Agradecemos al Dr. Alan Tessler por sus comentarios y ayuda editorial. Este trabajo fue apoyado por el NIH NS062320.

1. Microscopio de configurar y preparación de imágenes <ol><li> Nuestra imagen creada se compone de un microscopio estereoscópico Leica MZ16 fluorescentes con una velocidad de obturación rápida y una cámara CCD enfriado controlado por el software Metamorph. </li><li> Prepare una almohadilla térmica de temperatura controlada y ajustar la producción a 32,5 ° C para mantener la temperatura corporal del animal durante y después de la cirugía. </li><li> Ringer tibia estéril la solución o líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) a 32,5 ° C de antemano para el riego de la médula espinal durante la cirugía. </li><li> Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de xilazina (8 mg / kg) y ketamina (120 mg / kg) de cóctel. </li><li> Afeitarse la parte superior con una maquinilla de pequeños animales y difundir una pequeña gota de crema de depilación en el área afeitada con punta de algodón, hisopos. Minutos más tarde, eliminar la loción aplicada al 70% de etanol esponjas gasa empapada. </li></ol> 2. Laminectomía y la exposición quirúrgica de la raíz dorsal L5 <ol><li> Colocar el animal en una piscina climatizada (32,5 ° C) pad y desinfectar la piel con esponjas empapadas etanol al 70%. </li><li> Bajo la iluminación de campo claro en el microscopio estereoscópico, realizar una incisión (2 - 3 cm) en la piel de la espalda. Si es necesario, utilizar aplicadores de algodón para detener el sangrado. </li><li> Reflejan la musculatura vertebral para exponer las vértebras lumbares subyacente. </li><li> Exponer los segmentos L3-S1 espinal por el lado derecho hemi-laminectomía usando pinzas pequeñas. Una laminectomía parcial de la exposición de 4-6 segmentos de la médula espinal lumbar y sacra se crea mediante la eliminación de la parte derecha posterior de la vértebra L5 a nivel de la cresta ilíaca de la cadera (la ubicación de DRG L5) rostral de la vértebra L2 (2 vértebras caudales de la última costilla). Perfundir la cavidad con solución de Ringer estéril caliente de. </li><li> La posición del animal en un cojín de apoyo (gasa de algodón laminado) para aplanar la columna vertebral. Use ganchos de retracción para ampliar el área expuesta. </li><li> En este punto (aproximadamente 30 minutos después de la primera inyección ip de anestesia, un suplemento (0.5X) debe inyectarse por vía subcutánea con el fin de mantener al animal anestesiado completamente. Por otra parte, el gas de anestesia (2-4% isoflurano en oxígeno 0.5L/min ) puede ser utilizado para anestesia repetida durante las sesiones de formación de imágenes más de 1 hora. </li></ol> 3. Rizotomía / aplastar a la raíz dorsal <ol><li> Cambiar a la excitación de fluorescencia para visualizar YFP etiquetados (+) los axones. </li><li> Con la punta de un Sub-Q (26ga.) aguja, realizar una pequeña incisión en la duramadre que recubre la raíz L5 dorsal (DR). Perfundir en varias ocasiones con solución de Ringer y limpia suavemente con aplicadores de algodón. </li><li> Identifique el sitio de ser aplastado e insertar un lado de la pinza fina (Dumont # 5) subdurally. </li><li> Cerrar las pinzas suavemente pero con firmeza, manteniendo la parte medial de la raíz L5 por 10 segundos, y luego suavemente suelte el fórceps. </li><li> Lavar repetidas veces con solución fisiológica y limpia suavemente con aplicadores de algodón. </li></ol> 4. De adquisición de imágenes y procedimientos de post-op <ol><li> Obtener varias imágenes de toda la zona expuesta incluyendo el sitio de aplastar y DREZ el antes y el después de la aglomeración, tanto en la ampliación de baja y alta. </li><li> Las imágenes se adquieren, ya sea como imágenes individuales o múltiples flujos de 10 a 20 cuadros adquiridos dentro de los 30 - al tiempo de exposición de 40 ms. En enfocar las imágenes son seleccionadas, y un montaje panorama más tarde se crea el uso de Photoshop. </li><li> Para minimizar la formación de cicatrices, bien aplicar un pedazo de membrana delgada matriz sintética (Biobrane), seguido por artificial dura, en la parte superior de la médula espinal expuesta. Asegúrese de cortar las piezas a encajar con precisión en la ventana de la médula espinal expuesta de modo que se adhieren a la médula espinal. </li><li> Cerca de la musculatura con 5-0 suturas estériles y cerrar la incisión de línea media con clips de la herida. </li><li> Inyectar la solución de Ringer (0,3 a 0,5 ml por vía subcutánea), y administración de