Queremos agradecer a los Dres. Ping Zhu y Koyama Susumu por su ayuda durante la configuración inicial de la técnica, y la Dra. Verónica Alvarez de asistencia en el formato del manuscrito. Este estudio fue financiado por la División de Investigación Intramural clínica y biomédica de NIAAA.

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	<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+potentiates+gabaergic+synaptic+transmission+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala.">Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).</li><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+endocannabinoid+signaling+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala.">Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).</li><li>Akaike, N., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques:+Applications+of+the+nerve-bouton+preparation+in+neuropharmacology.">Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology.</a> Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).</li><li>Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+stimulation+of+single+gabaergic+presynaptic+boutons+on+the+rat+hippocampal+neuron.">Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron.</a> Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).</li><li>Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+glycine+receptors+on+gabaergic+terminals+facilitate+discharge+of+dopaminergic+neurons+in+ventral+tegmental+area.">Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area.</a> J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).</li><li>Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+5-ht3+receptor-mediated+modulation+of+synaptic+gaba+release+in+the+mechanically+dissociated+rat+amygdala+neurons.">Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons.</a> J Physiol. 529, 373-383 (2000).</li><li>Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+enhances+glutamate+transmission+by+retrograde+dopamine+signaling+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+the+ventral+tegmental+area.">Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).</li><li>Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+subtypes+on+single+gabaergic+presynaptic+terminal+projecting+to+rat+hippocampal+neurons.">Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons.</a> Brain Res. 951, 121-129 (2002).</li><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+synaptic+activity+produces+long-lasting+enhancement+of+endocannabinoid+modulation+and+alters+long-term+synaptic+plasticity.">Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity.</a> J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).</li><li>Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+contribute+to+metabotropic+glutamate+receptor-mediated+inhibition+of+gaba+release+onto+hippocampal+ca3+pyramidal+neurons+in+an+isolated+neuron/bouton+preparation.">Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation.</a> Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptophluorin.">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).</li></ol>

