Vorremmo riconoscere Drs. Ping Zhu e Susumu Koyama per la loro assistenza durante la configurazione iniziale della tecnica, e il Dr. Veronica Alvarez per l&#39;assistenza nella formattazione del manoscritto. Questo studio è stato finanziato dalla Divisione di Intramurale Ricerca Clinica e Biomedica del NIAAA.

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	<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+potentiates+gabaergic+synaptic+transmission+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala.">Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).</li><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+endocannabinoid+signaling+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala.">Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).</li><li>Akaike, N., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques:+Applications+of+the+nerve-bouton+preparation+in+neuropharmacology.">Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology.</a> Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).</li><li>Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+stimulation+of+single+gabaergic+presynaptic+boutons+on+the+rat+hippocampal+neuron.">Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron.</a> Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).</li><li>Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+glycine+receptors+on+gabaergic+terminals+facilitate+discharge+of+dopaminergic+neurons+in+ventral+tegmental+area.">Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area.</a> J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).</li><li>Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+5-ht3+receptor-mediated+modulation+of+synaptic+gaba+release+in+the+mechanically+dissociated+rat+amygdala+neurons.">Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons.</a> J Physiol. 529, 373-383 (2000).</li><li>Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+enhances+glutamate+transmission+by+retrograde+dopamine+signaling+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+the+ventral+tegmental+area.">Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).</li><li>Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+subtypes+on+single+gabaergic+presynaptic+terminal+projecting+to+rat+hippocampal+neurons.">Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons.</a> Brain Res. 951, 121-129 (2002).</li><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+synaptic+activity+produces+long-lasting+enhancement+of+endocannabinoid+modulation+and+alters+long-term+synaptic+plasticity.">Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity.</a> J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).</li><li>Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+contribute+to+metabotropic+glutamate+receptor-mediated+inhibition+of+gaba+release+onto+hippocampal+ca3+pyramidal+neurons+in+an+isolated+neuron/bouton+preparation.">Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation.</a> Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptophluorin.">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vibrodissociation di successo richiede che le fette contengono neuroni sani e che gli spazi interstiziali sono sufficientemente flessibili da consentire neuroni per uscire dalla fetta senza danni tossici. Così, la tecnica funziona in modo ottimale alle prime età post-natale (P1-21), quando fette sano può essere fatto con materiali meno gliali / interstiatial che si trova a fette cervello adulto. Nella nostra esperienza, tuttavia, ottimizzando la preparazione fetta per la sopravvivenza neuronale nella fetta stesso può essere controproducente per la tecnica vibrodissociation. Mentre noi abitualmente preparare fette di registrazione in situ utilizzando freddo aCSF modificata, in cui saccarosio è stato sostituito per gran parte della Na + extracellulare e Ca 2 +, fette preparato per vibrodissociation possono essere preparati (per esempio taglio) nel nostro aCSF registrazione normale. Nel preparare fette per la registrazione da singoli neuroni nelle stesse fette abbiamo anche posto le fette in aCSF normale a 35 ° C subito dopo il sezionamento e lasciarli per 30-60 minuti a questa temperatura prima di tornare a temperatura ambiente. Tuttavia, fette preparato per vibrodissociation vengono spostati immediatamente a temperatura ambiente subito dopo taglio. Queste procedure forniscono un rendimento più elevato di neuroni sani dopo vibrodissociation, forse a causa della mancanza del tessuto interstiziale ditta che permette ai neuroni di essere più facilmente scosso allentato dalla stessa fetta. Non abbiamo modo esaustivo esame delle condizioni di preparazione fetta, come di routine ottenere neuroni sufficienti per la nostra registrazione ed esperimenti di imaging in un dato giorno. E &#39;possibile che ulteriori modifiche, come i cambiamenti nello spessore fetta o procedure preincubaton, potrebbe essere fatto per aumentare la produzione di neuroni sani. Trattamenti proteasi molto mite sono state provate in uno sforzo per aumentare la resa delle cellule e ottenere la tecnica di lavorare in animali anziani. Tuttavia, immancabilmente anche il trattamento della proteasi mite sembra disturbare la funzione sinapsi. Così, mentre la combinazione di proteasi e di dissociazione meccanica possono ancora essere trovati al lavoro non si è dimostrato affidabile in neuroni proencefalo fino ad oggi. Va inoltre notato il rendimento relativamente basso di neuroni sani dopo vibrodissociation significa che la tecnica è soprattutto utile per lo studio abbondante sottotipi neuronali, soprattutto i neuroni di proiezione. La disponibilità di GFP-esprimere i topi in cui le piccole sottopopolazioni neuronali possono essere facilmente identificate aumenta la possibilità di studiare questi neuroni più rari. Tuttavia, a meno resa neuronale può essere migliorata notevolmente l&#39;accumulo di dati su questi neuroni è probabile che sia relativamente lento. Varie fasi hanno dimostrato di essere decisivo per il caricamento di successo di neuroni con il calcio-sensing coloranti. L&#39;esposizione a AM-esterificati tintura viene eseguita a 37 ° C, e abbiamo avuto successo nel tentativo di tintura di carico a basse temperature. La concentrazione dei coloranti devono essere ottimizzati in termini di tempo di carico e la temperatura in quanto sembra che più alta concentrazione di colorante di caricamento abbassa la concentrazione di calcio nel boutons presinaptico. Abbiamo osservato che a concentrazioni più elevate di carico diminuisce la frequenza e l&#39;ampiezza delle sIPSCs. Quando si carica sensibile al calcio, coloranti in terminali presinaptici di neuroni vibrodissociated, bisogna fare attenzione perché la capacità tampone del boutons piccolo presinaptico può essere diverso nel soma e le dimensioni dei boutons non sono coerenti. Neuron contenenti i piatti vengono lavati con HEPES-buffered soluzione esterna seguente colorante di caricamento e il tempo di recupero dopo il lavaggio è cruciale. Inoltre, per fare una buona tenuta per tutta la registrazione da cellula, le cellule devono essere accuratamente lavati per sbarazzarsi di molecole di colorante non interiorizzato dalla membrana cellulare esterna. Oltre a utilizzare i neuroni vibrodissociated per l&#39;imaging cellulare elettrofisiologia e di vivere, tecniche immunocitochimiche può essere applicato anche a queste cellule 11,12. Le celle possono essere facilmente fissate e colorate con una varietà di anticorpi, e marcatori cellulari di altri. L&#39;utilizzo di queste cellule fornisce una preparazione pulita per la visualizzazione di espressione della proteina in GABAergico terminali presinaptici. Utilizzando topi che esprimono proteine ​​fluorescenti sotto il controllo di promotori specifici per i neuroni GABAergici consente al ricercatore di identificare i singoli terminali sinaptici nella preparazione vibrodissociated (Figura 1). Marcatori fluorescenti immagini di questo tipo può consentire misurazioni morfologiche nei terminali utilizzando laser a base di microscopia e più recenti tecniche come STED (Emission Microscopy stimolazione Depletion). Visualizzazione con coloranti che riportano ciclismo delle vescicole sinaptiche è possibile anche con questa preparazione. Akaike e collaboratori hanno etichettato terminali GABAergici con il colorante styryl, FM1-43 per visualizzare i terminali nelle cellule viventi 4. Dovrebbe anche essere possibile effettuare cella singola transcriptasi inversa PCR per profilo di espressione di RNA in vibrodissociatedneuroni. Questa tecnica è utilizzata abitualmente per enzimaticamente dissociati neuroni e neuroni cresciuti in coltura cellulare.

