Drs. CJP Grimmelikhuijzen e Michael Williamson da Universidade de Copenhague (Dinamarca), são apreciados por fornecer a aequorin plasmídeo. Nosso colaborador, o Dr. Ronald J. Nachman da ARS-USDA (TX, EUA), é reconhecido para a síntese peptídica e para fornecer o leitor de placas Novostar.

1. Estabelecimento de linhagens celulares estáveis <ol><li> Clone o seu GPCR de interesse e inseri-lo em um vetor de expressão que incorpora a 5 &#39;seqüência de consenso Kozak (AGAC / GCCATGG) em torno do códon de iniciação para a ligação ribossomal ideal em um sistema de mamíferos (Kozak, 1986). Aqui usamos o pcDNA3.1/Bm-KR plasmídeo para o receptor de cinina carrapato, eo pcDNA3.1/Aedae-KR plasmídeo para o receptor de cinina mosquito (Holmes et al, 2003;. Pietrantonio et al, 2005).. O pcDNA3.1 (-) vetor codifica resistência à ampicilina para seleção de bactérias e resistência a neomicina (G418) para seleção em células de mamíferos. </li><li> Crescer CHO-K1 células vazias (sem plasmídeos) (ATCC, Manassas, VA, EUA) ou linha de outra célula desejada em um frasco de T-25 (BD Falcon) a 37 ° C em 5% incubadora de CO 2 umidificado (Holmes et al ., 2003). Todas as incubações devem ser feitos sob estas condições, a menos que especificado em contrário. Manter as células vazias no meio de crescimento (F12K média com 10% de soro fetal bovino) com 1X antibióticos antimicótica (Invitrogen, CA). </li><li> Para dividir células, aquecer todas as soluções a 37 ° C. Remova o meio de idade no frasco T-25 e enxágüe com 5 ml de PBS e remova PBS. Para trypsinize células, adicionar 2 ml PBS-Tripsina-EDTA (34 ml PBS, 2 ml de bicarbonato de sódio 7,5%, 4 ml 10X de tripsina-EDTA) por 2 min. Adicionar 3 ml de meio e aspirado médio cima e para baixo para misturar células. Transferência média com células em um tubo cônico e centrifugar por 2 min a ~ 200-300 g (1.000 rpm). Elimine o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio. Diluir as células ressuspendidas a uma concentração de 1:5 ou 1:10 com meio fresco e transferir 5 ml em um frasco de T-25 novo. </li><li> Depois que as células estão crescendo de forma saudável (cerca de 2-3 dias), a semente da células CHO-K1 em T-25 frascos de cultura de tecidos e cultivá-las durante a noite em meio de crescimento sem antibióticos até que sejam confluentes cerca de 30% (aproximadamente 18 horas). O grau de confluência pode ser determinada por células observação sob microscopia fluorescente invertido. </li><li> Prepare as misturas a seguir para cada amostra: <ol><li> Combine 1-2 mg DNA (exemplo: uso de 4μl 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) com 100 ul Opti-MEM eu Redução Médio de soro (Invitrogen). </li><li> Mix 6 Reagente Lipofectin mL (InvitrogenTM) em 100 ml de soro médio F12K livre, fazendo uma proporção de 1:1 de Lipofectin de DNA. Incubar à temperatura ambiente por 30-45 min. </li></ol> Misture suavemente as soluções de 1.5.1 com 1.5.2 de uma forma gota a gota, (volume total = mL 200). Deixe descansar em temperatura ambiente por 10-15 min. </li><li> Remova o meio de crescimento das células velhas e lavar as células com 5 ml de soro médio F12K livre e, em seguida, remover o F12K meio isento de soro. Em um tubo de 15 ml, misture delicadamente a mistura de transfecção em 1,8 ml de meio fresco F12K de forma gota a gota. Depois, lavou as células a partir do passo 1.5 com PBS e adicione esta solução de transfecção nova para as células. Incubar por 18 horas. </li><li> Mudança a médio e F12K médio mais 10% de soro fetal bovino sem antibióticos e incubar durante a noite. Dividir as células em duas T-25 frascos com F12K média mais 10% de soro fetal bovino sem antibióticos por mais 18 horas (para divisão de células por favor, veja o passo 1.3). </li><li> Substituir o meio com meio seletivo (F12K média mais 10% de soro fetal bovino com 800μg/ml GENETICIN, Invitrogen). Cultura as células usando o meio seletivo para 3-4 semanas. Com o tempo isso vai selecionar para células que têm incorporados de forma estável o plasmídeo em seu DNA genômico. Continue mantendo as células usando meio de manutenção (F12K média mais 10% de soro fetal bovino com 400μg/ml GENETICIN). Periodicamente congelar linhas celulares com relação 1:1 dos meios de comunicação de congelamento (meio seletivo com DMSO 20%) para evitar perde em caso de contaminação inesperado. </li><li> Seleção de linhagens de células clonais: como um primeiro passo, trypsinize e centrifugar as células a partir da etapa com 