Drs. CJP Grimmelikhuijzen und Michael Williamson von der University of Copenhagen (Dänemark) sind für die Bereitstellung der Aequorin Plasmid geschätzt. Unsere Mitarbeiterin, Dr. Ronald J. Nachman von ARS-USDA (TX, USA), ist für die Peptid-Synthese und für die Bereitstellung der Novostar Plattenlesegerät anerkannt.

1. Gründung von stabilen Zelllinien <ol><li> Clone Ihrer GPCR von Interesse und legen Sie sie in einen Expressionsvektor mit eingebautem 5 &quot;Kozak-Konsensus-Sequenz (GCCA / GCCATGG) um das Startcodon für optimale ribosomalen Bindungsstellen in einem Säugetier-System (Kozak, 1986). Hier verwenden wir die Plasmid pcDNA3.1/Bm-KR für die Zecke Kinin-Rezeptor, und die Plasmid-pcDNA3.1/Aedae-KR für die Moskito-Kinin-Rezeptor (Holmes et al, 2003;. Pietrantonio et al, 2005.). Die pcDNA3.1 (-)-Vektor kodiert Ampicillinresistenz für die Selektion in Bakterien und Neomycin (G418)-Resistenz zur Selektion in Säugetierzellen. </li><li> Wachsen CHO-K1 leere Zellen (ohne Plasmide) (ATCC, Manassas, VA, USA) oder andere gewünschte Zelllinie in einem T-25-Kolben (BD Falcon) bei 37 ° C in einer 5% CO 2 befeuchteten Inkubator (Holmes et al ., 2003). Alle weiteren Inkubationen sollten unter diesen Bedingungen durchgeführt werden sofern nicht anders angegeben. Pflegen Sie die leeren Zellen in Wachstumsmedium (F12K Medium mit 10% fötalem Rinderserum) mit 1X Antibiotika-Antimykotikum (Invitrogen, CA). </li><li> Um Zellen teilen, aufzuwärmen alle Lösungen auf 37 ° C. Entfernen Sie altes Medium in den T-25 überführt und gründlich mit 5 ml PBS und entfernen Sie dann PBS. Um trypsinize Zellen, 2 ml PBS-Trypsin-EDTA (34 ml PBS, 2 ml 7,5% Natriumbicarbonat, 4 ml 10x Trypsin-EDTA) für 2 min. Add 3 ml Medium und saugen Medium nach oben und unten, um Zellen zu mischen. Transfer-Medium mit Zellen in einem konischen Rohr und zentrifugieren für 2 min bei ~ 200-300 g (1.000 rpm). Überstand verwerfen und wieder auszusetzen Zellen in 5 ml Medium. Verdünnen Sie die resuspendierten Zellen in einer Konzentration von 1:5 oder 1:10 mit frischem Medium und Transfer 5 ml in eine neue T-25 Kolben. </li><li> Nachdem die Zellen gesund wachsen (ca. 2-3 Tage), Samen der CHO-K1-Zellen in T-25 Zellkulturflaschen und wachsen sie über Nacht in Wachstumsmedium ohne Antibiotika, bis sie etwa 30% konfluent (ca. 18 Stunden). Der Grad der Konfluenz kann durch Beobachtung Zellen unter umgekehrten Fluoreszenz-Mikroskopie bestimmt werden. </li><li> Bereiten Sie die folgenden Mischungen für jede Probe: <ol><li> Kombinieren 1-2 ug DNA (Beispiel: Nutzung von 4μl 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) mit 100 ul Opti-MEM I Reduzierte Serum Medium (Invitrogen). </li><li> Mix 6 ul Lipofectin Reagent (InvitrogenTM) in 100 ul F12K serumfreiem Medium, so dass ein 1:1-Verhältnis von Lipofectin, um DNA. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30-45 min. </li></ol> Vorsichtig mischen die Lösungen von 1.5.1 mit 1.5.2 in einem Drop-weise Mode (Gesamtvolumen = 200 ul). Stehen lassen bei Raumtemperatur für 10-15 min. </li><li> Entfernen Sie die alte Wachstumsmedium von den Zellen und die Zellen mit 5 ml F12K serumfreiem Medium und entfernen Sie dann die F12K serumfreien Medium. In einem 15 ml-Tube, mischen die Transfektion Mischung in 1,8 ml frisch F12K Medium in einem Dropdown-weise Mode. Dann wusch die Zellen aus Schritt 1.5 mit PBS und stell &#39;das neue Transfektion Lösung zu den Zellen. Inkubieren für 18 Stunden. </li><li> Ändern Sie den Medium zu Medium plus 10% fötalem Rinderserum ohne Antibiotika F12K beimpft und über Nacht. Split die Zellen in zwei T-25 Flaschen mit F12K Medium plus 