Los Dres. CJP Grimmelikhuijzen y Michael Williamson de la Universidad de Copenhague (Dinamarca) son apreciados para la prestación del aequorin plásmido. Nuestro colaborador, el Dr. Ronald J. Nachman del ARS-USDA (Texas, EE.UU.), es reconocido por la síntesis de péptidos y de proporcionar al lector de placas Novostar.

1. Establecimiento de líneas celulares estables <ol><li> Clon de su GPCR de interés y la inserta en un vector de expresión que incorpora una secuencia 5 &#39;consenso Kozak (AMCC / GCCATGG) alrededor del codón de inicio de la unión ribosomal óptimo en un sistema mamífero (Kozak, 1986). Aquí se utiliza el pcDNA3.1/Bm-KR plásmido para el receptor de garrapata quinina, y el pcDNA3.1/Aedae-KR plásmido para que el mosquito de los receptores de cininas (Holmes et al, 2003;. Pietrantonio et al, 2005).. El pcDNA3.1 (-) vector codifica resistencia a la ampicilina para la selección de bacterias y resistencia a la neomicina (G418) para la selección de células de mamíferos. </li><li> Crecer células CHO-K1 vacío (sin plásmidos) (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) o de otro tipo de línea que desee de células en un frasco T-25 (BD Falcon) a 37 ° C en un 5% de CO 2 humidificado incubadora (Holmes et al ., 2003). Todas las incubaciones más se debe hacer bajo estas condiciones, a menos que se especifique lo contrario. Mantener las celdas vacías en medio de cultivo (medio F12K con suero fetal bovino al 10%) con 1X antibiótico-antimicótico (Invitrogen, CA). </li><li> Para dividir celdas, todas las soluciones de calentamiento a 37 º C. Quitar viejo medio en el frasco T-25 y enjuague con 5 ml de PBS y luego retire PBS. Para trypsinize células, añadir 2 ml de PBS-tripsina-EDTA (34 ml de PBS, 2 ml de 7,5% de bicarbonato de sodio, 4 ml de tripsina-EDTA 10 veces) durante 2 min. Añadir 3 ml de medio y medio aspirado hacia arriba y hacia abajo para mezclar las células. Medio de transmisión con las células en un tubo cónico y centrifugar durante 2 minutos a ~ 200-300 g (1.000 rpm). Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de medio. Diluir las células se resuspendieron a una concentración de 1:05 o 1:10 con un nuevo medio y la transferencia de 5 ml en un nuevo frasco T-25. </li><li> Después que las células están creciendo saludablemente (alrededor de 2-3 días), las semillas de las células CHO-K1 en T-25 frascos de cultivo de tejidos y crecer durante la noche en medio de cultivo sin antibióticos hasta que son cerca del 30% confluencia (aproximadamente 18 horas). El grado de confluencia puede ser determinada por la observación de las células bajo el microscopio fluorescente invertida. </li><li> Prepare las siguientes mezclas para cada muestra: <ol><li> Combine 2.1 ug de ADN (por ejemplo: uso de 4μl 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) con 100 l de Opti-MEM I Reducción de medio sin suero (Invitrogen). </li><li> Mix 6 reactivo Lipofectina l (InvitrogenTM) en 100 l medio F12K libre de suero, por lo que una proporción de 1:1 de Lipofectina al ADN. Incubar a temperatura ambiente durante 30-45 min. </li></ol> Mezclar suavemente las soluciones de la 1.5.1 a 1.5.2 de forma gota a gota (volumen total = 200 l). Deje reposar a temperatura ambiente durante 10-15 min. </li><li> Retire el medio de cultivo de edad de las células y se lavan las células con 5 ml de medio libre de suero y F12K retire el medio libre de suero F12K. En un tubo de 15 ml, mezclar suavemente la mezcla de transfección en 1,8 ml de medio F12K fresco en forma gota a gota. A continuación, se lavan las células a partir del paso 1.5 con PBS y añadir la solución de transfección a las células nuevas. Incubar durante 18 horas. </li><li> Cambiar el medio a medio F12K más el 10% de suero fetal bovino sin antibióticos y se incuba durante la noche. Dividir las celdas