Drs. PJC Grimmelikhuijzen et Michael Williamson de l&#39;Université de Copenhague (Danemark) sont appréciés pour fournir l&#39;aequorine plasmide. Notre collaborateur, le Dr Ronald J. Nachman de ARS-USDA (TX, USA), est reconnu pour la synthèse peptidique et de fournir au lecteur de plaque Novostar.

<ol>
	<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li><li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V., Geary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mimetic+analogs+of+insect+kinin+neuropeptides+with+arthropod+receptors.">Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors.</a> Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. , (2010).</li><li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+development+of+novel+pest+management+agents+based+upon+insect+kinin+neuropeptide+analogs.">Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biostable+agonists+that+match+and/or+exceed+the+activity+of+insect+kinins+on+recombinant+arthropod+GPCRs.">Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs.</a> General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+insect+kinin+analogs+with+cis-peptide+bond,+type+VI-turn+motifs+identifies+optimal+stereochemistry+for+interaction+with+a+recombinant+arthropod+kinin+receptor+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus.">Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus.</a> Peptides. 29, 295-301 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+and+non-selective,+biostable+beta-amino+acid+agonists+of+recombinant+insect+kinin+receptors+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+and+mosquito+Aedes+aegypti.">Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti.</a> Peptides. 29, 302-309 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+and+mosquito+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li><li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins.">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).</li><li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor.">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).</li><li>Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors.">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li><li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor.">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li></ol>

Nous avons été en mesure d&#39;effectuer la caractérisation fonctionnelle du récepteur neuropeptide découvert des arachnides (tiques, acariens et araignées), le récepteur kinine tique, en utilisant ce protocole. Cette méthode a trois applications principales. Tout d&#39;abord, la technique peut être appliquée pour deorphanization récepteurs grâce à des mesures d&#39;activité ligand. Deuxièmement, le dosage peut résoudre ligand-récepteur relations structure-activité (SAR). Troisièmement, les méthodes peuvent être utilisées dans la découverte de médicaments. Par ailleurs, ce protocole peut être utilisé pour étudier l&#39;activité des agonistes ou antagonistes sur presque n&#39;importe quelle RCPG. Nous commençons à adapter ce protocole pour le dépistage des petites bibliothèques. La lignée cellulaire nous avons utilisé n&#39;exprime pas la protéine ubiquitaire G G 16. Nous n&#39;avons pas besoin, car arthropodes récepteurs des kinines signal par la protéine Gq et la cascade intracellulaire de calcium et ils conserver cette propriétés de signalisation dans les cellules de mammifères, comme indiqué ici.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> Cellules CHO-K1 </td><td> ATCC </td><td> CCL-61 </td><td> Manassas, VA, USA </td></tr><tr><td> F12K moyennes </td><td> Invitrogen </td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotiques Antimycosique </td><td> Invitrogen </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM I Réduction milieu sans sérum </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Réactif Lipofectin </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> Généticine </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663-03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kit </td><td> Qiagen Inc </td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> Réactifs de transfection FuGENE 6 </td><td> Roche </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96 puits blanche fine plaque inférieure microtitere </td><td> Costar </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> sans calcium milieu DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelentérazine </td><td> Invitrogen </td><td> C-2944 </td><td></td></tr><tr><td> Bright-Ligne hémacytomètre </td><td> Hausser scientifique </td><td></td><td> Horsham, Pennsylvanie </td></tr><tr><td> Novostar </td><td> Labtechnologies BMG </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prism Software 4.0 </td><td> GraphPad Software Inc </td><td></td><td> San Diego, Californie, USA </td></tr><tr><td> T-25 et T-75 Flacons </td><td> BD Falcon </td><td> 353014 353135 et le </td><td></td></tr></tbody></table>