10% fötalem Rinderserum ohne Antibiotika für weitere 18 Stunden (für die Spaltung Zellen siehe Schritt 1.3). </li><li> Ersetzen Sie das Medium mit selektivem Medium (F12K Medium plus 10% fötalem Rinderserum mit 800μg/ml Geneticin, Invitrogen). Kultur der Zellen mit dem selektiven Medium für 3-4 Wochen. Im Laufe der Zeit wird für Zellen, die stabil das Plasmid in ihre genomische DNA integriert auszuwählen. Weiter erhalten die Zellen mit Hilfe von Wartungs-Medium (F12K Medium plus 10% fötalem Rinderserum mit 400μg/ml Geneticin). Von Zeit zu Zeit einfrieren Zelllinien mit 1:1 Verhältnis des Einfrierens Medien (selektive Medium mit 20% DMSO), um verliert im Falle eines unerwarteten Kontaminationen zu verhindern. </li><li> Die Auswahl klonalen Zelllinien: als einen ersten Schritt, trypsinize und Zentrifuge die Zellen aus Schritt 1.8 mit Wartung Medium wie in Schritt 1.3. Re-suspend-Zellen in 5 ml Medium Wartung, nehmen Sie 0,5 ml der Zelle einzustellen und fügen Sie 4,5 ml frisches Wartung mittel-bis 10-fach Verdünnung zu machen. Übertragen Sie die 10x Verdünnung in 12 Vertiefungen einer 96-Well-Platte, die Zugabe von 100 ul in jede Vertiefung für einzelne Zellen zu markieren. </li><li> Weiter zu 10x serielle Verdünnungen dieser Zellen für eine theoretische Endsuspension von einer Zelle pro 100 ul (in der Regel die letzte Verdünnung wird im Bereich von 10 -11 bis 10 -19 sein, die Gesamtzahl der 10-fach serielle Verdünnungen ist ~ 19) machen . Unmittelbar nach jeder Verdünnung, Transfer 100 ul der Verdünnung in 12 Wells der 96-Well-Platte. Nach 18 Stunden Inkubation, beobachten 96 Well-Platten unter einem inversen Licht-oder Fluoreszenz-Mikroskop und Mark Wells, die enthalten nur eine einzige Zelle enthalten oder zwei Zellen, die offensichtlich aus einer einzigen Zelle geteilt erscheinen. Halten Sie beobachten jeden Tag, und ändern Medium alle drei Tage. </li><li> Wenn der Brunnen sind 80% confluent (etwa eine Woche), spülen gekennzeichneten Vertiefungen mit 200 ul PBS und trypsinize sie mit 100 ul PBS-Trypsin-EDTA-Lösung. Transfer-Zellen aus jedem Well in eine Vertiefung einer 6-well-Platte mit 1 ml Medium Wartung markiert. Wachsen die Zellen für 3 Tage dann Transfer Zellen in einzelne T25 Kolben. Testen Sie diese Zellen unter Verwendung des Kalzium-Biolumineszenz-Assay mit Agonisten Peptide (siehe Abschnitt 2). </li><li> Wählen Sie 1 Zelllinie, die aus Schritt 1,11 mit der höchsten Resonanz in der Calcium-Biolumineszenz Platten-Assay und führen Sie ein zweites Mal die einzelne Zelle Auswahl folgende Schritte 1,9-1,11. Von Zeit zu Zeit einfrieren Zelllinien. </li><li> Von den sekundären Auswahl in Schritt 1.12 beschrieben, wählen Sie 2-3 Zellen mit der größten Resonanz in der Calcium-Biolumineszenz Platten-Assay und halten sie in der Kultur für weitere Calcium-Biolumineszenz-Assays Platte. Verfolgen Durchgang Zahlen. Von Zeit zu Zeit, freeze-Zelllinien aus frühen Passagen, so dass Sie immer wieder zurückkommen können, um sie, wenn die Zell-Linien mit mehr Passagen konsequent aufhören. </li></ol> 2. Die Calcium-Biolumineszenz Platten-Assay <ol><li> Ligieren des Reporter-Gen von Interesse in einen Expressionsvektor. Hier haben wir Aequorin Plasmid mtAEQ/pcDNA1 (ein Geschenk von Drs. CJP Grimmelikhuijzen und Michael Williamson, University of Copenhagen, Dänemark). Transform das Plasmid in E. coli-Zellen MC1061/PS (Invitrogen) und reinige sie mit einem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Inc.). In den letzten Schritt zu eluieren das Plasmid mit Tris-Puffer ohne EDTA, kein Wasser. </li><li> Wachsen Zelllinien aus Schritt 1,13 Expression des gewünschten