El xenoinjerto derivado del paciente con pez cebra es un poderoso modelo preclínico para predecir el perfil de quimiosensibilidad del paciente con cáncer in vivo. El protocolo describe la generación del modelo a partir de una muestra quirúrgica del paciente. Al xenoinjertar un pequeño fragmento de tejido en lugar de aislar células en embriones de pez cebra, es posible mantener el microambiente tumoral, que es el paso crucial para la progresión del tumor y la respuesta a la quimioterapia.
La gran ventaja del modelo viene dada por su potencial para predecir el pronóstico del paciente en un plazo clínico relevante de tan solo una semana actuando como herramienta para la medicina personalizada. Comience el procesamiento de la muestra lavando todo el tejido tumoral recolectado del paciente con cinco mililitros de medio tumoral fresco. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de plástico Pasteur.
Aspire y deseche cuidadosamente el medio de lavado antes de repetir el lavado tres veces. Sumerja la muestra en uno o dos mililitros de medio tumoral fresco. Corte la muestra del tumor en trozos cúbicos de uno a dos milímetros con una cuchilla de bisturí y luego colóquelos en un tubo de plástico estéril de cinco mililitros con medio tumoral.
Después de ajustar el helicóptero de tejido McIlwain a un grosor de 100 micrómetros, coloque las piezas tumorales en la mesa circular de plástico del helicóptero y córtelas. Gire la mesa 90 grados y repita el picado. Recoja los fragmentos tumorales picados en un tubo de plástico de 15 mililitros que contenga el medio tumoral.
Centrifugar los fragmentos tumorales picados a 300 G durante tres minutos antes de aspirar y desechar el sobrenadante. Incubar los fragmentos con la solución de trazas celulares o con un seguidor celular fluorescente alternativo como CM-DiI o Deep Red durante 30 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Durante la incubación, resuspenda suavemente los fragmentos cada 10 minutos.
Al final de la tinción, retire cualquier tinte libre agregando un medio tumoral suplementado con al menos 1% de proteína. El volumen será cinco veces el volumen de tinción. Centrifugar los fragmentos a 300 G durante tres minutos y desechar el sobrenadante.
Agregue un mililitro de solución salina tamponada con fosfato o DPBS de Dulbecco y repita este paso de lavado tres veces. Una vez hecho esto, suspenda los fragmentos en cinco mililitros de DPBS en una placa de Petri de 60 milímetros. Para establecer los xenoinjertos derivados del paciente a base de pez cebra o zPDX, anestesiar los embriones dos días posteriores a la fertilización.
En una placa de Petri que tiene tres cilindros de agarosa, coloque un embrión de pez cebra en un cilindro exponiendo un lado. Retire el exceso de solución para mantener el embrión en una película delgada. Usando fórceps estériles, transfiera la pieza de fragmentos de tejido tumoral teñido de una placa de Petri de 60 milímetros al soporte de agarosa al 1% donde se coloca el embrión.
Luego levante el tejido y colóquelo sobre la yema del embrión antes de empujarlo hacia el espacio perivitelino usando la microaguja de vidrio tirada por calor. Agregue algunas gotas de estreptomicina E3 1% penicilina al embrión para devolverlo al líquido. Después de repetir la implantación de tejido tumoral en todos los embriones, retire los soportes de agarosa de la placa de Petri e incube los embriones a 35 grados centígrados.
Dos horas después de la implantación, compruebe los embriones para los xenoinjertos correctos con tinción positiva utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Desechar los embriones muertos y los embriones sin los fragmentos tumorales completamente dentro del espacio perivitelino. Una vez hecho esto, distribuya aleatoriamente los embriones en seis placas de múltiples pocillos, divididas equitativamente en grupos según el plan experimental.
Diluir los medicamentos mezclándolos en E3 1% pen-strep para preparar el cóctel FOLFOXIRI. Después de dos horas de implantación, retire los medios de cada pocillo y agregue el cóctel de medicamentos. Coloque los embriones en la incubadora a 35 grados centígrados durante tres días con cambios diarios del medio para renovar los medicamentos.
Para obtener imágenes, capture imágenes bajo un objetivo 40X del microscopio confocal. Utilice la resolución de 1024 por 512 píxeles con un espaciado Z de cinco micrómetros. Las imágenes completas de montaje de zPDXs adquiridas para analizar la apoptosis detectada en cyano mostraron que la terapia combinada aumentó la apoptosis celular en comparación con el grupo de control.
El estudio de caso informó que se identificó un aumento estadísticamente significativo en la fracción de células apoptóticas en los xenoinjertos implantados para el grupo tratado con FOLFOXIRI en comparación con el grupo control. El protocolo muestra un ejemplo utilizando tejido de cáncer de páncreas, pero se pueden establecer xenoinjertos derivados de pacientes con pez cebra a partir de diferentes tipos de cáncer. Además, dado que el modelo tiene un bajo impacto ético, es fácilmente explotable para la detección in vivo de nuevos medicamentos.
El método es técnicamente desafiante y requiere un operador experto. La experiencia previa en la manipulación de embriones de pez cebra y la microinyección acelerará el entrenamiento de la técnica.