1,8 meio de manutenção como no passo 1.3. Re-suspender as células em meio de manutenção 5 ml, tomar 0,5 ml da célula suspender e adicionar 4,5 ml de meio de manutenção fresco para obter uma diluição de 10x. Transferir a diluição 10x em 12 poços de uma placa de 96 poços, acrescentando 100 ml a cada poço selecionar para células individuais. </li><li> Continuar a fazer 10x diluições em série destas células para uma suspensão teórico final de uma célula por 100 l (normalmente a diluição final será na faixa de 10 -11 a 10 -19; o número total de 10x diluições em série é ~ 19) . Imediatamente após cada diluição, transferir 100 ml da diluição em 12 poços da placa de 96 poços. Após 18 horas de incubação, observar 96 placas bem sob uma luz invertida ou poços de fluorescência microscópio e marca que parece conter apenas uma única célula ou células que contêm dois obviamente dividido de uma única célula. Mantenha observando todos os dias e meio mudam a cada três dias. </li><li> Quando os poços são conflu 80%diferentes (cerca de uma semana), lavar os poços marcados com 200 mL PBS e trypsinize-los com 100 ul de PBS-tripsina-EDTA solução. Transferência de células de cada um marcado bem em um poço de uma placa 6-bem com um meio de manutenção ml. Cultivar essas células para três dias depois transferir células em frasco T25 individual. Testar essas células utilizando o ensaio de bioluminescência de cálcio com peptídeos agonistas (ver secção 2). </li><li> Selecione uma linha de células a partir do passo 1,11 com a maior resposta no ensaio placa de cálcio bioluminescência e realizar pela segunda vez a única célula fases de selecção seguintes 1,9-1,11. Periodicamente congelar as linhagens celulares. </li><li> Da seleção secundário descrito no passo 1.12, escolher 2-3 linhagens de células com maior resposta no ensaio placa de cálcio bioluminescência e mantê-las em cultura por mais de cálcio ensaios placa de bioluminescência. Acompanhe os números passagem. De tempos em tempos, congelar linhas celulares de passagens cedo de modo que você pode sempre voltar a eles se as linhas de células com passagens mais parar de executar de forma consistente. </li></ol> 2. O cálcio ensaio de placa bioluminescência <ol><li> Ligadura do gene repórter de interesse em um vetor de expressão. Aqui usamos aequorin mtAEQ/pcDNA1 plasmídeo (um presente de drs. CJP Grimmelikhuijzen Williamson e Michael, University of Copenhagen, Dinamarca). Transformar o plasmídeo em E. coli MC1061/PS células (Invitrogen) e purificá-los através de um spin-QIAprep miniprep kit (Qiagen Inc.). Na etapa final eluir o plasmídeo com tampão Tris sem EDTA, e não água. </li><li> Crescer linhas celulares a partir do passo 1,13 expressando o receptor desejado no meio de manutenção. Quando as células são 90% confluentes, trypsinize, centrífuga e então re-suspender as células em 5 ml meio de manutenção como no passo 1.3. Diluir células (cerca de 10x com meio de manutenção) e contagem do número de células com células contra (Bright-Line hemocitômetro) sob microscopia. Ajustar o número de células de aproximadamente 2 x 10 5 células / ml (média de 20 células em um dos 9 quadrados mostrou no hemocitômetro). Células de semente 2 ml diluído em media em cada poço de uma placa de seis também. Incubar por 24 horas (as células devem atingir cerca de 60% após a confluência de incubação). </li><li> Mudança de mídia na placa de poços de 6 a OPTI-MEM médio. Para cada bem, misture 96 mL OPTI-MEM com 4 mL de reagente Transfection FuGENE 6 (Bioquímicos Roche) em um tubo de microcentrífuga e deixe descansar em temperatura ambiente por 5 min. Adicionar 1 mg de aequorin / pcDNA um plasmídeo de DNA para cada tubo e, em seguida, agite a amostra por 1 min, incubar em temperatura ambiente por 15-20 minutos. Adicione cada mistura em cada poço de uma forma gota a gota enquanto agitando o prato também. Incubar as placas durante 6 horas e mudar a médio e F12K meio contendo 10% de soro fetal bovino sem antibiótico. </li><li> Após incubar as células em seis placa assim por 24 horas, trypsinize, centrífuga e re-suspender as células como no passo 1.3. Conte o número de células de 400.000 células / ml como passo 2.1 e transferência de 100 l (40.000 mL cells/100 total) em cada poço de um 96-bem fina placa de fundo branco de microtitulação (Costar 3610). Incubar por mais 24 horas até cerca de 80% confluência celular. Esta é a melhor concentração de células para o ensaio de bioluminescência. </li><li> Prepare 