이 작품은 NSF 교부금 MCB - 0817827에 의해 지원되었다.

등온 적정의 열량 (ITC는) 1 실험에 바인딩 상호 작용의 모든 열역학적 파라미터를 (친화력, 엔탈피 및 stoichiometry)를 확인할 수 있습니다 잘 구축 기법입니다. 1 ITC는 등온 조건에서 두 번째 반응물 하나의 반응물을 titrating으로 작동합니다. 측정된 신호는 두 reactants의 상호 작용 (결합)에 따라 공개 또는 흡수 열 수 있습니다. 주사 일련의이 수행되고 제한 반응물이 포화되면서 열 신호가 제로 접근합니다. 등온의 피팅은 열역학적 파라미터를 제공합니다. 여러 리뷰 계측뿐만 아니라 데이터 수집 및 분석의 수학을 설명하는 것이 가능합니다. 2,3 다른 calorimeters를 사용할 수 있지만 (특히 작은 볼륨으로 ITC 200), 여기서 우리는 VP - ITC에 대한 일반적인 프로토콜을 제작 설명 MicroCal로 (현 GE 헬스케어의 일부). 1. 준비 샘플 <ol><li> 버퍼에 macromolecule와 리간드를 준비하기 위해 몇 가지 잠재적인 문제가 해결해야합니다. 정확한 맞는가 macromolecule의 적절한 농도, 일반적으로 샘플 ITC의 세포와 리간드에서 통용되는 종, 사출 주사기에 수종이 필요합니다. 어떤 단백질은 사출 주사기의 수종에 필요한 높은 농도에서 집계하기 때문에, 대부분 단백질은 샘플 셀로로드됩니다. 최적의 macromolecule 농도는 ITC를 사용하기 전에 직교 방법을 사용하여 예상 수있다 &quot;C&quot;, 시스템의 예측 친화력의 제품, 그리고 전체 macromolecule 농도에서 결정된다 여기서 C = K * [M]. 10-1000, 1 C 범위의 최적 가치가 낮은 한도 이하로 C - 가치관과 구체적인 실험 조건 약한 결합 시스템에 대한 정확한 데이터를 얻을 수 있습니다하지만. 따라서 4, macromolecule 농도는이 범위를 함께 결정되어야합니다 마음에 C 값 (즉, K에 대해 10 6 M -1이, 10-1000 μm의 macromolecule의 농도를 사용해야합니다.) 시스템의 바인딩 친화력의 사전 지식은 ITC의 실험의 더 나은 디자인을 통해 ITC에 사용되는 단백질을 최소화 도움이 될 수 있습니다. 그 채도가 적정의 절반을 가장 먼저 셋째 내에서 발생 때문에 리간드의 농도는 (약한 리간드 바인딩 사이트에 대한 K D보다 더 집중적으로 7-25 배) 정도로 커야합니다. 데이터의 정확한 피팅은 또한 신호의 채도를 필요로합니다. 높은 바인딩 친화력있는 시스템의 경우, 낮은 리간드 농도가 정확하게 맞는를 줄 것이다있는, 너무 일찍 적정의 채도를 방지하는 데 사용해야합니다. 일단 희석 컨트롤의 열 (버퍼로 리간드의 즉, 적정)가 적정에서 빼는되었습니다, 채도의 엔탈피는 제로 접근해야합니다. </li><li> 작은 분자 불순물이 ITC 측정에 artifactual 신호 상승을 줄 수 있기 때문에, 그것은 macromolecule와 리간드가 철저하게 버퍼에 대한 dialyzed하는 것이 가능하면 좋습니다. 또는, 칼럼 크로마 토그래피, 스핀 컬럼을 탈염, 또는 버퍼 교환 원심 필터 (예를 들어, Centricons)은 macromolecule의 버퍼를 변경하는 데 사용할 수 있습니다. 리간드는 작은 분자있다​​면, 그것은 macromolecule가 (스펙트럼 / 포 플로트 - A - Lyzer에 대한 즉, 100-500 다 작은 분자에 적합한 단절과 투석 점막에 대한 dialyzing에 의해 dialyzed 또는 이후 투석 버퍼를 사용하여 준비할 수 ). 리간드와 macromolecule 솔루션 사이의 버퍼 구성의 차이는 샘플의 불순물의 희석의 더위에서 유물을 신호로 이어질 수 있습니다. 준비 후, 엔탈피의 유물로 버퍼, macromolecule 및 리간드와 일치의 PH (± 0.05 산도 단위)가 protonation 효과를 버퍼로 인해 발생할 수 있는지 확인하십시오. 5 각 종 충분한 준비를해야합니다. 세중의 실험과 희석 제어, 필요한 자료의 금액은 사용 ITC에 따라 달라집니다. 