en dos T-25 frascos con medio F12K más el 10% de suero fetal bovino sin antibióticos por 18 horas (para dividir celdas, por favor, consulte el paso 1.3). </li><li> Sustituya el medio con un medio selectivo (medio F12K más el 10% de suero fetal bovino con 800μg/ml geneticina, Invitrogen). Cultivo de las células utilizando el medio selectivo para 3-4 semanas. Con el tiempo esto va a seleccionar las células que han incorporado de manera estable el plásmido en su ADN genómico. Siguen manteniendo a las células con medio de mantenimiento (medio F12K más el 10% de suero fetal bovino con 400μg/ml geneticina). Periódicamente congelar las líneas celulares con una proporción de 1:1 de los medios de congelación (medio selectivo con un 20% DMSO) para evitar pérdidas en caso de contaminación inesperado. </li><li> Selección de líneas clonales de células: como un primer paso, trypsinize y centrifugar las células a partir del paso 1.8 con medio de mantenimiento como en el paso 1.3. Vuelva a suspender las células en 5 ml de medio de mantenimiento, tomar 0,5 ml de la suspensión celular y añadir 4,5 ml de medio de mantenimiento fresco para hacer una dilución de 10x. La transferencia de la dilución de 10 veces en 12 pozos de una placa de 96 pocillos, añadiendo 100 l de cada pozo para seleccionar las células individuales. </li><li> Seguir haciendo 10x diluciones en serie de estas células de una suspensión teórico final de un celular por cada 100 l (normalmente la dilución final estará en el rango de 10 -11 a 10 -19, el número total de 10 veces diluciones en serie es de ~ 19) . Inmediatamente después de cada dilución, la transferencia de 100 l de la dilución en 12 pozos de la placa de 96 pocillos. Después de 18 horas de incubación, observar placas de 96 y bajo una luz invertida o pozos microscopio de fluorescencia y la marca que parece que sólo contienen una sola célula o células que contienen dos, obviamente, dividido en una sola célula. Mantener la observación de todos los días y medio de cambiar cada tres días. </li><li> Cuando los pozos son un 80% confluenciadiferentes (una semana), enjuague los pozos marcados con 200 l de PBS y trypsinize con 100 l de PBS-tripsina-EDTA. Células de transferencia de cada marca y en un pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 ml de medio de mantenimiento. Crecer las células durante 3 días y luego la transferencia de células en cada frasco T25. Prueba de estas células utilizando el ensayo de bioluminiscencia de calcio con péptidos agonistas (ver sección 2). </li><li> Seleccione una línea celular a partir del paso 1,11 con la mayor respuesta en el ensayo de placa de calcio bioluminiscencia y llevar a cabo por segunda vez la única célula siguientes pasos de selección 1.9 a 1.11. Periódicamente congelar las líneas celulares. </li><li> Desde la selección secundaria describe en el paso 1.12, 02.03 elegir las líneas celulares con la mayor respuesta en el ensayo de placa de calcio bioluminiscencia y mantener en cultivo para los ensayos de más de calcio placa bioluminiscencia. Lleve un registro de números de pasaje. De vez en cuando, congelar las líneas celulares a partir de principios de los pasajes para que usted siempre puede volver a ellos si las líneas de células con más pasajes de dejar de realizar consistentemente. </li></ol> 2. La bioluminiscencia de calcio placa de ensayo <ol><li> Ligar el gen reportero de interés en un vector de expresión. Aquí usamos mtAEQ/pcDNA1 aequorin plásmido (un regalo de los Dres. CJP Grimmelikhuijzen y Michael Williamson de la Universidad de Copenhague, Dinamarca). Transformar el plásmido en E. células MC1061/PS coli (Invitrogen) y purificarlos con un giro QIAprep miniprep kit (Qiagen Inc.). En el paso final eluir el plásmido con tampón Tris sin EDTA, no agua. </li><li> Crecen las líneas celulares