Vibrodissociation requiere que las rebanadas contienen las neuronas sanas y que los espacios intersticiales son lo suficientemente flexibles para permitir a las neuronas para salir de la corte sin daño tóxico. Por lo tanto, la técnica funciona de manera óptima en las primeras edades posnatales (P1-21) cuando rebanadas sano se puede hacer con menos material gliales / interstiatial que se encuentra en rodajas de cerebro de un adulto. En nuestra experiencia, sin embargo, la optimización de la preparación de división para la supervivencia neuronal en el corte en sí mismo puede ser contraproducente para la técnica de vibrodissociation. Mientras que de manera rutinaria para preparar cortes en la grabación in situ utilizando LCRa frío modificada en la que la sacarosa se ​​ha sustituido por la mayor parte del Na + extracelular y Ca 2 +, rebanadas preparado para vibrodissociation se puede preparar (por ejemplo, corte) en nuestro LCRa grabación normal. En la preparación de cortes para la grabación de las neuronas individuales en los mismos cortes que también ponga las rebanadas en ACSF normal a 35 ° C justo después de la sección y se dejan durante 30-60 min a esta temperatura antes de devolverlos a temperatura ambiente. Sin embargo, las rebanadas preparado para vibrodissociation se trasladó inmediatamente a temperatura ambiente justo después de cortar. Estos procedimientos proporcionan un mayor rendimiento de las neuronas sanas después de vibrodissociation, quizás debido a la falta de tejido firme intersticial que permite que las neuronas sean más fácilmente sacudido de la misma rebanada. No hemos examinado exhaustivamente las condiciones de corte de preparación, ya que habitualmente obtienen las neuronas suficientes para nuestra grabación y experimentos de imagen en un día determinado. Es posible que las modificaciones adicionales, tales como cambios en el grosor de corte o procedimientos preincubaton, se podría hacer para aumentar el rendimiento de las neuronas sanas. Tratamientos de la proteasa muy leves han sido probados en un esfuerzo por aumentar el rendimiento celular y obtener la técnica para trabajar en los animales más viejos. Sin embargo, invariablemente, incluso el tratamiento de la proteasa leve parece alterar la función sináptica. Así, mientras que la combinación de la proteasa y la disociación mecánica todavía se pueden encontrar para trabajar, no ha demostrado ser fiable en las neuronas del cerebro anterior a la fecha. También debe tenerse en cuenta el rendimiento relativamente bajo de las neuronas sanas después de vibrodissociation significa que la técnica es especialmente útil para el estudio de abundante subtipos neuronales, principalmente las neuronas de proyección. La disponibilidad de las buenas prácticas agrarias-que expresa los ratones en los que pequeñas subpoblaciones neuronales pueden ser fácilmente identificados aumenta la posibilidad de estudiar estas neuronas más raro. Sin embargo, a menos que el rendimiento neuronal se puede mejorar sustancialmente la acumulación de datos sobre estas neuronas es probable que sea relativamente lenta. Varias medidas han demostrado ser crucial para el éxito de carga de las neuronas sensibles al calcio con colorantes. La exposición a la PM-esterificados tinte se realiza a 37 ° C, y que no han tenido éxito al tratar de colorante de carga a temperaturas más bajas. La concentración de los colorantes deben ser optimizados teniendo en cuenta tanto el tiempo de carga y la temperatura, ya que parece que la mayor concentración de colorante de carga reduce la concentración de calcio en el boutons presináptica. Hemos observado que la carga con una mayor concentración disminuye la frecuencia y la amplitud de sIPSCs. Cuando la carga sensible al calcio en los tintes terminales presinápticas de las neuronas vibrodissociated, se debe tener cuidado, porque la capacidad amortiguadora de la boutons presináptica pequeña puede ser diferente que en el soma y el tamaño de boutons no son consistentes. Las neuronas que contienen los platos se lavan con solución amortiguadora HEPES-externa después de colorante de carga, y el tiempo de recuperación después del lavado es crucial. Además, para lograr un buen sello de células enteras de grabación, las células se deben lavar a fondo para deshacerse de los no internalizan las moléculas del tinte de la membrana celular externa. Además de usar las neuronas vibrodissociated de imágenes de células de electrofisiología y en directo, las técnicas de inmunohistoquímica también se puede aplicar a estas células 11,12. Las células se pueden fijar fácilmente y se tiñeron con una variedad de anticuerpos, y otros marcadores de la célula. El uso de estas células proporciona una preparación de limpieza para la visualización de la expresión de proteínas en GABAérgicas terminales presinápticos. Utilizando ratones que expresan proteínas fluorescentes bajo el control de promotores específicos de las neuronas GABAérgicas permite al investigador para identificar los terminales sinápticos individuales en la preparación de la vibrodissociated (Figura 1). Marcadores fluorescentes de imágenes de este tipo puede permitir mediciones morfológicas en las terminales de uso basada en el láser y nuevas técnicas de microscopía como STED (Emisión Estimulación Microscopía agotamiento). Visualización con tintes que el informe de ciclismo vesículas sinápticas también es posible con esta preparación. Akaike y compañeros de trabajo han etiquetado terminales GABAérgicas con el tinte estirilo, FM1-43 para visualizar las terminales de las células vivas 4. También debería ser posible llevar a cabo una sola célula de la transcriptasa inversa PCR al perfil de la expresión del ARN en vibrodissociatedlas neuronas. Esta técnica se aplica habitualmente a enzimáticamente disociarse las neuronas y las neuronas en cultivos celulares.