그러나, 대략 2 ML 볼륨 샘플 세포를 대부분 ITC기구, macromolecule 솔루션의 적어도 6-7 ML이 필요한 것이며, 편​​리한 15 매 ML 튜브에 준비하실 수 있습니다. 300 μL 주입 주사기 들어, 솔루션 1-2 ML은 충분해야하고, 팔콘 튜브 또는 microcentrifuge 튜브 하나에 준비하실 수 있습니다. </li><li> 먼지 및 기타 입자는 ITC의 열상의 기준에 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 그것은 그들이 실험을 실행하기 전에 제거하는 것이 필수적입니다. 샘플 주식 솔루션의 준비 후, 샘플이 8000에서 솔루션에 펠렛 입자에 14,000 RPM으로 5 분 동안 microcentrifuge 튜브에 centrifuged해야합니다. , 뜨는을 제거 펠렛을 방해하지 않도록주의하고, 그리고 새로운 매 / microcentrifuge 관에 놓으십시오. reductants이 감소 cysteine​​s를 유지하는 데 필요한 경우, β - merca의 낮은 농도와 신선한 주식을 사용하여ptoethanol, TCEP (트리스 (2 - 카르 복실) phosphine) 또는 dithiothreitol이 reductant 산화로 인해 어떤 유물을 최소화하기 위해. 또한, 버퍼에 유기 용제의 존재는 (용해되기 위해서는 메탄올이나 DMSO가 필요할 수 있습니다 몇 가지 작은 분자 리간드에 대한 일반) 신호 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 유기 용제는 리간드에 필요한 경우 다음 macromolecule 솔루션은 또한 유기 용매의 희석의 열을 발생하는 모든 신호를 피하기 위해 같은 농도를 포함해야합니다. 리간드와 cosolvents로 인해 macromolecule 사이의 버퍼 구성에 약간의 차이는, 염분이나 산도는 시료의 준비 기간 동안 가능합니다. 이것은 버퍼 내용의 차이에서 발생하는 열 신호가 전적으로 유물에서 발생하는 데이터를 발생하지 않도록 macromolecule에 샘플 버퍼 또는 샘플 버퍼에 리간드의 희석을 확인하는 것이 좋습니다. </li><li> 신중하게 자신의 정확한 농도를 기록하는 시스템에 적합한 기술 (예 : 흡광도 측정, HPLC, colorimetric assays, 단백질에 대한 BCA의 assays 등)를 사용하여 macromolecule과 리간드의 농도를 확인합니다. 실제 농도와 등온에 맞게 사용 농도 차이는 stoichiometry, 엔탈피 및 실험에서 결정 바인딩 친화력에 오류가 발생할 것입니다. 그것은 특히 높은 온도에서 공기 방울이나 적정 중에 녹아 가스의 출시로 인한 신호 유물을 피하기 위해 데가스 샘플에 일반적입니다. </li></ol> 2. 실험 설정 <ol><li> 샘플 셀 및 주입 주사기는 macromolecule와 리간드를 로딩하기 전에 제조 업체의 프로토콜에 따라 청소 있는지 확인하십시오. 해밀턴 주사기 (총신 쉽게 고장으로 해밀턴 주사기 또는 바늘을 구부리고 치료를 사용)를 사용하는 증류수의 1.8 ML로 샘플 셀에게 두 세 번 씻어. 다음 버퍼의 1.8 ML로 샘플 셀 여러 번 씻어. 거품 형성을 피하기 위해주의되는, macromolecule 솔루션 1.8 ML로 샘플 셀을로드합니다. </li><li> 증류수로 참조 셀을 채웁니다. 대부분의 버퍼 경우, 증류수는 참조 솔루션으로 사용 괜찮아요. 그러나, 특히 높은 이온 강도 또는 osmolality와 버퍼를 위해, 이것은 참고로 버퍼를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 해밀턴 주사기를 사용하여 참조 및 샘플 세포에서 기포를 제거합니다. 부드럽게 세포의 하단에하고 세포의 상단에 잘 연결된 수있는 거품을 두드리는 세포의 측면 상하 주사기의 바늘을 이동합니다. 샘플 및 참조 세포에서 초과 볼륨을 제거합니다. </li><li> 튜브를 사용하여 사출 주사기의 입력 포트에 플라스틱 주사기를 첨부하십시오. 증류수로 분사 주사기 린스. 버퍼 린스로 따르십시오. 사출 주사기 완전히 시스템을 통해 공기를 그림으로써 철수 있는지 확인하십시오. 전체 주사기가 가득 때까지 리간드 솔루션에 분사 주사기의 바늘을 놓고 사출 주사기로 리간드 솔루션을 그립니다. 항구와 연결된 튜브에 약간의 여분의 볼륨을 (약 50 μl 이상) 도면 계속합니다. 