Rezeptor in der Instandhaltung Medium. Wenn die Zellen 90% konfluent sind, trypsinize, Zentrifuge und dann wieder die Zellen in 5 ml Medium Wartung, wie in Schritt 1.3. Verdünnen Zellen (ca. 10x mit wartungsfreien medium) und zählen Zellzahl mit Zellzahl (Bright-Line Hämazytometer) unter dem Mikroskop. Passen Sie die Zellzahl auf ca. 2 x 10 5 Zellen / ml (durchschnittlich 20 Zellen in einem der 9 Quadrate zeigte sich in der Hämazytometer). Seed 2 ml verdünnt Zellen in Medien in jedes Well einer sechs-Well-Platte. Inkubationszeit von 24 Stunden (die Zellen erreichen sollte etwa 60% Konfluenz nach Inkubation). </li><li> Ändern Medien in der 6 Vertiefungen Platte OPTI-MEM-Medium. Für jeden gut mischen 96 ul OPTI-MEM mit 4 ul FuGENE 6 Transfektionsreagenz (Roche Biochemicals) in einem Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Sie sich bei Raumtemperatur für 5 min. Add 1 pg Aequorin / pcDNA 1 Plasmid-DNA in jedes Röhrchen und dann schütteln die Probe für 1 min inkubieren bei Raumtemperatur für 15-20 min. Fügen Sie jeder Mischung in jedes Well in einer tropfenweise unter leichtem Schütteln der Well-Platte. Die Inkubation für 6 Stunden und ändern Sie die mittel-bis Medium mit 10% fötalem Rinderserum ohne antibiotische F12K. </li><li> Nach Inkubation der Zellen in sechs Well-Platte für 24 Stunden, trypsinize, Zentrifuge und Resuspendieren der Zellen wie in Schritt 1.3. Zählen Sie die Zellzahl auf 400.000 Zellen / ml als Schritt 2,1 und Transfer 100 ul (insgesamt 40.000 Zellen/100 ul) in jede Vertiefung einer 96-well weißen dünnen Boden Mikrotiterplatte (Costar 3610). Inkubieren für weitere 24 Stunden bis etwa 80% Zellkonfluenz. Dies ist die optimale Konzentration von Zellen für die Biolumineszenz-Assay. </li><li> Bereiten 90μl/well einer Calcium-freiem DMEM Medium (Invitrogen) mit 5 uM Coelenterazin (Invitrogen) in den dunklen (Coelenterazin ist lichtempfindlich). Nehmen Sie die Platte von 2,4, entfernen Sie alte Medien und stell &#39;das 90μl in jede Vertiefung. Die Platten für 3 Stunden im Dunkeln bei 37 ° C und 5% CO 2, wonach die Zellen in der Platte sind bereit, getestet werden. </li></ol> 3. Gerätebedienung und Datenanalyse <ol><li> Jeder Biolumineszenz-Reader ist das anders. Wir führen unsere Tests mit einem Novostar (BMG Labtechnologies) Platten-Lesegerät in bioluminensence Modus. Wenn Sie ein anderes Instrument verwenden, müssen Sie anpassen Protokoll. </li><li> Spülen Sie die Platte Leser Pumpen (oder Prime Pumpen) vor dem Gebrauch. Schalten Sie das Licht in den Raum, bevor die Platte auf den Teller Inhaber. Sobald der Halter geschlossen hat, schalten die Lichter an. </li><li> Solubilisieren Peptide (in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen) in der Calcium-freiem DMEM-Medien. Stellen Sie die &quot;absaugen Tiefe&quot; und &quot;Positionsbestimmung&quot; der Peptid-Lösung vor dem Gebrauch. Fordern Sie die Zellen mit 10 ul (10x) mit unterschiedlichen Konzentrationen der Peptide (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, oder andere gewünschte Peptid) und beginnt sofort mit der Aufnahme der Lichtemission. Wir haben das Instrument, um die Lichtemission (465 nm) für jeden gut alle 2 Sekunden für eine Gesamtzeit von 50 Sekunden Rekord aufgestellt. </li><li> Vergewissern Sie sich, um eine positive Kontrolle wie eine aktive analoge (analog FFFSWGa verwendet wurde, Taneja-Bageshwar et al., 2009) und eine negative Kontrolle wie vector nur transfizierten Zellen enthalten. Die negative Kontrolle wird während der Datenanalyse notwendig, um die Baseline-Schwelle (siehe repräsentative Ergebnisse).Ein unabhängiger, inaktive Peptid