Este trabalho foi financiado pela NSF conceder MCB-0817827.

Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é uma técnica bem estabelecida que pode determinar todos os parâmetros termodinâmicos (afinidade, entalpia e estequiometria) de uma interação obrigatório em um experimento 1. ITC obras de titulação um reagente em um segundo reagente sob condições isotérmicas. O sinal medido é o calor liberado ou absorvido na interação (ligação) dos dois reagentes. Uma série de injeções são realizadas eo sinal de calor abordagem zero como o reagente limitante torna-se saturado. Ajuste da isoterma dá os parâmetros termodinâmicos. Várias revisões estão disponíveis que descrevem a instrumentação, bem como as contas de coleta de dados e análise. 2,3 calorímetros Enquanto outros estão disponíveis (mais notadamente o ITC 200 com pequenos volumes), aqui nós descrevemos um protocolo geral para a VP-ITC fabricados por MicroCal (agora parte da GE Healthcare). 1. Amostras preparar <ol><li> A fim de preparar a macromolécula e ligante no buffer, algumas possíveis questões precisam ser abordadas. Se encaixa rigorosos exigem concentrações adequadas da macromolécula, a espécie que normalmente entra na célula amostra do ITC, e ligante, as espécies na seringa de injeção. Porque algumas proteínas agregadas à alta concentração necessária para a espécie na seringa de injeção, na maioria das vezes a proteína é carregada para dentro da célula da amostra. A concentração macromolécula ideal é determinada a partir de &quot;c&quot;, o produto da afinidade previsto do sistema, que pode ser estimada utilizando métodos ortogonais antes de usar ITC, ea concentração macromolécula total, onde c = K a * [M]. Valores ótimos de gama c 1-10, 1 embora seja possível obter dados precisos para a fraca ligação de sistemas sob condições específicas experimental com c-valores abaixo do limite inferior. 4 Assim, a concentração deve ser determinada macromolécula com esta gama de c valores em mente (ou seja, para um K a de 10 6 M -1, as concentrações de macromolécula de 1-10 mM deve ser usado). Conhecimento prévio da afinidade de ligação do sistema pode ajudar a minimizar a proteína utilizada para ITC através de uma melhor concepção da experiência ITC. A concentração do ligante deve ser suficientemente grande (7-25 vezes mais concentrado do que o K d para o site mais fraca ligação do ligando), de modo que a saturação ocorre no primeiro terço a metade da titulação. Montagem precisa dos dados também requer a saturação do sinal. Para sistemas com maior afinidade de ligação, uma menor concentração de ligante deve ser usado para evitar a saturação muito cedo na titulação, o que dará se encaixa imprecisas. Uma vez que o calor de controle de diluição (ou seja, a titulação do ligante em buffer) foi subtraído da titulação, a entalpia de saturação deve ser quase nula. </li><li> Porque impurezas pequena molécula pode dar origem a sinais artifactual nas medições ITC, é melhor, se possível, que a macromolécula e ligante ser exaustivamente dialisadas contra tampão. Alternativamente, cromatografia de coluna, dessalinização colunas spin, ou filtros de buffer troca centrífuga (por exemplo, Centricons) pode ser usado para alterar o buffer da macromolécula. Se o ligante é uma molécula pequena, ela pode ser preparado usando o buffer de diálise após a macromolécula dialisada foi ou por diálise contra membranas de diálise com cortes adequados para pequenas moléculas (ou seja, 100-500 Da para um Spectra / Por Float-A-Lyzer ). Diferenças na composição de amortecedor entre o ligante e soluções macromolécula pode levar ao sinal de artefatos a partir do calor da diluição de impurezas nas amostras. Após o preparo, certifique-se o pH da partida macromolécula buffer, e ligante (± 0,05 unidades de pH) como artefatos na entalpia podem surgir devido ao buffer efeitos protonação. 5 Certifique-se de preparar o suficiente de cada espécie. Para experimentos triplicado e um controle de diluição, a quantidade de material necessário vai depender do ITC usado. Mas, para instrumentos mais ITC que têm aproximadamente 2 ml de células da amostra de volume, pelo menos 6-7 ml de solução de macromolécula serão necessários, e pode ser convenientemente preparadas em tubos de 15 ml falcão. Para 300 mL seringas de injeção, 1-2 ml de solução deve ser adequada, e pode ser preparado em tubos ou falcon ou tubos de microcentrífuga. </li><li> , Poeira e outras partículas, pode causar artefatos na linha de base do thermogram ITC. É imperativo que eles sejam removidos antes de executar o experimento. Após a preparação das soluções de reserva da amostra, as amostras devem ser centrifugadas em tubos de microcentrífuga por cinco minutos em 8000 para 14.000 RPM a partículas de pelotas na solução. Remover o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet, e colocá-lo em um novo tubo falcon / microcentrífuga. Se redutores são necessários para manter cisteínas reduzidas, use baixas concentrações e estoques fresca de β-mercaptoethanol, TCEP (tris (2-carboxila) fosfina) ou ditiotreitol para minimizar qualquer tipo de artefato devido à oxidação redutor. Além disso, a presença de solventes orgânicos no tampão (comum para alguns ligantes pequena molécula que pode precisar de metanol ou DMSO, a fim de ser solúvel) pode causar artefatos de sinal. Se solventes orgânicos são necessários para o ligante, então a solução macromolécula também deve conter a mesma concentração para evitar qualquer sinal decorrentes do calor de diluição do solvente orgânico. Pequenas diferenças na composição de amortecedor entre o