즉시 주사기의 입력 포트를 닫고 튜브 및 플라스틱 주사기를 분리합니다. 주사기에서 모든 거품을 제거하는 정화 및 리필 사출 주사기 두 번 더. 리간드 솔루션에서 주사기를 제거하고 이것은 주사기에서 볼륨을 제거할 수로 kimwipe에 주사기 팁 만지지 않도록 조심하고, 어떤 방울을 제거하는 kimwipe과 측면을 닦아 내십시오. 또한,이 또한 주사기 팁에서 볼륨의 손실을 일으킬 수있는 주사기를 노크 또는 병 않도록주의합니다. 샘플 세포에 주입 주사기를 놓습니다. </li><li> ITC를 실행하기위한 매개 변수를 설정합니다. 강력한 열 신호 바인딩 시스템에 낮은 볼륨 주사의 많은 수의 피팅에 대한 더 많은 데이터 포인트 (3 μl의 예 : 75 주사)를 제공합니다. 약한 열 신호를 가지고 시스템을위한, 큰 볼륨 주사의 소수 (8 μl의 예 : 33 주사) 바람직합니다. 가장 일반적으로 높은 사출 볼륨과 적은 주사이 사용됩니다. 그것은 여러분의 시스템에 가장 적합한 조건을 최적화하기위한 몇 가지 titrations 걸릴 수 있습니다. 바인딩 엔탈피 역시 연구되고있는 시스템에 따라, 발열 또는 흡열 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 불행히도 어떤 시스템은 결정하기 위해 반응의 열기가 어렵게 낮은 열 신호를합니다. 이러한 시스템과 문제가 잠재적으로, macromolecule의 농도를 증가 실험 (바인딩 시스템의 열 용량에 따라), 그리고 /의 온도를 변경하거나 산도 또는 버퍼의 이온 강도를 변경하여 극복할 수 있습니다. </li><li> 또한 각 주사 사이의 시간 간격을 고려하십시오. 그것은 리간드의 각 주입 후, 시스템이 평형 시간이 주어집니다 것이 필수적이며 다음 주입이 발생하기 전에 열 신호가 기준으로 돌아갑니다. 대부분의 시스템, 3-5 마일을 위해nutes 충분해야합니다. 주사 사이의 시간은 평균 5 분 이내에 발생하지 않습니다 시스템에 대한 증가한다. </li><li> 그것이 샘플 세포에 삽입되면 사출 주사기에 macromolecule와 리간드 솔루션 사이 혼합있을 것입니다 때문에, 첫 번째 주사는 가짜 결과를 줄 것이다. 이것은 첫 번째 또는 두 주사 (그래서 그들은 나중에 삭제 가능)에 대한 작은 볼륨 (예 : 2 μl)을 사용하여 원하는 값을에서 후속 주사를 유지하는 것이 좋습니다. </li><li> 실험의 온도 (25 ° C 2와 80 사이의 기온 ° C를 사용할 수 있지만, 가장 일반되는).를 선택하세요 리간드 - macromolecule 시스템에서 수행된 다른 실험 (구속, 운동 등)에 맞는 온도를 선택하는 것이 좋습니다. ITC는 실험의 온도와 다른 온도에서 평형까지 설정할 수 있습니다. 실험이 10 개 이상 ° C 떨어진 상온에서 온도에서 수행 될 경우, 다음 5에 포함된 악기 ° 실험 온도의 C에 대한 평균 온도를 설정하는 것이 좋습니다. 이 악기는 실험 온도에 도달하는 데 걸리는 시간을 줄일 수 있습니다. 주사기의 교반 속도도 고려되어야합니다. 감동은 적정 동안 리간드와 macromolecule의 적절한 혼합에 필요한 있지만, 일부 단백질은 빠른 교반에 의해 불안 정한됩니다. 이런 경우, 교반 속도는 상대적으로 낮은 속도로 설정해야합니다. 일단 모든 실험 매개 변수는 다음 실험을 시작할 수 있습니다, 설정되었습니다. </li><li> 실험이 완료되면, ITC는 제조 업체의 프로토콜에 따라 청소하실 수 있습니다. macromolecule - 리간드 복잡한 혼합물에 대한 추가 실험이 원하는 경우에는 실험의 끝에 샘플 세포의 솔루션은 보관하실 수 있습니다. </li><li> titrations에게 재현성 데이터를 얻을 적어도 한 두 번 더 반복합니다. 리간드는 리간드에 대한 희석의 더위를 결정하는 샘플 셀에 버퍼로 titrated되는 컨트롤을 실행합니다. 바인딩 프로세스에 대한 협력 구속력 추가 정보가 어떤 시스템에 대한 리간드로 macromolecule를 주사하여 얻은 수 있습니다. 다른 분사 방향은 세계적인 피팅을 위해 도움이 될 수있는 추가 정보를 제공할 수 있습니다. 6 </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 데이터 피팅 쉽게 데이터 피팅 프로그램 (일반적으로 악기와 함께 제조 업체에서 제공)에 매크로를 사용하여 수행할 수 있습니다. 