kann auch als Negativ-Kontrolle ergänzt werden. </li><li> Nach dem Lauf abgeschlossen ist, waschen Sie das Instrument Pumpe (oder Prime Pumpen), dann legen Sie die nächste Peptid Probe. Speichern Sie Ihre Daten und waschen Sie die Pumpen wieder. </li><li> Datenverarbeitung: Übertragen Sie die Daten der Lichtemission aus jedem Well in eine Microsoft Excel-Datenblatt. </li><li> Fügen Sie die Daten aus Excel in Prism-Software 4.0 aus GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, USA). Die verschiedenen Peptid-Konzentrationen ist der X-Achse und Biolumineszenz-Einheiten ist die Y-Achse. Zur Normalisierung der Daten, Grundstück ein Protokoll-Wirkungs-Kurve. Wählen Sie eine nicht-lineare Regressionskurve Analyse (sigmoide Dosis-Wirkungs-Gleichung mit variabler Steigung) zu Konzentrations-Wirkungs-Kurven für jedes Peptid zu erhalten. Das Programm zeichnet die Werte am Ende und gibt der EC 50. </li><li> Jedes Experiment sollte mindestens drei Mal für die Datenanalyse wiederholt werden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Wenn in CHO-K1-Zellen exprimiert, verhielten sich die Mücke Aedes aegypti Kinin-Rezeptor als Multiligand Rezeptor und funktionell reagierte auf so niedrige Konzentrationen wie 1 nM der drei endogenours Aedes Kinine, Aedae Kinine 1-3, getestet einzeln mit dem Kalzium-Biolumineszenz Platten-Assay . Abbildung 1 zeigt, dass die Reihenfolge der Wirksamkeit erhalten Aedae-K-3&gt; Aedae-K-2&gt; Aedae-K-1, auf den jeweiligen EC 50-Werte von Aedae-K-3, 16.04 nM beruhte; Aedae-K- 2, 26,6 nM und Aedae-K-1, 48,85 nM, die statistisch signifikant verschieden (P &lt;0,05) (Pietrantonio et al., 2005). Wir verwendeten auch diesen Test, um festzustellen, welche Kinin Rückstände von entscheidender Bedeutung für die Kinin-Peptid-Rezeptor-Interaktion sind. Insect Kinin Peptide haben eine C-terminale Pentapeptid, dass die minimale Sequenz für die biologische Aktivität, die auch als Kern bezeichnet erforderlich ist. In Tabelle 1 wurden die Kinin Peptid Kern-Analoga als Alanin Ersatz-Serie der Core-Kinin Pentapeptid FFSWGa synthetisiert und getestet von einem Kalzium-Biolumineszenz Platten-Assay (Taneja-Bageshwar et al., 2006). Wir fanden, dass die Aminosäuren Phe 1 und Trp 4 wesentlichen für die Aktivität der Insekten Kinine für beide Rezeptoren wurden. Der Test kann auch verwendet werden, um Peptide für eine verbesserte Biostabilität konzipiert testen. Tabelle 2 zeigt die entworfen Kinin-Analoga, die Amino Isobuttersäure (Aib) auf die Zecke rekombinanten Kinin-Rezeptor und Abbildung 2 zeigt die Aktivität getestet Vergleich von sechs alpha-Amino Isobuttersäure-Analoga auf die Zecke Kinin-Rezeptor exprimierenden CHO-K1-Zelllinie durch eine Kalzium- Biolumineszenz Platten-Assay (Taneja-Bageshwar et al., 2009). Das Hexapeptid analog FFFSWGa ist für eine positive Kontrolle für Rezeptor-Aktivität aufgenommen. Die analogen FF [Aib] WGA führte aktiver als diese Hexapeptid Steuerung analog. Die analogen mit zwei Aminoisobuttersäure Ersatz, [Aib] FF [Aib] WGA wurde der stärkste der Doppel-Ersatz-Analoga getestet (Tabelle 2 und Abbildung 2). Weitere Beispiele dafür, wie dieser Test wurde und angewendet sehen Nachman und Pietantonio (2010), Nachman et al. (2009), Taneja-Bageshwar et al. (2008a) und Taneja-Bageshwar et al. (2008b). <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Schätzung von Aedes Kinine effektive Konzentration (EC 50) auf CHO-K1 E10-Zellen durch ein Kalzium-Biolumineszenz Platten-Assay. Die y-Achse in die Konzentrations-Wirkungs-Kurven von Biolumineszenz-Einheiten als Prozentsatz der maximalen Antwort für jeden beobachteten ausgedrückt