ligante e macromolécula devido à cosolventes, sais ou pH são possíveis durante a preparação das amostras. É melhor para verificar a diluição do ligante para o buffer de amostras ou o tampão de amostra para a macromolécula para garantir que os sinais de calor resultantes de diferenças no conteúdo de buffer não causar dados decorrentes exclusivamente de artefatos. </li><li> Verificar a concentração da macromolécula e ligante cuidadosamente usando técnicas adequadas ao seu sistema (como as medidas de absorbância, HPLC, ensaios colorimétricos, ensaios BCA para proteínas, etc) para gravar as suas concentrações exatas. Diferenças na concentração real ea concentração usada para se ajustar à isoterma irá causar erros no estequiometria, entalpia e afinidade de ligação determinado a partir da experiência. É comum degas as amostras para evitar artefatos de sinal devido a bolhas de ar ou a liberação de gases dissolvidos durante a titulação, especialmente em altas temperaturas. </li></ol> 2. Configurando o Experimento <ol><li> Verifique se a célula de amostra e uma seringa de injeção são limpos de acordo com o protocolo do fabricante antes de carregar o macromolécula e ligante. Lavar a célula de amostra duas ou três vezes com 1,8 ml de água destilada utilizando a seringa Hamilton (use o cuidado com a seringa de Hamilton como o barril é facilmente quebrada ou a inclinação da agulha). Em seguida enxaguar a célula de amostra várias vezes com 1,8 ml de tampão. Carregar a célula de amostra com 1,8 ml de solução de macromolécula, tomando cuidado para evitar formação de bolhas. </li><li> Preencher a célula de referência com água destilada. Para a maioria dos buffers, água destilada é bom para usar como a solução de referência. No entanto, para buffers com particularmente elevada força iônica ou osmolaridade, é melhor usar o buffer como uma referência. </li><li> Remover bolhas de ar a partir das células de referência e de exemplo usando a seringa Hamilton. Suavemente move a agulha da seringa para cima e para baixo os lados da célula batendo as bolhas que podem estar no fundo da célula e anexado ao poço para o topo da célula. Remova qualquer excesso de volume da amostra e células de referência. </li><li> Anexar uma seringa de plástico para o porto de preenchimento da seringa utilizando tubos. Enxágüe a seringa com água destilada. Siga por um buffer de enxaguar. Certifique-se a seringa de injeção é completamente evacuado por ar através do desenho do sistema. Coloque a agulha da seringa na solução ligante e desenhar a solução ligante com a seringa de injeção até que a seringa inteira está cheia. Continuar a desenhar um pequeno volume em excesso (aproximadamente 50 mL ou mais) à porta e tubos em anexo. Imediatamente fechar a porta de preenchimento de a seringa e retire a seringa tubo e plástico. Purge e reabastecer a seringa de injeção mais duas vezes para remover as bolhas da seringa. Retire a seringa com a solução ligante e limpe o lado com uma kimwipe para remover todas as gotas, tomando cuidado para não tocar a ponta da seringa na kimwipe, pois isso pode remover o volume da seringa. Além disso, tenha cuidado para não bater ou jar a seringa como este também pode causar perda de volume da ponta da seringa. Coloque a seringa dentro da célula da amostra. </li><li> Configurar os parâmetros para a execução do ITC. Para os sistemas de ligação com sinais de calor forte, um grande número de injeções de baixo volume vai dar mais pontos de dados para a montagem (por exemplo, 75 injeções de 3 mL). Para sistemas que têm sinais de calor fraco, um pequeno número de injeções de grande volume são preferíveis (por exemplo, 33 injeções de 8 mL). Mais comumente, menos injeções com maiores volumes de injeção são utilizados. Pode levar várias titulações para otimizar as condições que são melhores para seu sistema. É importante notar que a entalpia de ligação pode ser exotérmico ou endotérmico, dependendo do sistema que está sendo estudado. Infelizmente, alguns sistemas têm sinais de fogo baixo, fazendo com que o calor de reação difícil de determinar. Problemas com tais sistemas podem potencialmente ser superado pelo aumento da concentração da macromolécula, alterar a temperatura do experimento (dependendo da capacidade de calor do sistema de ligação), e / ou alterar o pH ou força iônica do buffer. </li><li> Considere também o espaçamento de tempo entre cada injeção. É imperativo que após cada injecção de ligante, o sistema é dado tempo para o equilíbrio e o sinal de calor retorna à linha de base antes da próxima injeção ocorre. Para a maioria dos sistemas, 3-5 minutos deve ser adequada. O tempo entre as injeções deve ser aumentada para sistemas onde o equilíbrio não ocorre em cinco minutos. </li><li> Porque haverá alguma mistura entre a macromolécula e soluções de ligante na seringa de injeção, uma vez que é inserido na célula de amostra, a primeira injecção dará resultados espúrios. É melhor usar pequenos volumes (eg 2 mL) para o primeiro ou duas injeções (para que eles possam mais tarde ser descartado) e manter as injeções subseqüentes os valores desejados. </li><li> Escolha a temperatura do experimento (com 25 ° C sendo o mais comum, embora as temperaturas entre 2 e 80 ° C pode ser usada). O melhor é escolher uma temperatura que corresponde outros experimentos (ligação, cinética, etc) realizadas no sistema ligante macromolécula. O ITC pode ser configurado para equilibrar a uma temperatura diferente da temperatura do experimento. Se a experiência vai ser realizada a uma temperatura superior a 10 ° C, longe de temperatura