첫 번째 데이터 파일을로드합니다. 신호에 공기 방울이나 기타 유물의 흔적을 그대로 열상을 확인합니다. 어떤 유물들이 (예 : 그 시점에서 더 주입이 없었 기준이나 봉우리에서 스파이크 등)가있다면 그들은 제거되어야 겠지만, 그렇게되면 이러한 데이터 포인트를 기록해 둡니다. 다음 리간드 희석 제어 데이터를로드하고, 바인딩 등온에서 리간드 희석 데이터를 뺍니다. 이때 희석 아티팩트가 발생 적정의 첫 번째 또는 두 개의 데이터 포인트 (7 단계 참조)를 포함하여 모든 가짜 데이터 포인트를 제거합니다. </li><li> 데이터를 맞게하는 데 사용할 데이터 피팅 모델 (한 구속력이 사이트를 두 / 다중 바인딩 사이트, 협동 바인딩 등)을 선택합니다. 데이터는 (K) 피팅 매개 변수, stoichiometry (N), 엔탈피 (ΔH)와 바인딩 친화력의 초기 추측에 맞게 수 있습니다. 바인딩 친화력, 또는 다른 매개 변수의 사전 지식, 직교 실험에서 알려져있다면,이 값을 입력할 수 있습니다. 이것은 맞는 동안 지역 minima에 갇혀되는 발작을 방지하는 데 도움이됩니다. 데이터가 처음으로 적정에 맞는되었습니다되면, 등온선의 나머지 단계 15, 16를 반복합니다. 또는 데이터가 전 세계적으로 같은 SEDPHAT 같은 프로그램을 사용하여 들어갈 수 있습니다 6. SEDPHAT가 셋으로 이루어지는 복잡한 데이터 세트와 함께 바이너리 복잡한 데이터 세트 (즉, 분자 A + B)의 글로벌 피팅 특히 도움이 될 수있다 (분자 A + B + C). 예를 들어, AB 복합 분자 C의 결합에서, 그것은 (가 완전히 포화되지 않은 경우)로 A 또는 B의에 C의 바인딩으로 인한 신호가있을 수도 있습니다 여부를 항상 명확하지 않습니다. </li><li> ITC 데이터 artifactual되지 않도록하려면 바인딩 친화력과 ITC에서 얻은 stoichiometries은 직교 방식과 비교해야합니다. 또한 7,8, ITC의 엔탈피 값을 van&#39;t 호프 플롯에서 엔탈피 비교할 수 있습니다. 9 또한 열 신호의 절대값이 증가 macromolecule 농도로 증가한다 같이 리간드 또는 macromolecule의 다른 농도를 사용하는 데 도움이 될 수 있습니다. 유물은 세포와 주사기에있는 버퍼가 일치되지 않을 경우 발생할 가능성이 가장 높은 수 있습니다. 유물에 대한 또 다른 가능성은 불순한 샘플에서 발생한다. </li><li> 우리는 K D와 stoich에서 제공 이전에 정보가있는 사용자가 간단한 이진 복잡한 titrations 시작하는 것이 좋습니다iometry. 그런 다음, 추가 리간드가 구속 경우, 사용자는 리간드의 농도 변화, 더 복잡한 3 원 콤플렉스 titrations을 시도 수 있으며, 아마도 주사기와 세포 구성 요소를 전환합니다. 엔탈피는 상태 함수이므로 셋으로 이루어지는 복잡한 형성하는 두 경로에 대해 enthalpies의 비교 첨가제해야합니다. 10 다시, SEDPHAT 6 여기에 꽤 도움이 될 가능성이 높습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" /> 그림 1. E.에 cofactor NADPH의 바인딩에 대해 잘 행동 적정의 대표 예 대장균 염색체 dihydrofolate 환원 효소 (ecDHFR). 패널 (A)는 원시 열상을 보여줍니다, (B), 통합 열상에 맞는에서 바인딩 등온선은 기원 소프트웨어의 한 사이트 모델을 사용하며, (C) 등온의 적합 따라 SEDPHAT에서 한 바인딩 사이트 모델을 사용 맞는 residuals과 함께. 기원 소프트웨어에서 하나의 사이트 바인딩 모델을 사용, N = 1.09 ± 0.02, K D = 0.194 ± 0.001 μm의, ΔH = -22.7 ± 0.4 kcal / 몰, TΔS = -13.1 ± 0.4 kcal / 몰, 및 ΔG = - 9.16 ± 0.01 kcal / 몰. Sedphat은 0.94의 N 여유가 사용하는 데이터의 적합한 ± 0.01, 0.195의 K D ± 0.013 ΔM, -22.5의 ΔH ± 0.2 kcal / 몰, -13.39의 TΔS kcal / 몰 및 -9.15 kcal / 몰의 ΔG.