wurde erhalten Peptid. Die Datenpunkte repräsentieren den Durchschnitt von sechs Wiederholungen in drei unabhängigen Experimenten. Die Balken stellen den Standardfehler. (A) Schätzung von Aedae-K1 EC 50 = 48 nM. (B) Abschätzung der Aedae-K2 EC 50 = 26 nM. (C) Schätzung von Aedae-K3 EC 50 = 16 nM. EC 50 Aedae-K3 &lt;EC 50 Aedae-K2 &lt;EC 50 Aedae-K1; P &lt;0,05. Statistische Analysen und Diagramme wurden mit dem GraphPad Prism 4.0-Software. <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Activity Vergleich von sechs alpha-Amino Isobuttersäure-Analoga auf die Zecke Kinin-Rezeptor exprimierenden CHO-K1-Zelllinie durch eine Kalzium-Biolumineszenz Platten-Assay. Die y-Achse repräsentiert Prozent maximal Biolumineszenz Einheiten für jeden analogen als Prozentsatz der Biolumineszenz bei einer Konzentration beobachtet ausgedrückt Vergleich der maximalen Resonanz bei allen Konzentrationen für jeden analogen getestet beobachtet. Statistische Analysen und Diagramme wurden mit GraphPad Prism 4.0-Software durchgeführt. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> Tick-Rezeptor-Zell-Linie </td><td colspan="2"> Mosquito-Rezeptor-Zell-Linie </td></tr&gt; <tr><td> Peptide </td><td> EC 50 (nM) </td><td > Maximal Biolumineszenz Resonanz auf 1 mM </td><td> EC 50 (nM) </td><td> Maximal Biolumineszenz Resonanz auf 1 mM </td></tr><tr><td> AFSWGa </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> Ich </td></tr><tr><td> FASWGa </td><td> 586 </td><td> 5.600 </td><td> ND </td><td> 400 </td></tr><tr><td> FFAWGa </td><td> 64 </td><td> 12.800 </td><td> 621 </td><td> 3.050 </td></tr><tr><td> FFSAGa </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> Ich </td></tr><tr><td> FFSWAa </td><td> 417 </td><td> 10.600 </td><td> 2.800 </td><td> 1.830 </td></tr><tr><td> FFSWGa </td><td> 590 </td><td> 10.800 </td><td> ND </td><td> 525 </td></tr><tr><td> FSWGa </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> Ich </td></tr><tr><td> FFSWa </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> Ich </td></tr><tr><td> FFSWG-OH </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> Ich </td></tr><tr><td> FFFSWGa </td><td> 259 </td><td> 13.000 </td><td> 562 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> FF [Aib] WGA </td><td> 29 </td><td> 12.700 </td><td> 445 </td><td> 9.300 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Geschätzte Potenzen (EC 50) und maximal Biolumineszenz Resonanz aller Peptide auf Pump und Moskito-Rezeptor transfizierten Zelllinien getestet *. * Der EC 50 Schätzungen der Konzentration erforderlich, um eine halbmaximale Antwort induzieren. I: Inaktiv, wenn Biolumineszenz Reaktion weniger als 300 Einheiten (Level of vector-only-transfizierten Zellen) ist. A: Die Position, wo der jeweilige Rückstand in das Peptid FFSWGa durch Alanin ersetzt wurde. ND: Die analogen getestet wurde, aber entweder nicht sehr aktiv oder nicht aktiv war bei niedrigeren Molaritäten, also ein EC50 konnte nicht ermittelt werden. <table border="1"><tbody><tr><td> K-Aib-1 </td><td> [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-2 </td><td> [Α MeF] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-3 </td><td> Ac-R [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-4 </td><td> Ac-R [β3F] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-5 </td><td> [Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-6 </td><td> [Aib-Aib-Aib-Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Kinin-Analoga (K), die Amino Isobuttersäure (Aib) auf die Zecke rekombinanten Kinin-Rezeptor getestet. Ac: Acetyl; α Me: α methyl-Phenylalanin; β3F: β3-Phenylalanin; a: Amid.