<table border="1"><tbody><tr><td> Artículo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Vibrando Slicer tejido </td><td> Leica Microsystems Inc. </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultivo celular (35 mm) </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> Platos con fondo de cristal </td><td> Willco plato </td><td> GWSB O-5040-3522 GWSB </td><td> 0,16-0,19 mm de espesor de vidrio para la imagen </td></tr><tr><td> Manipulador piezoeléctricos </td><td> EXFO-Burleigh </td><td> LSS-3000 </td><td> También puede utilizar relés, etc </td></tr><tr><td> SD9 Plaza de estimulador de impulsos </td><td> Tecnologías de la hierba </td><td> SD9K </td><td> Para activar manipulador piezoeléctricos </td></tr><tr><td> Disección Estereoscopio </td><td> Salvaje Heerbrugg </td><td> TYP 374590 </td><td> También puede utilizar cualquier estereoscopio </td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipeta extractor </td><td> Sutter Instrumento </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Pared Delgada capilares de vidrio </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> TW-150F-4 </td><td> De la llama de vidrio selladas micropipeta y micropipeta parche </td></tr><tr><td> Seis canales de perfusión sistemas de válvulas de control </td><td> Warner Instrumentos </td><td> VC-6 o VC-6M </td><td></td></tr><tr><td> Perfusión rápida Paso </td><td> Warner Instrumentos </td><td> SF-77B </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio invertido con 20-63x objetivos </td><td> Nikon </td><td> TS200 Diaphot </td><td></td></tr><tr><td> EMCCD Cámara </td><td> Andor Technology </td><td> ixon EM + DU-888 </td><td></td></tr><tr><td> Excite iluminación de fluorescencia fuente de luz </td><td> EXFO Fotónica Solutions Inc. </td><td> X-Cite 120PC </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4, AM indicador de calcio </td><td> Las sondas moleculares </td><td> F14201 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibrodissociation of neurons from rodent brain slices to study synaptic transmission and image presynaptic terminals

Disociación mecánica de las neuronas del sistema nervioso central tiene la ventaja de que boutons presináptica de permanecer unidos a la neurona aislada de interés. Esto permite un examen de la transmisión sináptica en condiciones en los ambientes intracelular extracelular y postsinápticos se puede controlar bien. Una técnica basada en la vibración sin el uso de proteasas, conocidos como vibrodissociation, es la técnica más popular para aislamiento mecánico. Una micropipeta, con la punta pulida al fuego a la forma de una pelota pequeña, se coloca en una rebanada del cerebro a partir de una P1-P21 roedores. La micropipeta se vibra paralelo a la superficie de corte y baja a través del grosor de corte que resulta en la liberación de neuronas aisladas. Las neuronas aisladas están listos para su estudio a pocos minutos de vibrodissociation. Esta técnica tiene ventajas sobre el uso de cultivos primarios de neuronas, las secciones de cerebro y las neuronas aisladas enzimáticamente, incluyendo: una rápida producción de neuronas viables, relativamente maduros adecuados para estudios electrofisiológicos y de imagen, mayor control del medio ambiente extracelular libre de la influencia de las células vecinas; idoneidad para bien controlados experimentos farmacológicos utilizando la aplicación del fármaco y la rápida superfusión total de células, y la mejora del espacio-clamp en células enteras grabaciones en relación con las neuronas en el segmento o preparaciones de cultivo de células. Esta preparación se puede utilizar para examinar la fisiología sináptica, la farmacología, la modulación y plasticidad. Imágenes en tiempo real tanto de los elementos pre-y post-sinápticas en las células vivas y boutons También es posible usar las neuronas vibrodissociated. Caracterización de los componentes moleculares de los elementos pre-y post-sináptica también se puede lograr con los métodos inmunológicos y de imágenes basadas en.

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Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Este informe demuestra una técnica para aislamiento mecánico de las neuronas individuales viable mantener unido boutons presináptica. Vibrodissociated neuronas tienen la ventaja de una rápida producción, el control farmacológico excelente y mejora del espacio-clamp sin la influencia de las células vecinas. Este método puede ser utilizado para obtener imágenes de los elementos sináptica y la grabación de patch-clamp.

Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

vibrodissociation-neurons-from-rodent-brain-slices-to-study-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.4K vistas.  National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Este informe demuestra una técnica para aislamiento mecánico de las neuronas individuales viable mantener unido boutons presináptica. Vibrodissociated neuronas tienen la ventaja de una rápida producción, el control farmacológico excelente y mejora del espacio-clamp sin la influencia de las células vecinas. Este método puede ser utilizado para obtener imágenes de los elementos sináptica y la grabación de patch-clamp.