90μl/well de um livre de cálcio media DMEM (Invitrogen) contendo 5 mM celenterazina (Invitrogen) no escuro (celenterazina é sensível à luz). Pegue a placa de 2,4, remover a velha mídia e adicione este 90μl em cada poço. Incubar as placas por 3 horas no escuro a 37 ° C e 5% CO 2, após o qual as células do prato está pronto para ser testado. </li></ol> 3. Operação do instrumento e análise de dados <ol><li> Cada leitor de placas bioluminescência é diferente. Realizamos o nosso ensaio utilizando um leitor de placas Novostar (Labtechnologies BMG) no modo bioluminensence. Se você usa um instrumento diferente, você deve se adaptar ao protocolo. </li><li> Purgar as bombas leitor de placas (ou BOMBAS PRIME) antes de usar. Desligue a luz no quarto antes de colocar a placa no suporte da placa. Uma vez que o suporte da placa foi fechada, acender as luzes. </li><li> Solubilizar peptídeos (em um tubo Eppendorf de 1,5 ml) na mídia sem cálcio DMEM. Definir a &quot;profundidade Aspirar&quot; e &quot;Determinação de posição&quot; da solução de peptídeo antes de usar. Desafio as células com 10 ml (10x), com diferentes concentrações de peptídeos (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, ou peptídeo desejado outros) e imediatamente começar a gravar a emissão de luz. Criámos o instrumento para registrar a emissão de luz (465 nm) para cada poço a cada 2 segundos para um tempo total de 50 segundos. </li><li> Certifique-se incluir um controlo positivo, como um análogo ativo (analógico FFFSWGa tem sido utilizado, Taneja-Bageshwar et al., 2009) e um controle negativo, como as células transfectadas único vetor. O controle negativo será necessário na análise dos dados para definir o limiar de referência (ver resultados representativos).Um peptídeo, sem relação inativos também pode ser adicionado como um controle negativo. </li><li> Após a corrida terminar, lave a bomba de instrumento (ou BOMBAS PRIME) em seguida, coloque a sua amostra peptídeo seguinte. Salvar seus dados e lavar as bombas novamente. </li><li> Manipulação de dados: transferência dos dados de emissão de luz de cada poço em uma folha de dados do Microsoft Excel. </li><li> Colar os dados do Excel para o software 4.0 do Prisma GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, EUA). As concentrações de peptídeo vários é o eixo X e unidades de bioluminescência é o eixo Y. Para normalizar os dados, traçar uma curva log-resposta. Selecione um não-lineares de regressão análise do ajuste da curva (equação sigmoidal dose-resposta com inclinação variável) para obter curvas concentração-resposta para cada peptídeo. O programa plota os valores no final e dá a EC 50. </li><li> Cada experimento deve ser repetido três vezes para análise de dados. </li></ol> 4. Resultados representativos: Quando expressa em células CHO-K1, o mosquito Aedes aegypti receptor de cininas comportou-se como um receptor multiligand e funcionalmente respondeu a concentrações tão baixas como 1 nM dos três endogenours Aedes cininas, Aedae cininas 1-3, testados individualmente usando o ensaio de cálcio placa bioluminescência . A Figura 1 mostra que a ordem de classificação de potência obtido foi Aedae-K-3&gt; Aedae-K-2&gt; Aedae-K-1, com base nos respectivos valores de CE 50 de 3-Aedae-K, 16,04 nM; Aedae-K- 2, 26,6 nM e Aedae-K-1, 48,85 nM, que foram estatisticamente diferentes (P &lt;0,05) (Pietrantonio et al., 2005). Nós também usamos este teste para determinar quais os resíduos de cininas são fundamentais para a interação peptídeo-receptor de cininas. Peptídeos inseto cinina compartilhar uma pentapeptide C-terminal que representa a seqüência mínima exigida para a atividade biológica, também conhecido como core. Na Tabela 1, os análogos núcleo cinina peptídeo foram sintetizados como uma série de substituição da alanina cinina núcleo pentapeptide FFSWGa e testados por um ensaio de placa de cálcio bioluminescência (Taneja-Bageshwar et al., 2006). Descobrimos que os aminoácidos Phe 1 e Trp 4 foram essenciais para a atividade do cininas inseto para ambos os receptores. O ensaio também pode ser usado para testar peptídeos projetado para Biostability reforçada. A Tabela 2 mostra os análogos projetados cinina contendo ácido isobutírico amino (AIB) sobre o carrapato testado receptor recombinante cininas e Figura 2 mostra a comparação da atividade de seis alfa-amino ácido isobutírico análogos no receptor de cininas carrapato expressar CHO-K1 linha celular por um de cálcio ensaio de