buprenorfina como analgesia postoperatoria (0,05 mg / kg) por vía subcutánea cada 12 horas durante 2 días. </li><li> Mantener al animal en una almohadilla térmica (34 ° -35 ° C) hasta que se recupere. </li></ol> 5. Imagen repetida <ol><li> Anestesiar al animal y eliminar los clips de heridas y suturas. </li><li> Quitar artificial dura y delgada membrana sintética parches de la matriz y mantenerlos en un tubo estéril con solución de Ringer para su posterior reutilización. </li><li> Quite con cuidado cualquier cicatriz de tejido conectivo acumulada con la punta doblada de una aguja, Sub-Q y unas pinzas finas. Perfundir frecuentemente con solución de Ringer cálida. </li><li> Volver a exponer el campo quirúrgico, incluyendo el sitio aplastar y DREZ, reubicar YFP + axones imágenes en las sesiones anteriores, y repetir los procedimientos descritos en la sección 4. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Hemos observado que, mientras no regenerarse después de una lesión en la sección transversal, casi todos los axones + YFP creció a través del sitio delesiones por 3 días después de aplastar (Figura 1) 11. Por lo general, al día siguiente después de aplastar, se observó muerte de devolución de la degeneración de los axones muñón proximal y la fragmentación / degeneración de los axones mismo distal a la aglomeración, que confirmó que los axones dañados había sido adecuadamente (por ejemplo, la Figura 1, el día 3 y 5) . Varios criterios adicionales se aplican para distinguir sin ambigüedad la regeneración de los axones de los axones que se salvaron o se había recuperado de la lesión. Estas fueron las siguientes: (1) axones que se regeneran muestran una expansión de la porción no fluorescente de la YFP + axón en el lugar de aplastar a causa de la degeneración proximal y distal (en contraste con la reducción de la brecha sin etiqueta, debido a citoplasma fluorescentes rellenar el sitio de aplastamiento si los axones sobrevivieron a la lesión), (2) la regeneración de los axones son mucho más delgadas, con menor intensidad fluorescente, y más ondulado que los axones que sobrevivieron a la lesión, (3) la regeneración de axones son más delgados y más débilmente fluorescentes que los fragmentos fluorescentes degeneración de los axones a través del cual se extendieron, (4) a diferencia de los axones supervivientes o salvado, la regeneración de los axones parada en el DREZ, y (5) en contraste con los sobrevivientes o escatimado axones axones que se regeneran no muestran los nodos de Ranvier. La figura 1 muestra cuatro axones superficial + YFP inmediatamente después de aplastar (A1; flechas de colores). Tres días después de la aglomeración, los cuatro axones se extienden una neurita única que crece a través del sitio de aplastamiento (A2). Cinco días después de aplastar, neuritas se mantienen estables y no hay un crecimiento adicional de los axones estos u otros proximal (A3). La regeneración de axones que cruzó el sitio a través de aplastar alargado mucho más grueso y más brillante fragmentos fluorescentes de un axón degenerado (es decir, los tubos endoneurales), y llegar a la DREZ tan pronto como 4 días después de la aglomeración (alrededor de 3 mm / 2 días) 11. Imagen repetida de estos axones y sus puntas cada dos o tres días durante dos semanas más (Figura 2) reveló que no crecen hacia adelante o retroceder, pero se mantuvo inmóvil. El único cambio notable fue la hinchazón de las extremidades y los ejes de algunos axones. Estas observaciones demuestran por lo tanto, inmovilización sorprendentemente rápido y crónica de los axones que se regeneran en el DREZ. <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1: imagen repetida de la L5 DR YFP + axones en el lugar de aplastar a la raíz dorsal durante 5 días. La porción medial de la raíz L5 fue aplastada (rojo punta de flecha) y la imagen en los días 0, 3 y 5 después de la aglomeración. El área de la aglomeración se magnifica en los paneles de la derecha (A1-A3). <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2:. Imagen repetida de los axones llegó a la DREZ más de 20 días después de aplastar a la raíz L5 Día 4, tres axones (flechas de colores) llegó a la DREZ. Las puntas de estos axones permanecen en el mismo lugar y tienen un aspecto similar en las sesiones posteriores de imágenes de los días 7, 9, 13, 15 y 20. Posiciones de un extremo del axón en relación con otros consejos de los axones y las señales (asteriscos) se utilizaron para determinar la motilidad axón entre las sesiones de formación de imágenes.