ambiente, então é melhor para definir a temperatura de equilíbrio para o instrumento no prazo de 5 ° C da temperatura experimental. Isto irá diminuir o tempo que o instrumento vai demorar para atingir a temperatura do experimento. A velocidade de agitação da seringa também precisa ser considerado. Agitação é necessária para a mistura adequada do ligante e macromoléculas durante a titulação, mas algumas proteínas são desestabilizadas por meio de agitadores rápidos. Para esses casos, a velocidade de agitação deve ser fixado em uma taxa relativamente baixa. Depois que todos os parâmetros experimentais foram criados, em seguida, o experimento pode ser iniciado. </li><li> Uma vez que o experimento tenha terminado, a ITC podem ser limpos de acordo com o protocolo do fabricante. A solução na célula de amostra no final do experimento pode ser mantida se experimentos adicionais sobre a mistura macromolécula-ligante complexos são desejados. </li><li> Repita a titulação, pelo menos, uma ou duas vezes mais para obter dados reprodutíveis. Executar um controle onde o ligante é titulada no buffer na célula de amostra para determinar o calor de diluição para o ligante. Para alguns sistemas onde há cooperativas de informação, de ligação adicionais sobre o processo de ligação pode ser obtida através da injeção da macromolécula no ligante. As orientações de injecção diferentes pode dar informações adicionais, que podem ser úteis para a montagem global. 6 </li></ol> 3. Analisando os dados <ol><li> Ajuste dos dados pode ser facilmente realizada utilizando macros em qualquer programa de ajuste de dados (normalmente fornecido pelo fabricante juntamente com o instrumento). Carregar o arquivo de dados em primeiro lugar. Verifique o termograma-prima para todos os sinais de bolhas de ar ou outros artefatos no sinal. Se houver qualquer tipo de artefato (como picos na linha de base ou picos, quando não havia injeção naquele ponto do tempo), em seguida, observe esses pontos dados como eles devem ser removidos. Em seguida, carregar o ligante dados de controle de diluição, e subtrair os dados ligante de diluição a partir da isoterma de ligação. Neste momento, remova todos os pontos de dados espúrios, incluindo o primeiro de um ou dois pontos de dados da titulação, onde artefatos de diluição ocorrer (consulte a etapa 7). </li><li> Selecione o modelo de dados apropriado (um sítio de ligação, dois / múltiplos sítios de ligação, ligação cooperativa, etc) a ser utilizado para ajustar os dados. Os dados podem ser inseridos com estimativas iniciais dos parâmetros de ajuste, estequiometria (n), entalpia (DH) e afinidade de ligação (K a). Se o conhecimento prévio da afinidade de ligação, ou outros parâmetros, é conhecida a partir de experimentos ortogonal, então estes valores podem ser inseridos. Isso ajuda a evitar o ajuste de ficar preso em mínimos locais durante a montagem. Depois que os dados estejam em boa forma para a primeira titulação, repita os passos 15 e 16 para o resto das isotermas. Alternativamente, os dados podem estar em forma globalmente usando programas como o SEDPHAT 6. SEDPHAT pode ser particularmente útil na montagem global de conjuntos de dados complexos binários (isto é, moléculas de A + B) em combinação com conjuntos de dados complexos ternários (moléculas de A + B + C). Por exemplo, na ligação da molécula de C a um complexo AB, nem sempre é claro se pode haver qualquer sinal devido à ligação de C para A ou de B para A (se A não é totalmente saturado). </li><li> Para garantir que os dados não são artifactual ITC, a afinidade de ligação e estequiometrias obtidas ITC deve ser comparado com um método ortogonal. 7,8 Além disso, o valor de entalpia ITC pode ser comparada com a entalpia a partir de uma trama van&#39;t Hoff 9. Também pode ser útil usar diferentes concentrações do ligante ou macromolécula como o valor absoluto do sinal de calor deve aumentar com o aumento da concentração de macromoléculas. Artefatos são mais susceptíveis de ocorrer se o buffers na célula e seringa não são correspondidos. Outra possibilidade para artefatos surge a partir de amostras impuras. </li><li> Recomendamos que o usuário começar com simples binário titulações complexo para o qual há informações anteriores disponíveis no K d e stoichiometry. Então, se ligantes adicionais de ligação, o usuário pode tentar titulações complexo ternário mais complicado, variando as concentrações de ligante, e talvez mudar a seringa e componentes celulares. A comparação das entalpias de ambos os caminhos para a formação de complexos ternários devem ser aditivo como entalpia é uma função de estado. 10 Novamente, SEDPHAT 6 é provável que seja muito útil aqui. </li></ol> 4. Resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" /> Figura 1. Um exemplo representativo de uma titulação bem-comportado para a ligação do cofator NADPH para E. coli cromossômicas diidrofolato redutase (ecDHFR). Painel (A) mostra o termograma-primas; (B), a isoterma de ligação entre as pessoas aptas thermogram integrada utilizando o modelo de um local no software Origin, e (C) o ajuste da isoterma usando o modelo de um sítio de ligação a partir SEDPHAT junto com resíduos em forma. A partir do software Origin, utilizando o modelo de site de uma ligação, n = 1,09 ± 0,02, K d = 0,194 ± 0,001 mM, DH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, e ÄG = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. Acessos de dados usando Sedphat pagar um n de 0,94 ± 0,01, um K d de 0,195 ± 0,013 ΔM, a DH de -22,5 ± 0,2 kcal / mol, TΔS de -13,39 kcal / mol e ÄG de -9,15 kcal / mol.