bioluminescência placa (Taneja-Bageshwar et al., 2009). O hexapeptide analógico FFFSWGa é adicionada para um controle positivo para a atividade do receptor. O analógico FF [Aib] WGA resultou mais ativo do que este controle analógico hexapeptide. O analógico com duas substituições de ácido aminoisobutyric, [Aib] FF [Aib] WGA, foi o mais potente dos análogos substituição dupla testados (Tabela 2 e Figura 2). Para mais exemplos de como este ensaio tem sido e pode ser aplicado ver Nachman e Pietantonio (2010), Nachman et al. (2009), Taneja-Bageshwar et al. (2008a), e Taneja-Bageshwar et al. (2008b). <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Estimativa do Aedes cininas concentração efetiva (EC 50) em células CHO-K1 E10 por um ensaio de placa de cálcio bioluminescência. O eixo y das curvas de concentração-resposta foi obtido a partir de unidades de bioluminescência, expressa em percentagem da resposta máxima observada para cada peptídeo. Pontos de dados representam a média de seis repetições obtidas durante três experimentos independentes. Barras representam o erro padrão. (A) Estimativa da Aedae-K1 EC 50 = 48 nM. (B) Estimativa da Aedae-K2 EC 50 = 26 nM. (C) Estimativa da Aedae-K3 EC 50 = 16 nM. EC 50 Aedae-K3 &lt;EC 50 Aedae-K2 &lt;EC 50 Aedae-K1; P &lt;0,05. Análise estatística e gráficos foram com o software GraphPad Prism 4.0. <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Comparação da atividade de seis alfa-amino ácido isobutírico análogos no receptor de cininas carrapato expressar CHO-K1 linha celular por um ensaio de placa de cálcio bioluminescência. O eixo y representa unidades por cento máxima bioluminescência para cada analógico, expresso em percentagem de bioluminescência observada na concentração versus a resposta máxima observada entre todas as concentrações testadas para cada analógico. Análise estatística e gráficos foram realizados com o software GraphPad Prism 4.0. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> Tick ​​linha celular receptor </td><td colspan="2"> Mosquito linha celular receptor </td></tr&gt; <tr><td> Peptídeos </td><td> EC 50 (nM) </td><td > Bioluminescência resposta máxima em 1 mM </td><td> EC 50 (nM) </td><td> Bioluminescência resposta máxima em 1 mM </td></tr><tr><td> AFSWGa </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td></tr><tr><td> FASWGa </td><td> 586 </td><td> 5600 </td><td> ND </td><td> 400 </td></tr><tr><td> FFAWGa </td><td> 64 </td><td> 12800 </td><td> 621 </td><td> 3050 </td></tr><tr><td> FFSAGa </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td></tr><tr><td> FFSWAa </td><td> 417 </td><td> 10600 </td><td> 2800 </td><td> 1830 </td></tr><tr><td> FFSWGa </td><td> 590 </td><td> 10800 </td><td> ND </td><td> 525 </td></tr><tr><td> FSWGa </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td></tr><tr><td> FFSWa </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td></tr><tr><td> FFSWG-OH </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td><td> Eu </td></tr><tr><td> FFFSWGa </td><td> 259 </td><td> 13000 </td><td> 562 </td><td> 10000 </td></tr><tr><td> FF [Aib] WGA </td><td> 29 </td><td> 12700 </td><td> 445 </td><td> 9300 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Potências estimado (EC 50) ea resposta bioluminescência máxima de todos os peptídeos testado em escala e receptor mosquito linhagens de células transfectadas *. * A EC 50 estimativas da concentração necessária para induzir uma resposta meia-máxima. I: Inactive, se a resposta bioluminescência é inferior a 300 unidades (nível de vetor somente células transfectadas). R: A posição onde o resíduo na respectiva FFSWGa peptídeo foi substituído por alanina. ND: O analógico foi testado, mas era ou não muito ativo ou não ativo em molarities inferior, portanto, uma EC50 não pôde ser determinado. <table border="1"><tbody><tr><td> K-Aib-1 </td><td> [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-2 </td><td> [Α MEF] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-3 </td><td> Ac-R [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-4 </td><td> Ac-R [β3F] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-5 </td><td> [Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-6 </td><td> [Aib-Aib-Aib-Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Cinina análogos (K) contendo ácido isobutírico amino (AIB) sobre o carrapato testado receptor recombinante cininas. Ac: acetil; α Me: α metil-fenilalanina; β3F: β3-fenilalanina, um: amida.

