Este trabajo fue apoyado por NSF subvención MCB-0817827.

Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es una técnica bien establecida que pueda determinar todos los parámetros termodinámicos (afinidad, la entalpía y la estequiometría) de una interacción de unión en un solo experimento. 1 ITC trabaja en la titulación un reactivo en un segundo reactivo en condiciones isotérmicas. La señal es el calor liberado o absorbido en la interacción (unión) de los dos reactivos. Una serie de inyecciones se realizan y la señal de calor se aproxima a cero como el reactivo limitante se satura. Ajuste de la isoterma da los parámetros termodinámicos. Varias revisiones están disponibles que describen la instrumentación, así como los cálculos de la recogida y análisis de datos. 2,3 Mientras calorímetros están disponibles (en particular el ITC 200 con pequeños volúmenes), aquí se describe un protocolo general para la VP-ITC fabricados por MicroCal (ahora parte de GE Healthcare). 1. Preparación de muestras <ol><li> Con el fin de preparar la macromolécula y el ligando en el buffer, algunos problemas que deben abordarse. Ajuste preciso necesario mantener las concentraciones adecuadas de la macromolécula, las especies que normalmente va en la celda de muestra de la CCI, y ligando, la especie en la jeringa. Debido a que algunas proteínas se agregan a la alta concentración necesarios para la especie en la jeringa de inyección, con más frecuencia de la proteína se carga en la celda de muestra. La concentración de macromoléculas óptima se determina a partir de &quot;c&quot;, el producto de la afinidad previsto del sistema, que puede estimarse utilizando métodos ortogonales antes de usar el CCI, y la concentración total de macromoléculas, donde c = K a * [M]. Los valores óptimos de la gama de c 10 a 1000, 1 a pesar de que es posible obtener datos precisos para la débil unión a los sistemas bajo condiciones experimentales específicas con c-valores por debajo del límite inferior. 4 De este modo, la concentración de macromoléculas se debe determinar con esta gama de c valores en mente (es decir, para una K a de 10 6 M -1, la concentración de macromoléculas de 10 a 1000 M se debe utilizar). El conocimiento previo de la afinidad de unión del sistema puede ayudar a minimizar la proteína utilizada para la ITC mediante un mejor diseño del experimento de ITC. La concentración del ligando debe ser lo suficientemente grande (7-25 veces más concentrado que el K d para el sitio de unión del ligando más débil), de modo que la saturación se produce en el primer tercio a la mitad de la titulación. Ajuste preciso de los datos también requiere la saturación de la señal. Para los sistemas con mayor afinidad de unión, una concentración de ligando baja se debe utilizar para evitar la saturación muy temprano en la titulación, lo que dará encaja inexacta. Una vez que el calor de control de dilución (es decir, la valoración del ligando en el buffer) se ha restado a la valoración, la entalpía de saturación debe acercarse a cero. </li><li> Debido a las impurezas de moléculas pequeñas pueden dar lugar a señales de artefactos en la medición del ITC, que es lo mejor, si es posible, que la macromolécula y el ligando de manera exhaustiva dializó contra tampón. Por otra parte, la cromatografía de columna, la desalinización columnas de centrifugado, o tampón filtros centrífugos de intercambio (por ejemplo, Centricons) se puede utilizar para cambiar el búfer de la macromolécula. Si el ligando es una molécula pequeña, se puede preparar con el tampón de diálisis después de la macromolécula ha sido dializados o por diálisis contra las membranas de diálisis con cortes adecuados para las pequeñas moléculas (es decir, 100-500 Da un Spectra / Por Float-A-Lyzer ). Las diferencias en la composición de amortiguación entre el ligando y soluciones macromolécula puede llevar a la señal de los artefactos del calor de la dilución de las impurezas en las muestras. Después de la preparación, asegúrese de que el pH del partido de amortiguamiento, macromolécula y el ligando (± 0,05 unidades de pH) como artefactos en la entalpía pueden surgir debido a amortiguar los efectos de protonación. 5 Asegúrese de que la preparación suficiente de cada especie. Para los experimentos por triplicado y un control de la dilución, la cantidad de material necesario dependerá de la ITC utiliza. Sin embargo, para la mayoría de los instrumentos del CCI que han de aproximadamente 2 ml células volumen de la muestra, por lo menos 7.6 ml de solución de macromoléculas serán necesarios, y se puede preparar convenientemente en 15 ml tubos falcon. De 300 jeringas de inyección l, 1.2 ml de la solución debe ser adecuada, y se puede preparar, ya sea en tubos Falcon o tubos de microcentrífuga. </li><li> El polvo y otras partículas, puede causar artefactos en la línea de base del termograma ITC. Es imperativo que se retiraran antes de ejecutar el experimento. Después de la preparación de soluciones madre de la muestra, las muestras deben ser centrifugadas en tubos de microcentrífuga durante cinco minutos en 8000 a 14.000 RPM a las partículas de sedimento en la solución. Eliminar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento, y colocarlo en un nuevo halcón / microcentrífuga tubo. Si reductores son necesarios para mantener la reducción de cisteínas, use concentraciones bajas y alimentos frescos de β-mercaptoethanol, TCEP (tris (2-carboxi) fosfina) o ditiotreitol para minimizar los artefactos debido a la oxidación reductor. Además, la presencia de disolventes orgánicos en la memoria intermedia (común para algunos ligandos de moléculas pequeñas que pueden necesitar metanol o DMSO con el fin de ser soluble) puede causar artefactos de la señal. Si los solventes orgánicos son necesarios para el ligando, entonces la solución macromolécula también debe contener la misma concentración para evitar cualquier señal de derivados del calor de dilución del