<table border="1"><tbody><tr><td> Voce </td><td> Azienda </td><td> Catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Vibrante Slicer Tissue </td><td> Leica Microsystems Inc. </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Cellule Dish Cultura (35 mm) </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> Fondo di Vetro Piatti </td><td> Willco-piatto </td><td> GWSB-5040 Oppure GWSB-3522 </td><td> 0,16-0,19 vetro mm di spessore per l&#39;imaging </td></tr><tr><td> Manipolatore piezoelettrico </td><td> EXFO-Burleigh </td><td> LSS-3000 </td><td> Potrebbe anche usare relè, ecc </td></tr><tr><td> SD9 Piazza impulsi dello stimolatore </td><td> Grass Technologies </td><td> SD9K </td><td> Per l&#39;attivazione manipolatore piezoelettrico </td></tr><tr><td> Dissezione stereoscopio </td><td> Selvatico Heerbrugg </td><td> TYP 374590 </td><td> Anche usare un&#39;altra stereoscopio </td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipetta estrattore </td><td> Sutter strumento </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Sottile parete di vetro Capillari </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> TW-150F-4 </td><td> Per la fiamma micropipetta di vetro sigillato e patch micropipetta </td></tr><tr><td> Sei Canale perfusione Valve Control Systems </td><td> Warner Instruments </td><td> VC-6 o VC-6M </td><td></td></tr><tr><td> Perfusione Fast-Passo </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-77B </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio invertito con obiettivi 20-63x </td><td> Nikon </td><td> TS200 Diaphot </td><td></td></tr><tr><td> EMCCD Camera </td><td> ANDOR Tecnologia </td><td> ixon EM + DU-888 </td><td></td></tr><tr><td> Eccitare fluorescenza illuminazione Light Source </td><td> EXFO Photonics Solutions Inc. </td><td> X-Cite 120PC </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4, AM indicatore di calcio </td><td> Molecular Probes </td><td> F14201 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibrodissociation of neurons from rodent brain slices to study synaptic transmission and image presynaptic terminals