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	<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li><li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V., Geary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mimetic+analogs+of+insect+kinin+neuropeptides+with+arthropod+receptors.">Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors.</a> Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. , (2010).</li><li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+and+mosquito+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li><li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Fomos capazes de realizar a caracterização funcional do receptor de neuropeptídeo descoberto pela primeira vez desde o Arachnida (carrapatos, ácaros e aranhas), o receptor de cininas carrapato, usando esse protocolo. Este método tem três aplicações principais. Primeiro, a técnica pode ser aplicada para deorphanization receptor através de medições de atividade ligante. Segundo, o ensaio pode resolver ligante-receptor relações estrutura-actividade (SAR). Em terceiro lugar, os métodos podem ser usados ​​na descoberta de medicamentos. Além disso, este protocolo pode ser usado para estudar a atividade de agonistas ou antagonistas em quase qualquer GPCR. Estamos começando a adaptar este protocolo para triagem de pequenas bibliotecas. A linhagem celular utilizamos não expressam a proteína G onipresente G 16. Nós não precisamos, porque os receptores de cininas artrópodes sinal através da proteína Gq e da cascata de cálcio intracelular e conservar este propriedades de sinalização em células de mamíferos, como mostrado aqui.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> Células CHO-K1 </td><td> ATCC </td><td> CCL-61 </td><td> Manassas, VA, EUA </td></tr><tr><td> F12K médio </td><td> Invitrogen </td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiótico antimicótico </td><td> Invitrogen </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM eu Redução Médio Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Reagente Lipofectin </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> GENETICIN </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663-03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep rodada miniprep kit </td><td> Qiagen Inc. </td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE reagente Transfection 6 </td><td> Roche </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 poços da placa microtitere branca fina fundo </td><td> Costar </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> sem cálcio DMEM media </td><td> Invitrogen </td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td> Celenterazina </td><td> Invitrogen </td><td> C-2944 </td><td></td></tr><tr><td> Brilhante-Line hemacitómetro </td><td> Hausser Scientific </td><td></td><td> Horsham, PA </td></tr><tr><td> Novostar </td><td> Labtechnologies BMG </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prism software 4.0 </td><td> GraphPad Software Inc. </td><td></td><td> San Diego, CA, EUA </td></tr><tr><td> T-25 e T-75 Frascos </td><td> BD Falcon </td><td> 353014 e 353135 </td><td></td></tr></tbody></table>