disolvente orgánico. Ligeras diferencias en la composición de amortiguación entre el ligando y macromolécula debido a co-solventes, sales o pH son posibles durante la preparación de las muestras. Lo mejor es comprobar la dilución del ligando en el tampón de la muestra o la muestra de amortiguación en la macromolécula para asegurar que las señales de calor que surgen de las diferencias en el contenido del búfer de no hacer que los datos surgidos exclusivamente como consecuencia de los artefactos. </li><li> Comprobar la concentración de la macromolécula y el ligando cuidadosamente utilizando las técnicas adecuadas a su sistema (por ejemplo, mediciones de absorbancia, HPLC, ensayos colorimétricos, ensayos de BCA para las proteínas, etc) para grabar su concentración exacta. Las diferencias en la concentración real y la concentración usada para ajustarse a la isoterma puede provocar errores en la estequiometría, la entalpía y la afinidad de unión determina a partir de la experiencia. Es común que para desgasificar las muestras para evitar artefactos de la señal debido a las burbujas de aire o la liberación de los gases disueltos durante la titulación, particularmente a altas temperaturas. </li></ol> 2. Configuración del experimento <ol><li> Asegúrese de que la celda de muestra y una jeringa de inyección se limpian de acuerdo con el protocolo del fabricante antes de la carga de la macromolécula y el ligando. Enjuague la celda de muestra dos o tres veces con 1,8 ml de agua destilada con la jeringa Hamilton (tenga cuidado con la jeringa de Hamilton como el cañón se rompe con facilidad o la inclinación de aguja). A continuación enjuagar la celda varias veces con 1,8 ml de solución tampón. Cargar la celda de muestra con 1,8 ml de solución de macromoléculas, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas. </li><li> Llenar la celda de referencia con agua destilada. Para la mayoría de los amortiguadores, el agua destilada es buena para usar como solución de referencia. Sin embargo, para tampones con fuerzas iónicas particularmente alta o la osmolaridad, es mejor usar el buffer como referencia. </li><li> Eliminar las burbujas de aire de las células y muestra con la jeringa Hamilton. Suavemente mueva la aguja de la jeringa hacia arriba y hacia abajo de los lados de la célula golpear las burbujas que se puede estar en la parte inferior de la celda y se adjunta al pozo para la parte superior de la célula. Elimine cualquier exceso de volumen de la muestra y las células de referencia. </li><li> Conecte una jeringa de plástico para el puerto de llenado de la jeringa de inyección con tubo. Enjuague la jeringa con agua destilada. Siga por un buffer de enjuague. Asegúrese de que la jeringa es totalmente evacuado por el aire a través del sistema. Colocar la aguja de la jeringa en la solución de ligando y ligando dibujar la solución en la jeringa hasta que la jeringa entera está llena. Seguir dibujando un pequeño volumen en exceso (aproximadamente 50 l o más) en el puerto y el tubo conectado. Cierre inmediatamente el puerto de llenado de la jeringa y retire la jeringa y tubos de plástico. Purga y llenado de la jeringa dos veces más para eliminar las burbujas de la jeringa. Retire la jeringa de la solución de ligando y limpie la cara con una Kimwipe para eliminar cualquier gota, teniendo cuidado de no tocar la punta de la jeringa a la Kimwipe, ya que puede eliminar el volumen de la jeringa. Además, tenga cuidado de no golpear o frasco la jeringa ya que esto también puede causar la pérdida de volumen de la punta de la jeringa. Coloque la jeringa en la celda de muestra. </li><li> Configurar los parámetros para el funcionamiento de la ITC. Para los sistemas de unión con las señales de fuerte calor, un gran número de inyecciones de bajo volumen se dan más puntos de datos para el montaje (por ejemplo, 75 inyecciones de 3 l). Para los sistemas que tienen señales débiles de calor, un pequeño número de inyecciones de gran volumen son preferibles (por ejemplo, 33 inyecciones de 8 l). Por lo general, menos inyecciones con volúmenes de inyección superiores se utilizan. Puede tomar varias titulaciones para optimizar las condiciones que son las mejores para su sistema. Es importante tener en cuenta que la entalpía de unión puede ser exotérmica o endotérmica, dependiendo del sistema en estudio. Desafortunadamente, algunos sistemas tienen las señales de baja el calor, haciendo que el calor de reacción difícil de determinar. Los problemas con estos sistemas potencialmente puede ser superado por el aumento de la concentración de la macromolécula, el cambio de la temperatura del experimento (dependiendo de la capacidad de calor del sistema de unión), y / o la alteración del pH o la fuerza iónica del buffer. </li><li> También considere el espacio de tiempo entre cada inyección. Es imprescindible que después de cada inyección de ligando, el sistema se da tiempo para equilibrar el calor y la señal vuelve a la línea de base antes de la inyección se produzca la próxima. Para la mayoría de los sistemas de tres a cinco millasnutos debe ser adecuada. El tiempo entre las inyecciones se deben incrementar para sistemas en los que el equilibrio no se produce dentro de los cinco minutos. </li><li> Porque habrá algo de mezcla entre la macromolécula y soluciones ligando en la jeringa una vez que se inserta en la celda de la muestra, la primera inyección le dará resultados falsos. Lo mejor es usar pequeñas cantidades (por ejemplo, 2 l) durante los primeros uno o dos inyecciones (por lo que después se puede descartar) y mantener las inyecciones posteriores a los valores deseados. </li><li> Elegir la temperatura del experimento (con 25 ° C es el más común, aunque las temperaturas entre 2 y 80 ° C se puede utilizar). Lo mejor es elegir una temperatura que coincide con otros experimentos (cinética de unión, etc) realizadas en el sistema ligando macromolécula. El ITC se puede configurar para que se equilibre a