Nous tenons à remercier les Drs. Jun Zhu Ping et Susumu Koyama pour leur aide lors de la configuration initiale de la technique, et le Dr Veronica Alvarez de l&#39;aide pour le formatage du manuscrit. Cette étude a été financée par la Division de la recherche clinique et biomédicale intra-muros des NIAAA.

<ol>
	<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+potentiates+gabaergic+synaptic+transmission+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala.">Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).</li><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+endocannabinoid+signaling+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala.">Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).</li><li>Akaike, N., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques:+Applications+of+the+nerve-bouton+preparation+in+neuropharmacology.">Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology.</a> Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).</li><li>Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+stimulation+of+single+gabaergic+presynaptic+boutons+on+the+rat+hippocampal+neuron.">Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron.</a> Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).</li><li>Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+glycine+receptors+on+gabaergic+terminals+facilitate+discharge+of+dopaminergic+neurons+in+ventral+tegmental+area.">Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area.</a> J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).</li><li>Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+5-ht3+receptor-mediated+modulation+of+synaptic+gaba+release+in+the+mechanically+dissociated+rat+amygdala+neurons.">Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons.</a> J Physiol. 529, 373-383 (2000).</li><li>Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+enhances+glutamate+transmission+by+retrograde+dopamine+signaling+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+the+ventral+tegmental+area.">Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).</li><li>Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+subtypes+on+single+gabaergic+presynaptic+terminal+projecting+to+rat+hippocampal+neurons.">Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons.</a> Brain Res. 951, 121-129 (2002).</li><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+synaptic+activity+produces+long-lasting+enhancement+of+endocannabinoid+modulation+and+alters+long-term+synaptic+plasticity.">Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity.</a> J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).</li><li>Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+contribute+to+metabotropic+glutamate+receptor-mediated+inhibition+of+gaba+release+onto+hippocampal+ca3+pyramidal+neurons+in+an+isolated+neuron/bouton+preparation.">Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation.</a> Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptophluorin.">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).</li></ol>