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors.">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li><li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor.">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li></ol>

Wir konnten die funktionelle Charakterisierung des ersten Neuropeptid-Rezeptor aus der Arachnida (Zecken, Milben und Spinnen), die Zecke Kinin-Rezeptor entdeckt durchführen, die dieses Protokoll verwenden. Diese Methode hat drei primäre Anwendungen. Erstens kann die Technik für die Rezeptor-Ligand deorphanization durch Aktivität Messungen angewendet werden. Zweitens kann der Assay-Lösung Ligand-Rezeptor-Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR). Drittens können die Methoden in der Wirkstoffforschung eingesetzt werden. Darüber hinaus kann dieses Protokoll verwendet, um die Aktivität von Agonisten oder Antagonisten an fast jedem GPCR zu studieren. Wir sind dabei, dieses Protokoll für das Screening von kleinen Bibliotheken anzupassen. Die Zelllinie wir genutzt drückt nicht die allgegenwärtige G-Protein G 16. Wir brauchten es, weil Arthropoden Kinin Rezeptoren Signal durch den Gq-Protein und die intrazellulären Calcium-Kaskade und sie erhalten diese Signalwege in Säugerzellen wie hier gezeigt.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> CHO-K1-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-61 </td><td> Manassas, VA, USA </td></tr><tr><td> F12K Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotikum </td><td> Invitrogen </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM I Reduzierte Serum Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectin Reagent </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663-03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kit </td><td> Qiagen Inc. </td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE 6 Transfektionsreagenz </td><td> Roche </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well-weißen dünnen Boden microtitere Platte </td><td> Costar </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> Calcium-freiem DMEM Medien </td><td> Invitrogen </td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelenterazin </td><td> Invitrogen </td><td> C-2944 </td><td></td></tr><tr><td> Helle-Line Hämazytometer </td><td> Hausser Scientific </td><td></td><td> Horsham, PA </td></tr><tr><td> Novostar </td><td> BMG Labtechnologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prism-Software 4.0 </td><td> GraphPad Software Inc. </td><td></td><td> San Diego, CA, USA </td></tr><tr><td> T-25 und T-75 Flaschen </td><td> BD Falcon </td><td> 353014 und 353135 </td><td></td></tr></tbody></table>

