método de Holm-Sidak). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . Tabla 1. Guía para la generación de diversos grados de lesión por estiramiento. <table border="1"><tbody><tr><th> Regulador de presión </th><th> Presión máxima </th><th> Grado de Lesión </th></tr><tr><td> 15 psi </td><td> 01.02 a 01.05 psi </td><td> &lt;Menor </td></tr><tr><td> 20-25 psi </td><td> 1,8-2,0 psi </td><td> Bajo </td></tr><tr><td> 30-35 psi </td><td> 2,5-3,0 psi </td><td> Moderada </td&gt; </tr><tr><td> 40-50 psi </td><td> 3.5 a 4.5 psi </td><td> Grave </td></tr><tr><td> 60 psi </td><td> 4,8-6,0 psi </td><td> &gt; Grave </td></tr></tbody></table>

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Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro se están desarrollando modelos de lesiones cerebrales traumáticas para reproducir una deformación del cerebro vivo. Lesiones inducidas por el estiramiento se ha empleado para astrocitos, neuronas, células gliales, la aorta, y células endoteliales cerebrales. Sin embargo, nuestro sistema utiliza una barrera hematoencefálica (BBB) ​​modelo que posee propiedades que constituyen un modelo legítimo de la acreditación para establecer un modelo in vitro de lesión cerebral traumática.

Estirar en Brain células endoteliales microvasculares (CEND) como<em&gt; In Vitro</em&gt; Lesión cerebral traumática Modelo de la barrera hematoencefálica

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

stretch-brain-microvascular-endothelial-cells-cend-as-an-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

14.8K vistas.  Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg.  In vitro se están desarrollando modelos de lesiones cerebrales traumáticas para reproducir una deformación del cerebro vivo. Lesiones inducidas por el estiramiento se ha empleado para astrocitos, neuronas, células gliales, la aorta, y células endoteliales cerebrales. Sin embargo, nuestro sistema utiliza una barrera hematoencefálica (BBB) ​​modelo que posee propiedades que constituyen un modelo legítimo de la acreditación para establ...

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MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

Resonancia magnética guiada por disrupción de la barrera sangre-cerebro con ultrasonido transcraneal Enfocado en un modelo de rata

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Investigación

Medicina

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Modelo de rata de ruptura de la barrera sangre-cerebro para permitir dirigida Therapeutics neurovascular

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Establecimiento de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rata barrera hematoencefálica (BBB): Un Enfoque en la acreditación Impermeabilidad y transporte mediado por los receptores

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Carrera

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Controlado Modelo de Impacto cortical de la lesión cerebral traumática

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

Un nuevo modelo de leve lesión cerebral traumática para ratas jóvenes

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Oxígeno-Glucosa Privación y Reoxigenación como<em&gt; In Vitro</em&gt; La isquemia-reperfusión modelo para el estudio de la disfunción barrera hematoencefálica

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal neurological deficits and even amnesia. Athletes participating in contact sports are at high risk of exposure to large number of mTBIs. In terms of the level of injury in a sporting athlete, a mTBI is defined as a mild injury that does not cause gross pathological changes, but does cause short-term neurological deficits that are spontaneously resolved. Despite previous attempts to model mTBI in mice and rats, many have reported gross adverse effects including skull fractures, intracerebral bleeding, axonal injury and neuronal cell death. Herein, we describe our highly reproducible animal model of mTBI that reproduces clinically relevant symptoms. This model uses a custom made pneumatic impactor device to deliver a closed-head trauma. This impact is made under precise velocity and deformation parameters, creating a reliable and reproducible model to examine the mechanisms that contribute to effects of single or repetitive concussive mTBI.

Athletes absorb several hundred mild traumatic brain injuries (mTBI)/concussions every year; however, the consequence of these on the brain is poorly understood. Therefore, an animal model of single and repetitive mTBI that consistently replicates clinically relevant symptoms provides the means to advance the study of mTBI and concussion.

Un Modelo de Ratón de Único y Repetitivo Lesión Cerebral Traumática Leve

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Ensayos in vitro para evaluar la formación y la interrupción de los vasos sanguíneos de barrera hematoencefálica

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...