Vibrodissociation réussie exige que les tranches contiennent neurones sains et que les espaces interstitiels sont suffisamment souples pour permettre aux neurones pour sortir de la tranche sans dégâts toxiques. Ainsi, la technique fonctionne de manière optimale au début âges postnataux (P1-21) lors des tranches saines peuvent être faites avec moins de matières gliales / interstiatial que se trouve dans des tranches de cerveau adulte. Dans notre expérience, cependant, l&#39;optimisation de la préparation pour la tranche de la survie neuronale dans la tranche elle-même peut être contre-productif pour la technique vibrodissociation. Alors que nous avons l&#39;habitude de préparer des tranches pour l&#39;enregistrement in situ en utilisant froide aCSF modifié dans lequel le saccharose a été remplacé par une grande partie de la matrice extracellulaire de Na + et Ca 2 +, les tranches préparées pour vibrodissociation peut être préparé (coupure par exemple) dans notre aCSF enregistrement normal. Lors de la préparation des tranches pour l&#39;enregistrement à partir de neurones individuels dans les tranches elles-mêmes, nous aussi placer les tranches de aCSF normale à 35 ° C, juste après la coupe et les laisser pendant 30-60 min à cette température avant de les retourner à la température ambiante. Toutefois, les tranches sont préparées pour vibrodissociation déplacé immédiatement à la température ambiante, juste après le tranchage. Ces procédures fournissent un rendement plus élevé de neurones sains après vibrodissociation, peut-être à cause du manque de tissu interstitiel qui permet cabinet neurones pour être plus facilement détaché de son support de la tranche de lui-même. Nous n&#39;avons pas examiné de manière exhaustive les conditions de préparation de tranches, comme nous avons l&#39;habitude d&#39;obtenir neurones suffisant pour notre enregistrement et des expériences d&#39;imagerie sur un jour donné. Il est possible que des modifications supplémentaires, comme des changements dans l&#39;épaisseur de coupe ou de procédures preincubaton, pourraient être apportées pour accroître le rendement des neurones sains. Très doux traitements protéase ont été essayées dans un effort pour augmenter le rendement des cellules et maîtriser la technique de travailler dans des animaux plus âgés. Toutefois, invariablement, même le traitement de la protéase douce semble pas perturber le fonctionnement des synapses. Ainsi, alors que la combinaison de la protéase et la dissociation mécanique peut encore être trouvée pour le travail qu&#39;il n&#39;a pas fait ses preuves dans les neurones du cerveau antérieur à ce jour. Il convient également de noter le rendement relativement faible des neurones sains après vibrodissociation signifie que la technique est principalement utile pour étudier les sous-types neuronaux abondante, principalement les neurones de projection. La disponibilité des souris exprimant la GFP dans lequel de petites sous-populations neuronales peuvent être facilement identifiés augmente la chance d&#39;étudier ces neurones plus rares. Cependant, à moins de rendement neuronale peut être sensiblement améliorée accumulation de données sur ces neurones est susceptible d&#39;être relativement lente. Plusieurs étapes se sont avérées cruciales pour le chargement réussi de neurones avec du calcium-sensing colorants. L&#39;exposition aux PM-estérifiés teinture est réalisée à 37 ° C, et nous n&#39;avons pas réussi à essayer de colorant de charge à basse température. La concentration des colorants devraient être optimisées considérant à la fois le temps de chargement et de la température car il semble que plus la concentration de colorant de chargement diminue la concentration de calcium dans les boutons présynaptiques. Nous avons observé que des concentrations plus élevées de chargement avec une diminution de la fréquence et l&#39;amplitude de sIPSCs. Lors du chargement de calcium-sensing colorants dans les terminaux présynaptiques des neurones vibrodissociated, il faut prendre soin, car la capacité tampon de l&#39;boutons petits présynaptique peut être différente de celle dans le soma et la taille des boutons ne sont pas compatibles. Neuron contenant les plats sont lavées avec tamponné HEPES solution externe suivants colorant de chargement, et le temps de récupération après le lavage est essentiel. En outre, pour faire une bonne étanchéité des cellules entières d&#39;enregistrement, les cellules doivent être soigneusement lavés à se débarrasser de non internalisés molécules de colorant de la membrane cellulaire extérieure. En plus d&#39;utiliser des neurones vibrodissociated d&#39;imagerie cellulaire électrophysiologie et en direct, des techniques immunocytochimiques peuvent également être appliquées à ces cellules 11,12. Les cellules peuvent être facilement fixés et colorés avec une variété d&#39;anticorps, et autres marqueurs cellulaires. L&#39;utilisation de ces cellules permet une préparation propre pour la visualisation de l&#39;expression des protéines dans les terminaisons présynaptiques GABAergique. En utilisant des souris qui expriment des protéines fluorescentes sous le contrôle de promoteurs spécifiques aux neurones GABAergiques permet à l&#39;enquêteur d&#39;identifier individuellement terminaisons synaptiques dans la préparation de la vibrodissociated (figure 1). Marqueurs fluorescents imagerie de ce type peut permettre des mesures morphologiques dans les terminaux utilisant la microscopie à base de laser et de nouvelles techniques comme la STED (Microscopie épuisement stimulation d&#39;émission). Visualisation avec des colorants que le rapport de vélo vésicules synaptiques est également possible avec cette préparation. Akaike et ses collègues ont qualifié terminaux GABAergiques avec le colorant styryle, FM1-43 pour visualiser les terminaux dans les cellules vivantes 4. Il devrait également être possible d&#39;effectuer une seule cellule de la transcriptase inverse PCR pour l&#39;ARN le profil d&#39;expression dans vibrodissociatedneurones. Cette technique est couramment appliquée à enzymatiquement dissocié les neurones et les neurones en culture cellulaire.