una temperatura diferente de la temperatura del experimento. Si el experimento se va a realizar a una temperatura superior a 10 ° C, protegido de la temperatura ambiente, entonces es mejor para ajustar la temperatura de equilibrio para el instrumento dentro de los 5 ° C de la temperatura experimental. Esto disminuirá el tiempo que el instrumento se necesita para alcanzar la temperatura del experimento. La velocidad de agitación de la jeringa también debe tenerse en cuenta. Agitación es necesaria para la mezcla adecuada de los ligandos y macromoléculas durante la titulación, pero algunas proteínas son desestabilizadas por la agitación rápida. Para estos casos, la velocidad de agitación debe ser fijado en una tasa relativamente baja. Una vez que todos los parámetros experimentales se han establecido, entonces el experimento se puede iniciar. </li><li> Una vez que el experimento ha terminado, el ITC puede ser limpiado de acuerdo con el protocolo del fabricante. La solución en la celda de la muestra al final del experimento se puede mantener si los experimentos adicionales en la mezcla compleja macromolécula-ligando se desean. </li><li> Repetir las valoraciones por lo menos una o dos veces más para obtener datos reproducibles. Ejecutar un control en el ligando se valora en el buffer de la célula de muestra para determinar el calor de dilución para el ligando. Para algunos sistemas donde hay información de enlace de cooperación, adicional sobre el proceso de enlace se puede obtener mediante la inyección de la macromolécula en el ligando. Las orientaciones diferentes de inyección puede dar información adicional, que puede ser útil para el ajuste global. 6 </li></ol> 3. Análisis de los datos <ol><li> Ajuste de los datos se pueden realizar fácilmente el uso de macros en cualquier programa de ajuste de datos (normalmente suministrado por el fabricante junto con el instrumento). Cargar el archivo de datos. Compruebe el termograma primas para detectar cualquier signo de burbujas de aire u otros artefactos en la señal. Si hay algún artefactos (tales como picos en la línea de base o los picos cuando no había ninguna inyección en ese momento del tiempo), entonces en cuenta estos puntos de datos, ya que debe ser eliminado. A continuación, cargar los datos de dilución del ligando de control, y restar los datos de disolución de la unión del ligando isoterma. En este momento, eliminar todos los puntos de datos falsos, incluyendo los primeros uno o dos puntos de datos de la titulación donde se producen los artefactos de dilución (consulte el paso 7). </li><li> Seleccione el modelo de datos adecuado (un sitio de unión, dos / múltiples sitios de unión, unión cooperativa, etc) que se utiliza para ajustar los datos. Los datos pueden estar en forma con los supuestos iniciales de los parámetros de ajuste, la estequiometría (n), la entalpía (ΔH) y afinidad (K a). Si el conocimiento previo de la afinidad de unión, o de otros parámetros, se conoce a partir de experimentos ortogonal, entonces estos valores se pueden introducir. Esto ayuda a evitar el ajuste de quedar atrapados en mínimos locales durante el montaje. Una vez que los datos han sido aptos para la primera valoración, repita los pasos 15 y 16 para el resto de las isotermas. Por otra parte, los datos pueden estar en forma todo el mundo mediante programas como SEDPHAT 6. SEDPHAT puede ser particularmente útil en el ajuste global de bases de datos binarios complejas (es decir, las moléculas de A + B) en combinación con conjuntos de datos complejos ternarios (moléculas de A + B + C). Por ejemplo, en unión de la molécula de C a un complejo de AB, que no siempre está claro si podría haber alguna señal debido a la unión de C a A o de B a A (si A no está totalmente saturado). </li><li> Para asegurarse de que los datos no son artefactos del ITC, la afinidad de unión y estequiometría obtenida en el CCI debe ser comparado con un método ortogonal 7,8. Además, el valor de la entalpía del ITC se puede comparar con la entalpía de una parcela de van&#39;t Hoff. 9 También puede resultar útil usar diferentes concentraciones de los ligandos o macromolécula como el valor absoluto de la señal de calor debería incrementarse con la creciente concentración de macromoléculas. Los artefactos tienen más probabilidades de surgir si los topes en la célula y la jeringa no se corresponden. Otra posibilidad para los artefactos surge a partir de muestras impuras. </li><li> Le recomendamos que el usuario comienza con simples valoraciones complejo binario para los cuales hay información previa disponible en K d y stoichiometry. Entonces, si se unen ligandos adicionales, el usuario puede intentar titulaciones ternario más complicado compleja, variando las concentraciones de ligando, y tal vez cambiar la jeringa y componentes de la célula. Una comparación de entalpías de ambos caminos a la formación de complejos ternarios deben ser aditivas como la entalpía es una función de estado. 10 Una vez más, SEDPHAT 6 es probable que sea muy útil aquí. </li></ol> 4. Los resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" /> Figura 1. Un ejemplo representativo de una titulación de buen comportamiento de la unión del cofactor NADPH a E. coli cromosómica de la dihidrofolato reductasa (ecDHFR). Grupo (A) muestra el termograma primas; (B), la isoterma de unión de la forma termograma integrado con el modelo de un sitio en el software de origen, y (C) el ajuste de la isoterma usando el modelo de un sitio de unión a lo largo de SEDPHAT con los residuos en forma. Desde el software de origen, utilizando el modelo de un sitio de unión, n = 1,09 ± 0,02, K d = 0,194 ± 0,001 M, ΔH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, y ΔG = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. Los ataques de los datos mediante Sedphat pagar una n de 0,94 ± 0,01, un d K de 0.195 ± 0.013 ΔM, un ΔH de -22,5 ± 0,2 kcal / mol, TΔS de -13,39 kcal / mol y ΔG de -9.15 kcal / mol.