a partir del paso 1,13 expresan el receptor deseado en medio de mantenimiento. Cuando las células son el 90% confluentes, trypsinize, centrifugación y luego volver a suspender las células en 5 ml de medio de mantenimiento como en el paso 1.3. Diluir las células (alrededor de 10 veces con medio de mantenimiento) y contar el número de células con el contador de células (línea brillante hemocitómetro) bajo el microscopio. Ajustar el número de células de aproximadamente 2 x 10 5 células / ml (media de 20 células en una de las nueve plazas mostró en el hemocitómetro). Semillas de 2 ml diluida en las células de los medios de comunicación en cada pocillo de una placa de seis también. Incubar durante 24 horas (las células deben llegar a un 60% de confluencia después de la incubación). </li><li> Cambiar los medios de comunicación en la placa de 6 pozos de OPTI-MEM medio. Para cada bien, mezclar 96 l OPTI-MEM con 4 reactivo de transfección l FuGENE 6 (Roche bioquímicos) en un tubo de microcentrífuga y deje reposar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 1 g de aequorin / pcDNA un plásmido de ADN en cada tubo y agite suavemente la muestra durante 1 minuto, se incuban a temperatura ambiente durante 15-20 minutos. Añadir cada mezcla en cada pozo en un gota a gota, mientras agitando suavemente la placa también. Las placas se incuban durante 6 horas y cambiar el medio a F12K medio que contiene 10% de suero fetal bovino sin antibiótico. </li><li> Después de incubar las células en seis y placa durante 24 horas, trypsinize, centrifugar y resuspender las células en el paso 1.3. Cuente el número de células a 400.000 células / ml en el paso 2.1 y la transferencia de 100 l (total 40.000 células/100 l) en cada pocillo de un 96-well inferior delgada placa de microtitulación (Costar 3610). Incubar durante 24 horas más hasta el 80% de confluencia celular. Esta es la concentración óptima de células para el ensayo de bioluminiscencia. </li><li> Prepare 90μl/well de un medio libre de calcio DMEM (Invitrogen) que contiene 5 coelenterazine M (Invitrogen) en la oscuridad (coelenterazine es sensible a la luz). Tome la placa de 2,4, retire el material antiguo y añadir este 90μl en cada pozo. Incubar las placas durante 3 horas en la oscuridad a 37 ° C y 5% de CO 2, después de que las células de la placa está listo para ser probado. </li></ol> 3. Operación del instrumento y análisis de datos <ol><li> Cada lector de placas de bioluminiscencia es diferente. Llevamos a cabo nuestro ensayo con un Novostar (Labtechnologies BMG) lector de placas en el modo de bioluminensence. Si se utiliza un instrumento diferente, debe adaptar el protocolo. </li><li> Purgar las bombas lector de placas (o bombas de PRIME) antes de su uso. Apaga la luz en la sala antes de poner la placa en el soporte de la placa. Una vez que el soporte de la placa se ha cerrado, encender las luces. </li><li> Solubilizar péptidos (en un tubo de 1,5 ml Eppendorf) en los medios de comunicación libres de calcio DMEM. Establecer la &quot;profundidad Aspirar&quot; y &quot;Determinación de la posición&quot; de la solución de péptido antes de su uso. Desafío de las células con 10 l (10 veces) de diferentes concentraciones de los péptidos (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, o otros péptidos se desea) y de inmediato comenzar a grabar la emisión de luz. Hemos establecido el instrumento para registrar la emisión de luz (465 nm) para cada pozo cada 2 segundos durante un tiempo total de 50 segundos. </li><li> Asegúrese de incluir un control positivo, como un activo análogo (analógico FFFSWGa se ha utilizado, Taneja-Bageshwar et al., 2009) y un control negativo, como las células transfectadas único vector. El control negativo, será necesario durante el análisis de datos para establecer el umbral de