<table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Vibrant Slicer tissus </td><td> Leica Microsystems Inc </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de culture cellulaire (35 mm) </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> Plats à fond de verre </td><td> Willco-vaisselle </td><td> GWSB-5040-3522 Ou GWSB </td><td> 0.16 à 0.19 mm d&#39;épaisseur de verre pour l&#39;imagerie </td></tr><tr><td> Manipulateur piézoélectriques </td><td> Exfo-Burleigh </td><td> LSS-3000 </td><td> Pourrait aussi utiliser le relais, etc </td></tr><tr><td> SD9 Place Pulse stimulateur </td><td> Technologies Herbe </td><td> SD9K </td><td> Pour le déclenchement manipulateur piézoélectriques </td></tr><tr><td> Dissection Stéréoscope </td><td> Wild Heerbrugg </td><td> TYP 374 590 </td><td> Pourrait aussi utiliser n&#39;importe quel stéréoscope </td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipette extracteur </td><td> Instrument Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Paroi mince capillaires en verre </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> TW-150F-4 </td><td> Pour le verre scellées à la flamme micropipette et patch micropipette </td></tr><tr><td> Six systèmes de perfusion Canal Vanne de régulation </td><td> Warner Instruments </td><td> VC-6 ou VC-6M </td><td></td></tr><tr><td> Perfusion rapide Étape </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-77B </td><td></td></tr><tr><td> Microscope inversé avec 20-63x objectifs </td><td> Nikon </td><td> TS200 Diaphot </td><td></td></tr><tr><td> Caméra EMCCD </td><td> ANDOR technologie </td><td> ixon EM + UA-888 </td><td></td></tr><tr><td> Excite Source de lumière à éclairage par fluorescence </td><td> EXFO Solutions Photonics Inc </td><td> X-Cite 120PC </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4, AM indicateur de calcium </td><td> Molecular Probes </td><td> F14201 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibrodissociation of neurons from rodent brain slices to study synaptic transmission and image presynaptic terminals

Dissociation mécanique des neurones du système nerveux central a l&#39;avantage de boutons présynaptiques restent attachés à la neurone isolé de l&#39;intérêt. Cela permet à l&#39;examen de la transmission synaptique dans des conditions où les environnements extracellulaires et intracellulaires postsynaptique peut être bien contrôlé. Une technique basée sur les vibrations sans l&#39;utilisation de protéases, connu sous le nom vibrodissociation, est la technique la plus populaire pour l&#39;isolation mécanique. D&#39;une micropipette, avec la pointe polie au feu à la forme d&#39;une petite balle, est placé dans une tranche de cerveau fait à partir d&#39;un P1-P21 rongeurs. La micropipette est vibré parallèle à la surface tranche et abaissé grâce à l&#39;épaisseur de coupe résultant de la libération de neurones isolés. Les neurones isolés sont prêts pour des études au sein de quelques minutes de vibrodissociation. Cette technique a des avantages sur l&#39;utilisation de cultures primaires de neurones, des tranches de cerveau et les neurones isolés enzymatiquement, notamment: la production rapide de viabilité, les neurones relativement matures appropriés pour des études électrophysiologiques et d&#39;imagerie, le contrôle supérieur de l&#39;environnement extracellulaire libre de l&#39;influence des cellules voisines; adéquation pour le bien-contrôlé expériences pharmacologiques en utilisant l&#39;application rapide du médicament et de surfusion total de cellules, et l&#39;amélioration espace-clamp dans la cellule entière par rapport à des enregistrements de neurones dans des préparations ou des tranches de culture cellulaire. Cette préparation peut être utilisée pour examiner synaptique physiologie, la pharmacologie, la modulation et la plasticité. Imagerie en temps réel de ces deux éléments pré-et post-synaptiques dans les cellules vivantes et boutons est également possible en utilisant les neurones vibrodissociated. Caractérisation des constituants moléculaires des éléments pré-et post-synaptiques peuvent également être obtenus avec des approches immunologiques et fondés sur l&#39;imagerie.

Watch this Scientific Journal Video about Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals at JoVE.com

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Ce rapport démontre une technique d&#39;isolation mécanique de neurones individuels viables conservant attachés boutons présynaptiques. Vibrodissociated neurones ont l&#39;avantage d&#39;une production rapide, un excellent contrôle pharmacologique et amélioré l&#39;espace-pince sans influence des cellules voisines. Cette méthode peut être utilisée pour l&#39;imagerie des éléments synaptiques et patch-clamp.

Vibrodissociation des neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et de l&#39;image terminaisons présynaptiques

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

vibrodissociation-neurons-from-rodent-brain-slices-to-study-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.4K vues.  National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Ce rapport démontre une technique d'isolation mécanique de neurones individuels viables conservant attachés boutons présynaptiques. Vibrodissociated neurones ont l'avantage d'une production rapide, un excellent contrôle pharmacologique et amélioré l'espace-pince sans influence des cellules voisines. Cette méthode peut être utilisée pour l'imagerie des éléments synaptiques et patch-clamp.