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Não há conflitos de interesse declarados.

ITC tem sido amplamente utilizado no estudo de interações ligante macromolécula, 11 com estudos olhando para proteína-ligante, 12 DNA ligante-13 e RNA-macromolécula 14 estudos. ITC pode até mesmo ser executado com materiais sólidos, tais como nanopartículas, que formam suspensões uniforme. 15 Além disso, sistemas ternários, onde um ligante já está ligado à macromolécula e um ligante segundo é titulada, pode ser usado para determinar a termodinâmica, por exemplo, a ligação do substrato a um sistema de enzima cofator. 7 Estudos também pode ser realizada por moléculas com alta afinidade de ligação que, normalmente, exceder o limite de detecção do ITC através da realização de ensaios de competição de ligação com ligantes mais fracos de ligação. 16 Informações sobre a fraca ligação ligantes também podem ser obtidas através dos ensaios de competição. 17 O papel da água na ligação pode ser explorado pela ITC, 18, ​​juntamente com a dependência da entalpia na reorganização do solvente. 19 Recentemente, a termodinâmica de mudança conformacional de variantes DNAK foram medidos sobre ligação de ADP e ATP. 20 associação proteína-proteína pode ser estudada pelo ITC, gerando informações sobre complexos hetero 21, bem como sobre homo-associação. 22 Os efeitos da temperatura na entalpia de ligação dará a capacidade térmica do evento vinculativo. 2 O número de prótons absorvidos ou liberados mediante ligação também pode ser determinada a partir de experimentos realizados em buffers com diferentes entalpias de ionização. 5 Se ITC estudos adicionais são feitas em diferentes valores de pH, em seguida, o pKa do grupo envolvido pode, potencialmente, ser determinada. 23 Para resumir, medidas precisas da concentração da macromolécula e ligante são imperativos para uma experiência boa ITC. Concentrações das amostras também precisa estar dentro de um intervalo adequado para obter dados confiáveis. Cuidados devem ser tomados com a reserva como impurezas pequenas moléculas e inadequações pH causará artefatos no termograma.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> 1,7 mL tubos de microcentrífuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 mL falcon tubos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49b </td></tr><tr><td> 2,5 mL seringa Hamilton </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity

Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é uma ferramenta útil para a compreensão da imagem termodinâmico completo de uma reação de ligação. Em ciências biológicas, as interações macromoleculares são essenciais para a compreensão da maquinaria da célula. Condições experimentais, como tampão e temperatura, pode ser adaptado para o sistema particular de ligação em estudo. No entanto, um planejamento cuidadoso é necessária uma vez que certas ligante e faixas de concentração macromolécula são necessários para obter dados úteis. Concentrações das macromoléculas e ligante necessidade de ser determinado com precisão para resultados confiáveis. Cuidado também deve ser tomado ao preparar as amostras como impurezas podem afetar significativamente a experiência. Quando experimentos ITC, juntamente com os controles, são realizados de forma adequada, informações úteis de ligação, tais como a estequiometria de afinidade, e entalpia, são obtidos. Executando experimentos adicionais com tampão ou condições diferentes de temperatura, informações mais detalhadas podem ser obtidas sobre o sistema. Um protocolo para a configuração básica de um experimento ITC é dado.

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Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Um protocolo geral para o uso da calorimetria de titulação isotérmica para monitorar a termodinâmica obrigatório para os sistemas biológicos com moderada afinidade de ligação é apresentado.

Calorimetria isotérmica de titulação para medição de Macromoléculas-Ligand Affinity

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

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52.7K visualizações.  University of Tennessee. Um protocolo geral para o uso da calorimetria de titulação isotérmica para monitorar a termodinâmica obrigatório para os sistemas biológicos com moderada afinidade de ligação é apresentado.

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Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Mapear o sítio de ligação de um Aptamer no ATP Usando MicroScale termoforese

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Bioquímica

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as an intrinsic probe to characterize virtually every chemical process. Nowadays, this technique is extensively applied to determine thermodynamic parameters of biomolecular binding equilibria. In addition, ITC has been demonstrated to be able of directly measuring kinetics and thermodynamic parameters (kcat, KM, &#916;H) of enzymatic reactions, even though this application is still underexploited. As heat changes spontaneously occur during enzymatic catalysis, ITC does not require any modification or labeling of the system under analysis and can be performed in solution. Moreover, the method needs little amount of material. These properties make ITC an invaluable, powerful and unique tool to study enzyme kinetics in several applications, such as, for example, drug discovery.
In this work an experimental ITC-based method to quantify kinetics and thermodynamics of enzymatic reactions is thoroughly described. This method is applied to determine kcat and KM of the enzymatic hydrolysis of urea by Canavalia ensiformis (jack bean) urease. Calculation of intrinsic molar enthalpy (&#916;Hint) of the reaction is performed. The values thus obtained are consistent with previous data reported in literature, demonstrating the reliability of the methodology.