a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors

Receptores hormonais artrópodes são alvos potenciais para pesticidas romance como eles regulam muitos processos essenciais fisiológicas e comportamentais. A maioria deles pertence à superfamília dos G receptores acoplados à proteína (GPCRs). Nós nos concentramos na caracterização de artrópodes receptores de cininas do carrapato e do mosquito. Cininas artrópodes são neuropeptídeos multifuncional com myotropic, diurético, ea função dos neurotransmissores. Aqui, um método para análises sistemáticas de relações estrutura-actividade de cininas insetos em dois heteróloga cinina receptor-expressando sistemas é descrito. Nós fornecemos informações importantes para o desenvolvimento de análogos biostable cinina com o potencial de interromper o diurético, myotropic, e / ou os processos digestivos em carrapatos e mosquitos. Os receptores de cininas do carrapato bovino do sul, Boophilus microplus (Canestrini), e do mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), foram expressos de forma estável na linha de células de mamíferos CHO-K1. Análise funcional desses receptores foram concluídas usando um ensaio de cálcio placa bioluminescência que mede a bioluminescência para determinar os níveis intracelulares de cálcio citoplasmático a pedido peptídeo a essas células recombinantes. Este método tira vantagem da proteína aequorin, um fotoproteína isolado luminescentes água-viva. Nós transitoriamente transfectadas o aequorin plasmídeo (mtAEQ/pcDNA1) em linhagens de células que expressa de maneira estável os receptores de cininas. Essas células foram então tratadas com o celenterazina cofactor, que complexos com aequorin intracelular. Este vínculo quebra na presença de cálcio, emitindo níveis de luminescência indicativo da concentração de cálcio. Como o receptor de cininas sinais através da liberação de cálcio intracelular, a intensidade do sinal está relacionado com a potência do peptídeo. Este protocolo é uma síntese de vários protocolos descritos anteriormente, com modificações, que apresenta passo-a-passo para a expressão estável de GPCRs em uma linha de células de mamíferos através de ensaios placa funcional (Staubly et al, 2002 e Stables et al, 1997.. ). Usando esta metodologia, nós fomos capazes de estabelecer linhas de células estáveis ​​expressando o mosquito e os receptores de cininas carrapato, compare a potência de três cininas mosquito, identificar crítica posições de aminoácidos para a interação ligante-receptor, e executar semi-throughput screening de um peptídeo biblioteca. Porque cininas insetos são suscetíveis à degradação enzimática rápida por peptidases endógenas, eles são severamente limitados em uso como ferramentas para controle de pragas ou estudos endocrinológicos. Portanto, nós também testou análogos cinina contendo ácido isobutírico amino (AIB) para aumentar a sua potência e Biostability. Este analógico peptidase-resistentes representa uma vantagem importante no desenvolvimento de análogos biostable cinina de insetos e pode ajudar no desenvolvimento de neuropeptídeo baseado estratégias de controle de artrópodes.

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A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Este protocolo fornece instruções para clonal de células de seleção de linha e um ensaio de bioluminescência de cálcio para analisar as relações estrutura-atividade de síntese neuropeptídeos de artrópodes em seus cognatos GPCRs. Este ensaio pode ser usado para deorphanization receptor e estudos de relação estrutura-atividade para o projeto análogo sintético e peptídeo / drogas lead-descoberta.

