La termoforesis a microescala etiquetada obtiene constantes de disociación, o KD, de diversas interacciones bioquímicas de manera eficiente. Este protocolo y el vídeo que lo acompaña dan la afinidad aproximada por Vam7, la única proteína SNARE soluble en levadura, al ácido fosfatídico. Esta es la forma en que Vam7 se asocia con dos membranas antes de interactuar con otras proteínas.
Este método obtiene KDs rápidamente para diversas interacciones bioquímicas a bajo costo, con alta reproducibilidad y con un costo mínimo de proteínas. Esta técnica es adecuada para el desarrollo farmacéutico en primera etapa, lo que permite que los KD fácilmente obtenibles determinen posibles compuestos de plomo. Antes de comenzar un análisis, encienda el interruptor de encendido en la parte posterior del dispositivo MST y abra el software de control.
Confirme que el equipo está conectado al dispositivo y en estado conectado y establezca el MST Antes en 3 segundos, el MST en 30 segundos y la Recuperación de fluorescencia en después de 1 segundo. Para cada tubo capilar, ingrese el nombre del ligando objetivo, el nombre del analito del ligando, la concentración del objetivo y la concentración de titulación más alta utilizando la relación de titulación de autollen. Seleccione un rango de potencias MST e introduzca valores para cada potencia para probar el ajuste de unión más robusto.
Para preparar muestras de MST etiquetadas, diluya una solución de Vam7-octahistidina a una concentración de 200 nanomolares y un colorante NTA-Atto 647 a una concentración nanomolar de 100, ambos en PBS. Mezcle el Vam7-octahistidina y el tinte NTA-Atto 647 en una proporción volumétrica de 1:1 y deje que la mezcla permanezca a temperatura ambiente protegida de la luz durante 30 minutos. Al final de la incubación, centrífuga la mezcla de colorante y proteína y almacene la solución a 4 grados centígrados hasta unas horas antes de su uso.
Luego, prepare la muestra, tome el ligando teñido y exponga el analito. Para la termoforesis a microescala de la muestra, abra el dispositivo y deslice el estante capilar hacia afuera. Cargue los capilares de muestra en el bastidor con la mayor concentración en la posición uno y seleccione el canal rojo en el software de control.
Luego, cargue el bastidor en el instrumento. A continuación, seleccione un rango de potencia MST e inicie la medición MST de Cap Scan y evalúe la respuesta de desplazamiento. Aquí se muestran los rastros termoforéticos de un ensayo de una titulación 1:1 de DiC8 PA a partir de 500 micromoles contra 50 nanomolares NTA-Atto 647 marcados como dominio Vam7.
Se puede observar la fluorescencia inicial, el salto de tiempo y la termoforesis, lo que permite calcular KD a partir de cualquiera o una combinación de estas mediciones. Se puede trazar una curva de saturación a partir de estos resultados, por ejemplo, para la termoforesis con la salida de salto de tiempo, como se ilustra en el gráfico. Generalmente, los resultados de MST se determinan utilizando la escala logarítmica, teniendo en cuenta la concentración de proteínas para determinar la afinidad de unión seleccionando el modelo KD e ingresando la concentración de proteínas.
Al realizar este protocolo, asegúrese de que la solución esté en el centro del capilar y que no haya burbujas de aire y que el capilar no tenga polvo o solución en el exterior del capilar. La calorimetría de titulación isotérmica o la resonancia de plasmón de superficie podrían utilizarse para validar el KD experimental obtenido. Si existe una posible vinculación cooperativa, el ITC sería el siguiente método lógico realizado, dados los recursos.
Esta técnica ha permitido a los investigadores de biología tradicional incorporar técnicas de detección biofísica en su investigación para determinar las relaciones de vía. Un ejemplo de esta técnica es la lisasa celular con la proteína diana expresada endógenamente, donde la etiqueta GFP es una forma novedosa de realizar un ensayo tradicional de pull-down.