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry.">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

ITC se ha utilizado ampliamente en el estudio de las interacciones ligando macromolécula, 11 con los estudios que analizan la proteína-ligando, 12 DNA-ligando 13 y el ARN-macromolécula estudios 14. ITC, incluso se puede ejecutar con materiales sólidos, tales como nanopartículas, que forman suspensiones uniformes. 15 Además, los sistemas ternarios, donde ya es uno ligando unido a la macromolécula y un segundo ligando es ajustada, se puede utilizar para determinar la termodinámica de, por ejemplo, la unión de sustrato a un sistema de enzima-cofactor. 7 Los estudios también se puede realizar de moléculas con afinidad de unión muy alta que normalmente superan el límite de detección de la ITC mediante la realización de ensayos de unión competitiva con los más débiles unir ligandos. 16 Información sobre la débil unión ligandos también se puede obtener mediante ensayos de la competencia. 17 El papel del agua en la unión puede ser explorado por el CCI, 18, ​​junto con la dependencia de la entalpía en la reorganización del disolvente. 19 Recientemente, la termodinámica de cambio en la conformación de las variantes de DnaK se midieron tras la unión de ADP y ATP. 20 proteína-proteína de asociación puede ser estudiado por el CCI, dando información sobre los complejos hetero 21, así como en homo-asociación. 22 Efectos de la temperatura en la entalpía de unión dará la capacidad calorífica del enlace de eventos. 2 El número de protones absorbida o liberada tras la unión también se puede determinar a partir de experimentos realizados en los tampones con diferentes entalpías de ionización. 5 Si estudios adicionales ITC se realizan en diferentes valores de pH, el pKa del grupo que participan potencialmente se puede determinar 23. En resumen, las mediciones precisas de la concentración de la macromolécula y el ligando son imprescindibles para un experimento de ITC buena. Concentraciones de las muestras también deben estar dentro de un rango adecuado para obtener datos fiables. Se debe tener cuidado con el buffer de impurezas pequeñas moléculas y los desajustes de pH hará que los artefactos en el termograma.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> 1,7 ml de tubos de microcentrífuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 ml tubos Falcon </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49B </td></tr><tr><td> 2,5 ml jeringa Hamilton </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity

Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es una herramienta útil para la comprensión de la imagen termodinámica completa de una reacción de unión. En las ciencias biológicas, interacciones macromoleculares son esenciales en la comprensión de la maquinaria de la célula. Condiciones experimentales, tales como la amortiguación y la temperatura, se puede adaptar a un sistema particular de unión se está estudiando. Sin embargo, una cuidadosa planificación es necesario, ya que ciertos ligandos y los rangos de concentración de macromoléculas son necesarios para obtener datos útiles. Las concentraciones de la macromolécula y el ligando necesidad de determinar con precisión para obtener resultados fiables. La atención también hay que tener en la preparación de las muestras en forma de impurezas puede afectar significativamente el experimento. Cuando los experimentos CCI, junto con los controles, se llevan a cabo correctamente, la información útil de unión, como la estequiometría, afinidad y entalpía, se obtienen. Al llevar a cabo experimentos adicionales en el marco de amortiguación o condiciones diferentes de temperatura, información más detallada se puede obtener sobre el sistema. Un protocolo para la configuración básica de un experimento ITC se da.

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Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Un protocolo general para el uso de la calorimetría de titulación isotérmica para controlar la termodinámica vinculante para los sistemas biológicos con moderada afinidad de unión se presenta.

Calorimetría de titulación isotérmica para la medición de macromoléculas-ligando de afinidad

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

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52.5K vistas.  University of Tennessee. Un protocolo general para el uso de la calorimetría de titulación isotérmica para controlar la termodinámica vinculante para los sistemas biológicos con moderada afinidad de unión se presenta.