a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors

Récepteurs hormonaux arthropodes sont des cibles potentielles pour les pesticides roman comme ils régulent de nombreux processus essentiels physiologiques et comportementaux. La majorité d&#39;entre eux appartiennent à la superfamille des G récepteurs couplés aux protéines (RCPG). Nous nous sommes concentrés sur la caractérisation des récepteurs des kinines arthropodes de la tique et de moustiques. Kinines arthropodes sont des neuropeptides multifonctionnel avec myotropes, diurétique, et la fonction des neurotransmetteurs. Ici, une méthode pour l&#39;analyse systématique des relations structure-activité des kinines insectes sur deux hétérologue kinine exprimant le récepteur des systèmes est décrite. Nous fournissons des informations importantes relatives au développement des analogues des kinines biostable avec le potentiel de perturber le diurétique, myotropes, et / ou processus digestifs chez les tiques et les moustiques. Les récepteurs des kinines par la tique du bétail sud, Boophilus microplus (Canestrini), et le moustique Aedes aegypti (Linné), ont été exprimés de manière stable dans la lignée cellulaire de mammifère CHO-K1. Les analyses fonctionnelles de ces récepteurs ont été réalisées en utilisant un dosage du calcium plaque de bioluminescence que les mesures de bioluminescence intracellulaire afin de déterminer les niveaux de calcium cytoplasmique lors de l&#39;application de peptides à ces cellules recombinantes. Cette méthode tire parti de la protéine aequorine, une photoprotéine isolé luminescente méduses. Nous transfectées transitoirement l&#39;aequorine plasmide (mtAEQ/pcDNA1) dans des lignées cellulaires qui ont exprimé de façon stable les récepteurs des kinines. Ces cellules ont ensuite été traitées avec le cofacteur coelentérazine, qui se complexe avec l&#39;aequorine intracellulaire. Ce lien ruptures dans la présence de calcium, en émettant des niveaux de luminescence indique la concentration de calcium. Comme le récepteur de signaux kinine par la libération de calcium intracellulaire, l&#39;intensité du signal est liée à la puissance du peptide. Ce protocole est une synthèse de plusieurs protocoles décrits précédemment avec des modifications, il présente, étape par étape les instructions pour l&#39;expression stable des RCPG dans une lignée cellulaire de mammifère par le biais des tests fonctionnels plaque (Staubly et al, 2002 et Stables et al, 1997.. ). En utilisant cette méthodologie, nous avons été en mesure d&#39;établir des lignées cellulaires stables exprimant les moustiques et les récepteurs des kinines tique, comparer la puissance de trois kinines moustiques, d&#39;identifier les positions des acides aminés essentiels pour l&#39;interaction ligand-récepteur, et d&#39;effectuer de semi-criblage d&#39;un peptide bibliothèque. Parce que les kinines insectes sont sensibles à la dégradation enzymatique rapide par les peptidases endogènes, ils sont sévèrement limités dans l&#39;utilisation comme outils de lutte contre les ravageurs ou les études endocrinologiques. Par conséquent, nous avons également testé les analogues des kinines contenant de l&#39;acide aminé isobutyrique (AIB) afin d&#39;améliorer leur efficacité et biostabilité. Cet analogue peptidase-résistante représente une avance importante dans le développement de biostable analogues des kinines insectes et peut aider au développement du neuropeptide basé stratégies de contrôle des arthropodes.

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A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Ce protocole fournit des instructions pour la sélection de la lignée clonale de cellules et un dosage du calcium bioluminescence d&#39;analyser les relations structure-activité des neuropeptides synthétisés arthropodes sur leur apparenté RCPG. Ce test peut être utilisé pour deorphanization récepteurs et des études de relation structure-activité pour la conception et le peptide analogue synthétique / drogue mènent la découverte.

Un test de bioluminescence calcium pour l&#39;analyse fonctionnelle des moustiques ( Aedes aegypti) Et cochez (<emRhipicephalus> microplus) G récepteurs couplés aux protéines

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

15.5K vues.  Texas A&M University (TAMU). Ce protocole fournit des instructions pour la sélection de la lignée clonale de cellules et un dosage du calcium bioluminescence d'analyser les relations structure-activité des neuropeptides synthétisés arthropodes sur leur apparenté RCPG. Ce test peut être utilisé pour deorphanization récepteurs et des études de relation structure-activité pour la conception et le peptide analogue synthétique / drogue mènent la découverte.

Un test de bioluminescence calcium pour l'analyse fonctionnelle des moustiques ( Aedes aegypti) Et cochez ( microplus) G récepteurs couplés aux protéines