Um Ensaio Bioluminescência Cálcio de análise funcional do Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados à proteína

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

a-calcium-bioluminescence-assay-for-functional-analysis-mosquito

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

15.5K visualizações.  Texas A&M University (TAMU). Este protocolo fornece instruções para clonal de células de seleção de linha e um ensaio de bioluminescência de cálcio para analisar as relações estrutura-atividade de síntese neuropeptídeos de artrópodes em seus cognatos GPCRs. Este ensaio pode ser usado para deorphanization receptor e estudos de relação estrutura-atividade para o projeto análogo sintético e peptídeo / drogas lead-descoberta.

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A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Um Protocolo de Coleta e coloração Hemócitos do mosquito da febre amarela Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Imunologia e Infecção

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Manipulação genética em<em&gt; Δku80</em&gt; Cepas para Análise Genômica Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a three host tick that requires a blood meal from a vertebrate host for each development stage, and the adult females require a blood meal for reproduction. Larval ticks attach to their host for 3 - 5 days for feeding and drop off the host when fully engorged. This dependency on several different hosts and the lengthy attachment time for engorgement complicates tick rearing in the laboratory setting. However, to understand tick biology and tick-pathogen interactions, the production of healthy, laboratory-reared ticks is essential. Here, we demonstrate a simple, cost-effective protocol for immature tick feeding on mice. We modified the existing protocols for decreased stress on mice and increased tick feeding success and survival by using disposable cages without mesh bottoms to avoid contact of ticks with water contaminated with mice urine and feces.

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

The production of healthy laboratory-reared ticks is essential to studies on tick biology, and tick-pathogen interactions. Here we demonstrate a simple protocol for immature tick feeding that is cost-effective and less stressful to mice.

Criação<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; O Ticked Black-legged: Alimentando estágios imaturos em ratos

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Ensaio de adesão dinâmico para a análise funcional das terapias antiaderência na doença inflamatória intestinal

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-imunoprecipitação ensaio para estudar interações funcionais entre receptores e enzimas

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight loss, depreciation of the animals&#39; leather and also can act as a vector of several pathogens. Due to the exorbitant costs to control these parasites, damage to the environment caused by the inappropriate use of chemical acaricides, and the increased resistance against traditional parasiticides, alternative control of ticks, by the use of entomopathogenic fungi, for example, has been considered an interesting approach. Nevertheless, few studies have demonstrated how the tick&#39;s immune system acts to fight these entomopathogens. Therefore, this protocol demonstrates two methods used for entomopathogen inoculation into engorged females and two techniques used for hemolymph collection and hemocytes harvesting. Inoculation of pathogens at the leg insertion in the tick female&#39;s body allows evaluation of females biologic parameters unlike the inoculation between the scutum and capitulum, which frequently damages Gen&#233;&#39;s organ. Dorsal hemolymph collection yielded a higher volume recovery than collection through the legs. Some limitations of tick hemolymph collection and processing include i) high rates of hemocytes&#39; disruption, ii) hemolymph contamination with disrupted midgut, and iii) low hemolymph volume recovery. When hemolymph is collected through the leg cutting, the hemolymph takes time to accumulate at the leg opening, favoring the clotting process. In addition, fewer hemocytes are obtained in the collection through the leg compared to the dorsal collection, even though the first method is considered easier to be performed. Understanding the immune response in ticks mediated by entomopathogenic agents helps to unveil their pathogenesis and develop new targets for tick control. The inoculation processes described here require very low technological resources and can be used not only to expose ticks to pathogenic microorganisms. Similarly, the collection of tick hemolymph may represent the first step for many physiological studies.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analysis of tick hemolymph represents an important source of information on how some pathogens cause disease and how ticks immunologically respond to this infection. The present study demonstrates how to inoculate fungal propagules and collect hemolymph from Rhipicephalus microplus engorged females.

Divulgando a coleta de Hemolinfas e a inoculação de blastósporos de Metarhizium em carrapatos de Rhipicephalus MICROPLUS para estudos de patologia de invertebrados

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Propagação do Parasita Microsporidiano Edhazardia aedis em Mosquitos Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Alimentação e quantificação de sangue derivados de animais e refeições artificiais em mosquitos Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Ensaio padrão de alimentação de membrana para a detecção de infecção por plasmodium falciparum em Vetores de Mosquito Anopheles

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...