referencia (ver resultados representativos).Un péptido no relacionado, inactivos también puede ser añadido como control negativo. </li><li> Después de la carrera está completo, lavar la bomba de instrumento (o bombas de PRIME) y coloque la muestra de péptido siguiente. Guarde sus datos y lavar las bombas de nuevo. </li><li> El manejo de datos: Transferencia de los datos de emisión de luz de cada pocillo en una hoja de datos de Microsoft Excel. </li><li> Pegue los datos de Excel a Prisma 4.0 del software de GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, EE.UU.). Las concentraciones de péptido diversos es el eje X y las unidades de la bioluminiscencia es el eje. Para normalizar los datos, trazar una curva log-respuesta. Seleccione una curva de regresión no lineal de análisis en forma (sigmoidal dosis-respuesta ecuación con pendiente variable) para obtener curvas concentración-respuesta para cada péptido. El programa dibuja los valores de la final y le da la CE 50. </li><li> Cada experimento debe ser repetido tres veces para el análisis de datos. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Cuando se expresa en células CHO-K1, el mosquito Aedes aegypti receptor de quinina se comportó como un receptor multiligand y funcionalmente respondió a concentraciones tan bajas como 1 nM de los tres cininas endogenours Aedes, Aedae cininas 1-3, probado por separado utilizando la bioluminiscencia de calcio ensayo de placa . La figura 1 muestra que el orden de potencia se obtuvo Aedae-K-3&gt; Aedae-K-2&gt; Aedae-K-1, sobre la base de los respectivos valores de EC50 de Aedae-K-3, 16,04 nM; Aedae-K- 2, 26,6 nM y Aedae-K-1, 48,85 nM, que presentaban diferencias estadísticamente significativas (P &lt;0,05) (Pietrantonio et al., 2005). También utilizó este ensayo para determinar que los residuos de quinina son críticos para la quinina péptido-receptor de la interacción. Insectos péptidos de cininas compartir un pentapéptido C-terminal que representa la secuencia mínima necesaria para la actividad biológica, también conocida como núcleo. En la Tabla 1, los análogos de péptidos de cininas fundamentales se sintetizan como una serie de sustitución de alanina del núcleo cinina pentapéptido FFSWGa y probados por un ensayo de placa de calcio bioluminiscencia (Taneja-Bageshwar et al., 2006). Se encontró que los aminoácidos Phe y Trp un 4 fueron esenciales para la actividad de las cininas insectos para ambos receptores. El ensayo también puede ser utilizado para probar péptidos diseñados para bioestabilidad mejorada. La Tabla 2 muestra los análogos diseñados quinina que contiene aminoácidos isobutírico (AIB) a prueba en la marca recombinante del receptor de quinina y la figura 2 se muestra la comparación de la actividad de seis aminoácidos alfa-análogos del ácido isobutírico sobre los receptores de cininas garrapata expresar CHO-K1 línea celular por calcio bioluminiscencia ensayo de placa (Taneja-Bageshwar et al., 2009). El hexapéptido FFFSWGa analógica se agrega un control positivo de la actividad del receptor. El análogo FF [Aib] WGA resultó más activo que el control analógico hexapéptido. El análogo con dos reemplazos de ácido aminoisobutírico, [Aib] FF [Aib] Ventajas de Windows Original, fue el más potente de los análogos de doble reemplazo de prueba (Cuadro 2 y Gráfico 2). Para más ejemplos de cómo este ensayo ha sido y puede ser aplicado ver Nachman y Pietantonio (2010), Nachman et al. (2009), Taneja-Bageshwar et al. (2008a), y Taneja-Bageshwar et al. (2008b). <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Estimación de Aedes cininas concentración efectiva (CE 50) en células CHO-K1 E10 por un ensayo de placa de calcio bioluminiscencia. El eje de las curvas de concentración-respuesta se obtuvo de las unidades de bioluminiscencia expresado como porcentaje