Meccanica dissociazione dei neuroni del sistema nervoso centrale ha il vantaggio che boutons presinaptica rimangono attaccati al neurone isolato di interesse. Questo consente per l&#39;esame della trasmissione sinaptica in condizioni in cui gli ambienti extracellulare ed intracellulare postsinaptici possono essere ben controllate. Una vibrazione a base di tecnica senza l&#39;uso di proteasi, noto come vibrodissociation, è la tecnica più diffusa per l&#39;isolamento meccanico. Una micropipetta, con la punta fuoco lucidato alla forma di una pallina, viene inserito in una fetta del cervello fatto da un P1-P21 roditori. La micropipetta è vibrato parallela alla superficie fetta e abbassare lo spessore della fetta con conseguente liberazione di neuroni isolati. I neuroni isolati sono pronti per lo studio in pochi minuti di vibrodissociation. Questa tecnica ha dei vantaggi rispetto all&#39;uso di colture primarie neuronali, fettine di cervello e neuroni isolati enzimaticamente tra cui: la produzione rapida di vitale, neuroni relativamente matura adatto per studi elettrofisiologici e di imaging, controllo superiore dell&#39;ambiente extracellulare libero dall&#39;influenza delle cellule vicine; idoneità per esperimenti farmacologici ben controllati con l&#39;applicazione rapida di droga e superfusione cellulare totale e migliorato lo spazio-clamp nelle registrazioni relativi ai neuroni in fetta o preparati colture cellulari a cellula intera. Questa preparazione può essere utilizzato per esaminare sinaptica fisiologia, farmacologia, la modulazione e la plasticità. Imaging in tempo reale di entrambi gli elementi pre-e post-sinaptici nelle cellule viventi e boutons è possibile anche utilizzando i neuroni vibrodissociated. Caratterizzazione dei costituenti molecolari degli elementi pre-e post-sinaptici può essere ottenuta anche con approcci immunologici e di imaging-based.

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Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Questa relazione dimostra una tecnica per isolamento meccanico di singoli neuroni vitali mantenendo attaccato boutons presinaptica. Vibrodissociated neuroni hanno il vantaggio di una produzione rapida, eccellente controllo farmacologico e migliorato lo spazio-clamp senza influenza dalle cellule vicine. Questo metodo può essere utilizzato per l&#39;imaging di elementi sinaptica e di patch-clamp registrazione.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

vibrodissociation-neurons-from-rodent-brain-slices-to-study-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.4K Views.  National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Questa relazione dimostra una tecnica per isolamento meccanico di singoli neuroni vitali mantenendo attaccato boutons presinaptica. Vibrodissociated neuroni hanno il vantaggio di una produzione rapida, eccellente controllo farmacologico e migliorato lo spazio-clamp senza influenza dalle cellule vicine. Questo metodo può essere utilizzato per l'imaging di elementi sinaptica e di patch-clamp registrazione.