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+ferredoxin+binding+to+ferredoxin:NADP++reductase+and+the+role+of+water+at+the+complex+interface.">Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface.</a> Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).</li><li>Burrows, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+monomer-dimer+equilibrium+of+interleukin-8+reveals+it+is+a+monomer+at+physiological+concentration.">Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration.</a> Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).</li><li>Baker, B. M., Murphy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry.">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

ITC 12 DNA - 리간드 13 RNA - macromolecule 14 연구, 단백질 - 리간드를보고 연구에 리간드 macromolecule 상호 작용, 11 공부에 광범위하게 사용되고 있습니다. ITC는 심지어 유니폼 suspensions을 형성 등 nanoparticles과 같은 고체 재료, 함께 실행할 수 있습니다. 나아가 15, 하나 리간드가 이미 macromolecule에 바인딩하고 두 번째 리간드가 titrated는 3 원 시스템,의 열역학을 결정하는 데 사용할 수에 대한 예를는 효소 - cofactor 시스템 기판의 결합. 7 연구하는 것은 또한 일반적으로 약한 결합 리간드와 경쟁 바인딩 assays를 수행하여 ITC의 검출 한도를 초과 매우 높은 바인딩 동질성과 분자에 대해 수행할 수 있습니다. 약하게 구속 16 정보 리간드 또한 경쟁 assays에 의해 얻을 수 있습니다. 17이 바인딩에서 물의 역할은 용매 개편에 대한 엔탈피의 의존도와 함께 ITC, 18으로 살펴 수 있습니다. 최근에는 19, DNAK 변종의 conformational 변화의 열역학은의 바인딩에 따라 측정되었다 바인딩 엔탈피에 ADP와 ATP. 20 단백질 - 단백질 협회는 이종의 단지 21뿐만 아니라 게이 협회에 관한 정보를 항복, ITC에서 공부하실 수 있습니다. 22 온도 효과는 바인딩 이벤트의 열 용량을 제공합니다. 2 번호를 추가 ITC 연구는 다른 산도 값에서 수행하는 경우에는 양자가 흡수하거나 바인딩에 출시도 이온화의 다른 enthalpies와 버퍼에서 수행 실험에서 확인할 수 있습니다. 5 다음 관련 그룹의 pKa는 잠재적으로 결정하실 수 있습니다. 23 요약하면, macromolecule과 리간드의 농도의 정확한 측정 좋은 ITC 실험을 위해 필수적입니다. 샘플 농도는 신뢰할 수있는 데이터를 얻을 수있는 적절한 범위 내에서해야합니다. 작은 분자의 불순물과 산도의 불일치는 열상의 아티팩트의 원인이되므로주의가 버퍼로 이동한다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 1.7 ML microcentrifuge 튜브 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 ML 팔콘 튜브 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 14-959 - 49B </td></tr><tr><td> 2.5 ML 해밀턴 주사기 </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity

등온 적정의 열량 (ITC)는 구속력있는 반응의 전체 열역학적 그림을 이해하기위한 유용한 도구입니다. 생명 공학, macromolecular 상호 작용은 세포의 기계를 이해 필수적입니다. 이러한 버퍼 및 온도와 같은 실험 조건, 연구중인 특정 바인딩 시스템에 맞출 수 있습니다. 특정 리간드와 macromolecule 농도 범위가 유용한 데이터를 얻기 위해 필요한 때문에 그러나, 신중한 계획이 필요합니다. macromolecule과 리간드의 농도는 정확하게 신뢰할 수있는 결과를 결정해야합니다. 관리는 또한 불순물이 상당히 실험에 영향을 미칠 수있는 샘플을 준비할 때 이동해야합니다. 같은 stoichiometry, 친화력 및 엔탈피와 같은 컨트롤과 함께 ITC 실험은, 제대로 수행하는 유용한 바인딩 정보는 얻을 수 있습니다. 다른 버퍼 또는 온도 조건 하에서 추가적인 실험을 실행하여, 자세한 정보는 시스템에 대한 구할 수 있습니다. ITC 실험의 기본 설정을위한 프로토콜이 제공됩니다.

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Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

적당한 바인딩 동질성과 생물 학적 시스템에 대한 바인딩을 열역학을 모니터하는 등온 적정의 열량의 사용에 대한 일반적인 프로토콜이 제공됩니다.

Macromolecule - 리간드 친화력을 측정하기위한 등온 적정의 열량

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

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52.5K 조회수.  University of Tennessee. 적당한 바인딩 동질성과 생물 학적 시스템에 대한 바인딩을 열역학을 모니터하는 등온 적정의 열량의 사용에 대한 일반적인 프로토콜이 제공됩니다.