de la respuesta máxima observada para cada péptido. Los puntos de datos representan el promedio de seis repeticiones obtenidas en tres experimentos independientes. Las barras representan el error estándar. (A) Estimación de Aedae-K1 EC 50 = 48 nM. (B) Estimación de Aedae K2-EC 50 = 26 nM. (C) Estimación de Aedae-K3 CE 50 = 16 nM. EC 50-K3 Aedae &lt;50 CE Aedae-K2 &lt;50 CE Aedae-K1, p &lt;0,05. El análisis estadístico y gráficos fueron con el software GraphPad Prisma 4.0. <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Comparación de la actividad de seis alfa-amino análogos del ácido isobutírico en el receptor de garrapata cinina expresar CHO-K1 línea celular mediante un ensayo de placa de calcio bioluminiscencia. El eje y representa unidades por ciento máximo de bioluminiscencia para cada análogo expresado como porcentaje de la bioluminiscencia observó a una concentración frente a la respuesta máxima observada entre todas las concentraciones ensayadas para cada análogo. El análisis estadístico y gráficos se realizaron con el software GraphPad Prisma 4.0. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> Marque la línea del receptor de la célula </td><td colspan="2"> Receptor de la línea celular de mosquitos </td></tr&gt; <tr><td> Péptidos </td><td> CE 50 (nm) </td><td > Bioluminiscencia respuesta máxima a 1 mM </td><td> CE 50 (nm) </td><td> Bioluminiscencia respuesta máxima a 1 mM </td></tr><tr><td> AFSWGa </td><td> Yo </td><td> Yo </td><td> Yo </td><td> Yo </td></tr><tr><td> FASWGa </td><td> 586 </td><td> 5600 </td><td> ND </td><td> 400 </td></tr><tr><td> FFAWGa </td><td> 64 </td><td> 12800 </td><td> 621 </td><td> 3050 </td></tr><tr><td> FFSAGa </td><td> Yo </td><td> Yo </td><td> Yo </td><td> Yo </td></tr><tr><td> FFSWAa </td><td> 417 </td><td> 10600 </td><td> 2800 </td><td> 1830 </td></tr><tr><td> FFSWGa </td><td> 590 </td><td> 10800 </td><td> ND </td><td> 525 </td></tr><tr><td> FSWGa </td><td> Yo </td><td> Yo </td><td> Yo </td><td> Yo </td></tr><tr><td> FFSWa </td><td> Yo </td><td> Yo </td><td> Yo </td><td> Yo </td></tr><tr><td> FFSWG-OH </td><td> Yo </td><td> Yo </td><td> Yo </td><td> Yo </td></tr><tr><td> FFFSWGa </td><td> 259 </td><td> 13000 </td><td> 562 </td><td> 10000 </td></tr><tr><td> FF [Aib] Ventajas de Windows Original </td><td> 29 </td><td> 12700 </td><td> 445 </td><td> 9300 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Potencias estimado (CE 50) y la respuesta de la bioluminiscencia máximo de todos los péptidos probados en garrapatas y mosquitos receptor líneas celulares transfectadas *. * La CE 50 estimaciones de la concentración necesaria para inducir una respuesta mitad de la máxima. I: Inactivo si la respuesta de la bioluminiscencia es menos de 300 unidades (nivel de vectores, sólo las células transfectadas). R: La posición en la que ha sido el residuo correspondiente en el FFSWGa péptido reemplazado por alanina. ND: El análogo se puso a prueba, pero era o no muy activos o no activos a bajas molaridades, por tanto, un EC50 no se pudo determinar. <table border="1"><tbody><tr><td> K-AIB-1 </td><td> [Aib] FF [Aib] Ventajas de Windows Original </td></tr><tr><td> K-AIB-2 </td><td> [Α MEF] FF [Aib] Ventajas de Windows Original </td></tr><tr><td> K-AIB-3 </td><td> Ac-R [Aib] FF [Aib] Ventajas de Windows Original </td></tr><tr><td> K-AIB-4 </td><td> Ac-R [β3F] FF [Aib] Ventajas de Windows Original </td></tr><tr><td> K-AIB-5 </td><td> [Aib] RFF [Aib] Ventajas de Windows Original </td></tr><tr><td> K-AIB-6 </td><td> [AIB-AIB-AIB-Aib] RFF [Aib] Ventajas de Windows Original </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Quinina análogos (K), que contiene aminoácidos isobutírico (AIB) a prueba en la marca cinina receptor recombinante. Ac: acetilo; α Me: α metil-fenilalanina, β3F: β3-fenilalanina, un: amida.