Isothermal titration calorimetry measures heat flow released or absorbed in chemical reactions. This method can be used to quantify enzyme-catalysis. In this paper, the protocol for instrumental setup, experiment running, and data analysis is generally described, and applied to the characterization of enzymatic urea hydrolysis by jack bean urease.

Hot Catálise Biológica: Calorimetria isotérmica de titulação para caracterizar reações enzimáticas

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

Química

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding interactions. This information is critical in the design of new pharmaceutical compounds. However, many pharmaceutically relevant ligands are chemically unstable at the high temperatures used in DSC analyses. Thus, measuring binding interactions is challenging because the concentrations of ligands and thermally-converted products are constantly changing within the calorimeter cell. Here, we present a protocol using thermolabile ligands and DSC for rapidly obtaining thermodynamic and kinetic information on the folding, binding, and ligand conversion processes. We have applied our method to the DNA aptamer MN4 that binds to the thermolabile ligand cocaine. Using a new global fitting analysis that accounts for thermolabile ligand conversion, the complete set of folding and binding parameters are obtained from a pair of DSC experiments. In addition, we show that the rate constant for thermolabile ligand conversion may be obtained with only one supplementary DSC dataset. The guidelines for identifying and analyzing data from several more complicated scenarios are presented, including irreversible aggregation of the biomolecule, slow folding, slow binding, and rapid depletion of the thermolabile ligand.

We present a protocol for rapid characterization of biomolecular folding and binding interactions with thermolabile ligands using differential scanning calorimetry.

Medição de perfis Biomolecular DSC com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial parameter to compare different ligands, e.g., competitive inhibitors, protein isoforms and mutants, for their binding strength to a binding partner. Dissociation constants are determined by plotting concentrations of bound versus free ligand as binding curves. In contrast, titration curves, in which a signal that is proportional to the concentration of bound ligand is plotted against the total concentration of added ligand, are much easier to record. The signal can be detected spectroscopically and by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This is exemplified in a protocol for a titration ELISA that measures the binding of the snake venom-derived rhodocetin to its immobilized target domain of &#945;2&#946;1 integrin. Titration ELISAs are versatile and widely used. Any pair of interacting proteins can be used as immobilized receptor and soluble ligand, provided that both proteins are pure, and their concentrations are known. The difficulty so far has been to determine the dissociation constant from a titration curve. In this study, a mathematical function underlying titration curves is introduced. Without any error-prone graphical estimation of a saturation yield, this algorithm allows processing of the raw data (signal intensities at different concentrations of added ligand) directly by mathematical evaluation via non-linear regression. Thus, several titration curves can be recorded simultaneously and transformed into a set of characteristic parameters, among them the dissociation constant and the concentration of binding-active receptor, and they can be evaluated statistically. When combined with this algorithm, titration ELISAs gain the advantage of directly presenting the dissociation constant. Therefore, they may be used more efficiently in the future.

A detailed protocol to perform a titration ELISA is described. Moreover, a novel algorithm is presented to evaluate titration ELISAs and to obtain a dissociation constant of binding of a soluble ligand to a microtiter plate-immobilized receptor.

Titulação ELISA como um método para determinar a constante de dissociação de interação do ligante do Receptor

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed after a single injection of the substrate solution into an enzyme solution is correlated with enzyme activity. Multiple injections of the substrate into the same enzyme solution over time show the loss of enzyme activity. The assay is autonomous, requiring very little personnel time, and is applicable to most media and enzymes.&#160; &#160;

The thermal stability of enzyme activity is readily measured by isothermal titration calorimetry (ITC). Most protein stability assays currently used measure protein unfolding, but do not provide information about enzymatic activity. ITC enables direct determination of the effect of enzyme modifications on the stability of enzyme activity.

Medição de estabilidade enzimática por calorimetria de Titulação Isotérmica

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...

Ambiente

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

Determinando a associação termodinâmica e cinética de um aptamer de DNA e tetraciclina usando calorimetria de titulação isotérmica

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

Coleta variável concentração Datasets Calorimetria Isotérmica de Titulação a fim de determinar mecanismos de ligação

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

Biologia

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinação de interacções proteína-ligante Usando Differential Scanning Fluorimetria

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...