Video: Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

La titulación de coronavirus humanos mediante un ensayo de inmunoperoxidasa

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Investigación

Biología

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

Recogida de concentración variable conjuntos de datos calorimetría de titulación isotérmica para determinar los mecanismos de enlace

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimiento de purificación de afinidad de proteínas marcadas con recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Titulación bioquímica de glucógeno<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Aislamiento a base de afinidad de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos para análisis de expresión génica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

De Alto Rendimiento La titulación de luciferasa que expresan virus recombinantes

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree of compositional heterogeneity of a complex do not usually impede progress in conducting such studies. In contrast, a complex intended for structural characterization should be purified in a state that is both compositionally and structurally homogeneous as well as at a higher concentration than required for proteomics. Recently, there have been significant advances in the application of electron microscopy for structure determination of large macromolecular complexes. This has heightened interest in approaches to purify native complexes of sufficient quality and quantity for structural determination by electron microscopy. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been optimized to extract and purify an 18-subunit, ~ 0.8 MDa ribonucleoprotein assembly from budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) suitable for negative stain and electron cryo microscopy. Herein is detailed the modifications made to the TAP method, the rationale for making these changes, and the approaches taken to assay for a compositionally and structurally homogeneous complex.

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between cells, the extracellular matrix, and soluble and non-soluble chemical factors (e.g., chemoattractants). Standard methods for measuring the migration of cells, such as the Boyden chamber assay, work by counting cells on either side of a divider. These techniques are easy to use; however, they offer little geometric modification for different applications. In contrast, microfluidic devices can be used to observe cell migration with customizable concentration gradients of soluble factors1,2. However, methods for making microfluidics based assays can be difficult to learn.
Here, we describe an easy method for creating cell culture chambers to measure cell migration in response to chemical concentration gradients. Our cell migration chamber method can create different linear concentration gradients in order to study cell migration for a variety of applications. This method is relatively easy to use and is typically performed by undergraduate students.
The microchannel chamber was created by placing an acrylic insert in the shape of the final microchannel chamber well into a Petri dish. After this, poly(dimethylsiloxane) (PDMS) was poured on top of the insert. The PDMS was allowed to harden and then the insert was removed. This allowed for the creation of wells in any desired shape or size. Cells may be subsequently added to the microchannel chamber, and soluble agents can be added to one of the wells by soaking an agarose block in the desired agent. The agarose block is added to one of the wells, and time-lapse images can be taken of the microchannel chamber in order to quantify cell migration. Variations to this method can be made for a given application, making this method highly customizable.

This protocol details a customizable method to measure cell migration in response to chemoattractants that may also be used to determine the diffusion rate of a drug out of a polymer matrix.

Una Cámara personalizable para medir la migración celular

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into protein function. Despite the importance of multi-PTM enrichment studies, few studies investigate more than one PTM at a time, due partially to the expenses, time, and large protein quantities required to perform multiple global proteomic analysis of PTMs. The &#34;one-pot&#34; affinity enrichment detailed in this protocol overcomes these barriers by permitting the simultaneous identification and quantification of peptides with lysine residues containing acetylation and succinylation PTMs with low amounts of sample input. The protocol involves preparation of protein lysate from mouse livers of SIRT5 knockout mice, performance of trypsin digestion, enrichment for PTMs, and performance of mass spectrometric analysis using a data-independent acquisition (DIA) workflow. Because this workflow allows for the enrichment of two PTMs from the same sample simultaneously, it provides a practical tool to study PTM crosstalk without requiring large amounts of samples, and it greatly reduces the time required for sample preparation, data acquisition, and analysis. The DIA component of the workflow provides comprehensive PTM-specific information. This is particularly important when studying PTM site localization, as DIA provides comprehensive sets of fragment ions that can be computationally deciphered to differentiate between different PTM localization isoforms.

This workflow describes the performance of time- and cost-efficient enrichment of multiple protein post-translational modifications (PTMs) simultaneously for quantitative global proteomic analysis. The protocol utilizes peptide-level PTM enrichment with multiple conjugated antibodies, followed by data-independent acquisition mass spectrometry analysis to gain biological insights into PTM crosstalk.

Enriquecimiento de afinidad simultánea de dos modificaciones post-traduccionales para la cuantificación y la localización del sitio

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...