<ol>
	<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li><li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V., Geary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mimetic+analogs+of+insect+kinin+neuropeptides+with+arthropod+receptors.">Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors.</a> Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. , (2010).</li><li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+development+of+novel+pest+management+agents+based+upon+insect+kinin+neuropeptide+analogs.">Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biostable+agonists+that+match+and/or+exceed+the+activity+of+insect+kinins+on+recombinant+arthropod+GPCRs.">Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs.</a> General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+insect+kinin+analogs+with+cis-peptide+bond,+type+VI-turn+motifs+identifies+optimal+stereochemistry+for+interaction+with+a+recombinant+arthropod+kinin+receptor+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus.">Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus.</a> Peptides. 29, 295-301 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+and+non-selective,+biostable+beta-amino+acid+agonists+of+recombinant+insect+kinin+receptors+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+and+mosquito+Aedes+aegypti.">Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti.</a> Peptides. 29, 302-309 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+and+mosquito+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li><li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins.">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).</li><li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor.">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).</li><li>Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors.">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li><li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor.">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li></ol>

Hemos sido capaces de llevar a cabo la caracterización funcional del receptor del neuropéptido descubrió por primera vez a partir de los arácnidos (garrapatas, ácaros y arañas), los receptores de cininas garrapata, usando este protocolo. Este método tiene tres aplicaciones principales. En primer lugar, la técnica se puede aplicar para deorphanization receptor a través de mediciones de la actividad del ligando. En segundo lugar, el ensayo puede resolver ligando-receptor relaciones estructura-actividad (SAR). En tercer lugar, los métodos pueden ser utilizados en el descubrimiento de fármacos. Además, este protocolo puede ser usado para estudiar la actividad de los agonistas o antagonistas en casi cualquier GPCR. Estamos comenzando a adaptar el protocolo para la detección de pequeñas bibliotecas. La línea celular se utilizó no expresa la proteína ubicua G G 16. Nosotros no lo necesitamos porque artrópodos receptores de cininas señal a través de la proteína Gq y la cascada de calcio intracelular y la conservación de las propiedades de esta señalización en células de mamíferos, como se muestra aquí.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> Células CHO-K1 </td><td> ATCC </td><td> CCL-61 </td><td> Manassas, VA, EE.UU. </td></tr><tr><td> F12K medio </td><td> Invitrogen </td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (10 veces) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> Invitrogen </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM I Reducción de medio sin suero </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Reactivo lipofectina </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticina </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663-03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep giro miniprep kit </td><td> Qiagen Inc. </td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE 6 Transfección reactivo </td><td> Roche </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 pozos fondo blanco delgada placa microtitere </td><td> Costar </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> libre de calcio DMEM los medios de comunicación </td><td> Invitrogen </td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Invitrogen </td><td> C-2944 </td><td></td></tr><tr><td> Brillante-Line hemocitómetro </td><td> Hausser Científico </td><td></td><td> Horsham, PA </td></tr><tr><td> Novostar </td><td> BMG Labtechnologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prism 4.0 </td><td> GraphPad Software Inc. </td><td></td><td> San Diego, California, EE.UU. </td></tr><tr><td> T-25 y T-75 Frascos </td><td> BD Falcon </td><td> 353014 y 353135 </td><td></td></tr></tbody></table>