a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors

Arthropoden Hormonrezeptoren sind potentielle Ziele für neue Pestizide, wie sie viele wichtige physiologische und verhaltensbezogene Prozesse regulieren. Die meisten von ihnen gehören zu der Superfamilie der G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). Wir haben uns auf die Charakterisierung von Arthropoden Kinin Rezeptoren aus der Zecke und Moskito konzentriert. Arthropoden Kinine sind multifunktionale Neuropeptide mit myotroper, harntreibend und Neurotransmitter-Funktion. Hier wird ein Verfahren zur systematischen Analyse von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von Insekten Kinine auf zwei heterologen Kinin-Rezeptor-exprimierenden Systemen beschrieben. Wir liefern wichtige Informationen, die für die Entwicklung von biostabilen Kinin-Analoga mit dem Potenzial, das Diuretikum, myotroper und / oder Verdauungsprozesse in Zecken und Mücken stören. Die Kinin Rezeptoren aus dem südlichen Vieh tick, Boophilus microplus (Canestrini), und die Mücke Aedes aegypti (Linnaeus), waren stabil in der Säugetier-Zelllinie CHO-K1 zum Ausdruck gebracht. Funktionelle Analysen dieser Rezeptoren wurden abgeschlossen mit einem Calcium-Biolumineszenz Platten-Assay, dass die intrazelluläre Biolumineszenz Maßnahmen zur zytoplasmatischen Kalziumspiegel auf Peptid-Anwendung, um diese rekombinanten Zellen zu bestimmen. Diese Methode nutzt die Aequorin-Protein, einem Photoprotein von leuchtenden Quallen isoliert. Wir transient transfizierten die Aequorin Plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in Zelllinien, die stabil exprimiert die Kinin Rezeptoren. Diese Zellen wurden dann mit dem Cofaktor Coelenterazin, die Komplexe mit intrazellulären Aequorin behandelt. Diese Bindung bricht in Anwesenheit von Calcium, emittierende Lumineszenz Ebenen bezeichnend für die Calcium-Konzentration. Wie der Kinin-Rezeptor-Signale durch die Freisetzung von intrazellulären Calcium ist die Intensität des Signals, um die Wirksamkeit des Peptids verbunden. Dieses Protokoll ist eine Synthese aus mehreren zuvor beschriebenen Protokolle mit Modifikationen, es zeigt Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die stabile Expression von GPCRs in einer Säugetier-Zelllinie durch funktionelle Assays Platte (Staubly et al, 2002 und Stables et al, 1997.. ). Mit dieser Methode können wir stabile Zelllinien, die Mücke und die Zecke Kinin Rezeptoren herzustellen waren, vergleichen Sie die Potenz von drei Moskito Kinine, identifizieren kritische Aminosäure-Positionen für die Ligand-Rezeptor-Interaktion und führen semi-Throughput-Screening von Peptid- Bibliothek. Da Insekten Kinine anfällig für schnelle enzymatische Abbau durch endogene Peptidasen sind, sind sie stark in Verwendung als Werkzeuge für die Schädlingsbekämpfung oder endokrinologischen Studien beschränkt. Deshalb haben wir auch Kinin-Analoga, die Amino Isobuttersäure (Aib), um ihre Potenz und Biostabilität verbessern getestet. Diese Peptidase-resistenter Analog stellt einen wichtigen Vorsprung bei der Entwicklung von biostabilen Insekten Kinin-Analoga und kann bei der Entwicklung von Neuropeptid-basierte Arthropoden Regelstrategien Hilfe.

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A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die klonale-Zelllinie Auswahl und einem Calcium-Biolumineszenz-Assay, um die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von synthetisierten Arthropoden Neuropeptide auf ihren verwandten GPCRs zu analysieren. Dieser Test kann für die Rezeptor deorphanization und Struktur-Wirkungs-Beziehungen für synthetische Analog-Design-und Peptid-/ Drogen-Lead Discovery verwendet werden.