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Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

Immunoperoxidase 분석을 사용하여 인간 Coronaviruses의 적정

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

연구

생물학

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

바인딩 메커니즘을 결정하기 위해 가변 농도 등온 적정의 열량의 데이터 세트를 수집

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

글리코겐의 생화학 적정<em&gt; 체외</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

루시 페라 제 발현 재조합 바이러스의 높은 처리량의 적정

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree of compositional heterogeneity of a complex do not usually impede progress in conducting such studies. In contrast, a complex intended for structural characterization should be purified in a state that is both compositionally and structurally homogeneous as well as at a higher concentration than required for proteomics. Recently, there have been significant advances in the application of electron microscopy for structure determination of large macromolecular complexes. This has heightened interest in approaches to purify native complexes of sufficient quality and quantity for structural determination by electron microscopy. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been optimized to extract and purify an 18-subunit, ~ 0.8 MDa ribonucleoprotein assembly from budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) suitable for negative stain and electron cryo microscopy. Herein is detailed the modifications made to the TAP method, the rationale for making these changes, and the approaches taken to assay for a compositionally and structurally homogeneous complex.

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 구조 연구에 대한 기본 공단의 정화

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between cells, the extracellular matrix, and soluble and non-soluble chemical factors (e.g., chemoattractants). Standard methods for measuring the migration of cells, such as the Boyden chamber assay, work by counting cells on either side of a divider. These techniques are easy to use; however, they offer little geometric modification for different applications. In contrast, microfluidic devices can be used to observe cell migration with customizable concentration gradients of soluble factors1,2. However, methods for making microfluidics based assays can be difficult to learn.
Here, we describe an easy method for creating cell culture chambers to measure cell migration in response to chemical concentration gradients. Our cell migration chamber method can create different linear concentration gradients in order to study cell migration for a variety of applications. This method is relatively easy to use and is typically performed by undergraduate students.
The microchannel chamber was created by placing an acrylic insert in the shape of the final microchannel chamber well into a Petri dish. After this, poly(dimethylsiloxane) (PDMS) was poured on top of the insert. The PDMS was allowed to harden and then the insert was removed. This allowed for the creation of wells in any desired shape or size. Cells may be subsequently added to the microchannel chamber, and soluble agents can be added to one of the wells by soaking an agarose block in the desired agent. The agarose block is added to one of the wells, and time-lapse images can be taken of the microchannel chamber in order to quantify cell migration. Variations to this method can be made for a given application, making this method highly customizable.

This protocol details a customizable method to measure cell migration in response to chemoattractants that may also be used to determine the diffusion rate of a drug out of a polymer matrix.

측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into protein function. Despite the importance of multi-PTM enrichment studies, few studies investigate more than one PTM at a time, due partially to the expenses, time, and large protein quantities required to perform multiple global proteomic analysis of PTMs. The &#34;one-pot&#34; affinity enrichment detailed in this protocol overcomes these barriers by permitting the simultaneous identification and quantification of peptides with lysine residues containing acetylation and succinylation PTMs with low amounts of sample input. The protocol involves preparation of protein lysate from mouse livers of SIRT5 knockout mice, performance of trypsin digestion, enrichment for PTMs, and performance of mass spectrometric analysis using a data-independent acquisition (DIA) workflow. Because this workflow allows for the enrichment of two PTMs from the same sample simultaneously, it provides a practical tool to study PTM crosstalk without requiring large amounts of samples, and it greatly reduces the time required for sample preparation, data acquisition, and analysis. The DIA component of the workflow provides comprehensive PTM-specific information. This is particularly important when studying PTM site localization, as DIA provides comprehensive sets of fragment ions that can be computationally deciphered to differentiate between different PTM localization isoforms.

This workflow describes the performance of time- and cost-efficient enrichment of multiple protein post-translational modifications (PTMs) simultaneously for quantitative global proteomic analysis. The protocol utilizes peptide-level PTM enrichment with multiple conjugated antibodies, followed by data-independent acquisition mass spectrometry analysis to gain biological insights into PTM crosstalk.

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...