a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors

Receptores de la hormona de artrópodos son objetivos potenciales de los plaguicidas novela ya que regulan muchos procesos fisiológicos y de comportamiento esencial. La mayoría de ellos pertenecen a la superfamilia de la proteína G-receptores (GPCR). Nos hemos centrado en la caracterización de los receptores de cininas artrópodos de la garrapata y el mosquito. Cininas artrópodos son neuropéptidos multifuncional con myotropic, diurético, y función de los neurotransmisores. En este caso, un método para el análisis sistemático de las relaciones estructura-actividad de las cininas insectos en dos heteróloga cinina receptor que expresan los sistemas se describe. Ofrecemos información importante y relevante para el desarrollo de análogos de bioestable quinina con el potencial de interrumpir el diurético, myotropic, y / o los procesos digestivos en las garrapatas y los mosquitos. Los receptores de cininas de la garrapata del ganado del sur, Boophilus microplus (Canestrini), y el mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), se expresan de forma estable en la línea de células de mamíferos CHO-K1. Análisis funcional de estos receptores se completaron con una placa de ensayo de bioluminiscencia de calcio que las medidas de bioluminiscencia intracelular para determinar los niveles citoplasmáticos de calcio en la aplicación de péptidos a las células recombinantes. Este método tiene la ventaja de la proteína aequorin, un photoprotein aislado de medusas luminiscentes. Estamos transfectadas transitoriamente la aequorin plásmido (mtAEQ/pcDNA1) en líneas celulares que expresan de forma estable los receptores de cininas. Estas células fueron tratadas con el coelenterazine cofactor, que los complejos con aequorin intracelular. Este vínculo se rompe en presencia de calcio, los niveles de emisión de luminiscencia indica la concentración de calcio. Como el receptor de señales de quinina a través de la liberación de calcio intracelular, la intensidad de la señal se relaciona con la potencia de los péptidos. Este protocolo es una síntesis de varios protocolos descritos anteriormente, con modificaciones, se presenta paso a paso las instrucciones para la expresión estable de GPCRs en una línea celular de mamíferos a través de los ensayos de placa funcional (Staubly et al, 2002 y establos y otros, 1997.. ). Utilizando esta metodología, hemos sido capaces de establecer líneas estables de células que expresan el mosquito y la garrapata receptores de cininas, comparar la potencia de tres cininas mosquito, identificar las posiciones de los aminoácidos fundamentales para la interacción ligando-receptor, y realizar semi-rendimiento de procesamiento de un péptido de la biblioteca. Debido a que las cininas insectos son susceptibles a la degradación rápida enzimática por peptidasas endógenas, que son muy limitados en su uso como herramientas para el control de plagas o de estudios endocrinológicos. Por lo tanto, también a prueba análogos de quinina que contiene el ácido amino isobutírico (AIB) para aumentar su potencia y bioestabilidad. Este análogo peptidasa-resistentes representa una ventaja importante en el desarrollo de análogos de la quinina bioestable insectos y puede ayudar en el desarrollo de estrategias basadas en el neuropéptido artrópodos control.

Watch this Scientific Journal Video about A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Este protocolo proporciona instrucciones para la selección clonal de las células de línea y un ensayo de bioluminiscencia de calcio para analizar las relaciones estructura-actividad de los neuropéptidos sintetizados por artrópodos en su cognado GPCRs. Este ensayo se puede utilizar para deorphanization receptor y la actividad de la estructura de los estudios de la relación para el diseño y el péptido sintético análogo / drogas provocar descubrimiento.

Un ensayo de bioluminiscencia de calcio para el análisis funcional de los Mosquitos ( Aedes aegypti) Y Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados a proteínas

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

a-calcium-bioluminescence-assay-for-functional-analysis-mosquito

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

15.5K vistas.  Texas A&M University (TAMU). Este protocolo proporciona instrucciones para la selección clonal de las células de línea y un ensayo de bioluminiscencia de calcio para analizar las relaciones estructura-actividad de los neuropéptidos sintetizados por artrópodos en su cognado GPCRs. Este ensayo se puede utilizar para deorphanization receptor y la actividad de la estructura de los estudios de la relación para el diseño y el péptido sintético análogo / drogas provocar descubrimiento.