Ein Calcium Biolumineszenzassay für die funktionelle Analyse von Mosquito ( Aedes aegypti) Und Tick ( Rhipicephalus microplus) G-Protein gekoppelten Rezeptoren

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

a-calcium-bioluminescence-assay-for-functional-analysis-mosquito

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

15.5K Aufrufe.  Texas A&M University (TAMU). Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die klonale-Zelllinie Auswahl und einem Calcium-Biolumineszenz-Assay, um die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von synthetisierten Arthropoden Neuropeptide auf ihren verwandten GPCRs zu analysieren. Dieser Test kann für die Rezeptor deorphanization und Struktur-Wirkungs-Beziehungen für synthetische Analog-Design-und Peptid-/ Drogen-Lead Discovery verwendet werden.

Serie: A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Ein Protokoll für die Erfassung und Färbung Blutzellen aus dem Gelbfiebermücke Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a three host tick that requires a blood meal from a vertebrate host for each development stage, and the adult females require a blood meal for reproduction. Larval ticks attach to their host for 3 - 5 days for feeding and drop off the host when fully engorged. This dependency on several different hosts and the lengthy attachment time for engorgement complicates tick rearing in the laboratory setting. However, to understand tick biology and tick-pathogen interactions, the production of healthy, laboratory-reared ticks is essential. Here, we demonstrate a simple, cost-effective protocol for immature tick feeding on mice. We modified the existing protocols for decreased stress on mice and increased tick feeding success and survival by using disposable cages without mesh bottoms to avoid contact of ticks with water contaminated with mice urine and feces.

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

The production of healthy laboratory-reared ticks is essential to studies on tick biology, and tick-pathogen interactions. Here we demonstrate a simple protocol for immature tick feeding that is cost-effective and less stressful to mice.

Aufzucht<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; Die schwarzbeinigen Tick: Fütterung unreife Stadien auf Mäusen

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight loss, depreciation of the animals&#39; leather and also can act as a vector of several pathogens. Due to the exorbitant costs to control these parasites, damage to the environment caused by the inappropriate use of chemical acaricides, and the increased resistance against traditional parasiticides, alternative control of ticks, by the use of entomopathogenic fungi, for example, has been considered an interesting approach. Nevertheless, few studies have demonstrated how the tick&#39;s immune system acts to fight these entomopathogens. Therefore, this protocol demonstrates two methods used for entomopathogen inoculation into engorged females and two techniques used for hemolymph collection and hemocytes harvesting. Inoculation of pathogens at the leg insertion in the tick female&#39;s body allows evaluation of females biologic parameters unlike the inoculation between the scutum and capitulum, which frequently damages Gen&#233;&#39;s organ. Dorsal hemolymph collection yielded a higher volume recovery than collection through the legs. Some limitations of tick hemolymph collection and processing include i) high rates of hemocytes&#39; disruption, ii) hemolymph contamination with disrupted midgut, and iii) low hemolymph volume recovery. When hemolymph is collected through the leg cutting, the hemolymph takes time to accumulate at the leg opening, favoring the clotting process. In addition, fewer hemocytes are obtained in the collection through the leg compared to the dorsal collection, even though the first method is considered easier to be performed. Understanding the immune response in ticks mediated by entomopathogenic agents helps to unveil their pathogenesis and develop new targets for tick control. The inoculation processes described here require very low technological resources and can be used not only to expose ticks to pathogenic microorganisms. Similarly, the collection of tick hemolymph may represent the first step for many physiological studies.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analysis of tick hemolymph represents an important source of information on how some pathogens cause disease and how ticks immunologically respond to this infection. The present study demonstrates how to inoculate fungal propagules and collect hemolymph from Rhipicephalus microplus engorged females.

Die Sammlung der Häkolymphe und die Inokulation von Metarhizium-Blastospores in Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Ausbreitung des mikrosporiden Parasiten Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Fütterung und Quantifizierung von Tierblut und künstlichen Mahlzeiten in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Standard-Membran-Fütterungstest zum Nachweis von Plasmodium falciparum-Infektionen in Anopheles-Mückenvektoren

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...