Video: A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Un protocolo para la recolección y la tinción de los hemocitos del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Investigación

Inmunología e Infección

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

La manipulación genética en<em&gt; Δku80</em&gt; Las cepas de Análisis Genómico Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a three host tick that requires a blood meal from a vertebrate host for each development stage, and the adult females require a blood meal for reproduction. Larval ticks attach to their host for 3 - 5 days for feeding and drop off the host when fully engorged. This dependency on several different hosts and the lengthy attachment time for engorgement complicates tick rearing in the laboratory setting. However, to understand tick biology and tick-pathogen interactions, the production of healthy, laboratory-reared ticks is essential. Here, we demonstrate a simple, cost-effective protocol for immature tick feeding on mice. We modified the existing protocols for decreased stress on mice and increased tick feeding success and survival by using disposable cages without mesh bottoms to avoid contact of ticks with water contaminated with mice urine and feces.

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

The production of healthy laboratory-reared ticks is essential to studies on tick biology, and tick-pathogen interactions. Here we demonstrate a simple protocol for immature tick feeding that is cost-effective and less stressful to mice.

La cría<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; La garrapata de patas Negro: La alimentación de los estados inmaduros de ratones

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Ensayo de co-inmunoprecipitación para el estudio de las interacciones funcionales entre los receptores y enzimas

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight loss, depreciation of the animals&#39; leather and also can act as a vector of several pathogens. Due to the exorbitant costs to control these parasites, damage to the environment caused by the inappropriate use of chemical acaricides, and the increased resistance against traditional parasiticides, alternative control of ticks, by the use of entomopathogenic fungi, for example, has been considered an interesting approach. Nevertheless, few studies have demonstrated how the tick&#39;s immune system acts to fight these entomopathogens. Therefore, this protocol demonstrates two methods used for entomopathogen inoculation into engorged females and two techniques used for hemolymph collection and hemocytes harvesting. Inoculation of pathogens at the leg insertion in the tick female&#39;s body allows evaluation of females biologic parameters unlike the inoculation between the scutum and capitulum, which frequently damages Gen&#233;&#39;s organ. Dorsal hemolymph collection yielded a higher volume recovery than collection through the legs. Some limitations of tick hemolymph collection and processing include i) high rates of hemocytes&#39; disruption, ii) hemolymph contamination with disrupted midgut, and iii) low hemolymph volume recovery. When hemolymph is collected through the leg cutting, the hemolymph takes time to accumulate at the leg opening, favoring the clotting process. In addition, fewer hemocytes are obtained in the collection through the leg compared to the dorsal collection, even though the first method is considered easier to be performed. Understanding the immune response in ticks mediated by entomopathogenic agents helps to unveil their pathogenesis and develop new targets for tick control. The inoculation processes described here require very low technological resources and can be used not only to expose ticks to pathogenic microorganisms. Similarly, the collection of tick hemolymph may represent the first step for many physiological studies.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analysis of tick hemolymph represents an important source of information on how some pathogens cause disease and how ticks immunologically respond to this infection. The present study demonstrates how to inoculate fungal propagules and collect hemolymph from Rhipicephalus microplus engorged females.

Divulgar la colección hemolymph y la inoculación de Metarhizium blastosporos en las garrapatas de rhipicephalus microplus hacia los estudios de patología de invertebrados

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Propagación del parásito microsporidiano Edhazardia aedis en mosquitos Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Alimentación y cuantificación de sangre de origen animal y comidas artificiales en mosquitos Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Ensayo estándar de alimentación por membrana para la detección de la infección por Plasmodium falciparum en mosquitos vectores Anopheles

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...