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	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+the+neuromuscular+junction.">Watching the neuromuscular junction.</a> J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).</li><li>Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+branch+removal+at+developing+synapses+by+axosome+shedding.">Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding.</a> Neuron. 44, 651-661 (2004).</li><li>Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+visualization+of+the+growth+of+pre-+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+in+the+mouse.">in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse.</a> J Neurosci. 10, 894-908 (1990).</li><li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Maio, D. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration:+Rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS/PNS+border.">in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

DR regeneración de imagen directamente en ratones vivos es particularmente difícil porque requiere una laminectomía dorsal sustancial para controlar el crecimiento del axón en una amplia zona seguido por múltiples procedimientos invasivos quirúrgicos y anestésicos en las sesiones de formación de imágenes posteriores. Las estrategias que han contribuido a superar estos retos. Imágenes en primer lugar, el éxito requiere la reducción de la mortalidad del ratón (aproximadamente el 25%), reduciendo al mínimo la...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> H línea thy1-YFP (2-4 meses de edad, ambos sexos) </td><td> Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) </td><td> 003782 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina (inyección AnaSed, solución estéril) </td><td> Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) </td><td> 4811 </td><td> 8 mg / kg </td></tr><tr><td> La ketamina (inyección de clorhidrato de ketamina, USP) </td><td> Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) </td><td> 2051 </td><td> 120 mg / kg </td></tr><tr><td> La buprenorfina (inyectable Buprenex) (0,05 mg / kg) </td><td> Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. (Richmond, VA) </td><td> 7571 </td><td></td></tr><tr><td> Pequeñas máquinas de cortar el pelo de animales </td><td> Oster Profesional, (McMinnville, TN) </td><td> 76059-030 </td><td></td></tr><tr><td> Loción capilar eliminación </td><td> Church &amp; Dwight Co. (Princeton, NJ) </td><td> NAIR con aceite para bebé </td><td></td></tr><tr><td> Gasas </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 22-362-173 </td><td></td></tr><tr><td> Con puntas de algodón </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 14 a 960-3T </td><td></td></tr><tr><td> Jeringas de 1 ml </td><td> Becton, Dickinson y Compañía Franklin Lakes, NJ) </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Subcutánea (Sub-Q) agujas, 26ga. </td><td> Becton, Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ) </td><td> 305115 </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras y pinzas de primavera </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia, (Foster City, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mm gubia curva </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia, (Foster City, CA) </td><td> 16221-14 </td><td></td></tr><tr><td> Lactato de Ringer USP Inyección </td><td> B. Braun Medical Inc. (Irvine, CA) </td><td> BBR-L7502 </td><td></td></tr><tr><td> Solución salina estéril </td><td> APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) </td><td> 918610 </td><td></td></tr><tr><td> Membrana delgada matriz sintética (Biobrane) </td><td> Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, Virginia Occidental) </td><td> 62794-096-251 </td><td></td></tr><tr><td> Artificial dura </td><td> Gore Impedir MVP sustituto Dura, WL Gore &amp; Associates, (Flagstaff, AZ) </td><td> 1MVP40 </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 suturas de seda </td><td> Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) </td><td> K-580 </td><td></td></tr><tr><td> Clips de la herida </td><td> Perfecto - Ets Bruneau, (Burnea, Francia) </td><td> A75 </td><td></td></tr><tr><td> Estereoscópico fluorescente </td><td> Leica Microsystems, (Wetzlar, Alemania) </td><td> MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> CCD de la cámara </td><td> Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) </td><td> ORCA-Rx2 </td><td></td></tr><tr><td> Controlador de temperatura </td><td> World Precision Instruments (Sarasota, FL) </td><td> ATC 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph software </td><td> Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Photoshop </td><td> Adobe Systems, San Jose, CA </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of dorsal root axons after rhizotomy

Los axones sensoriales primarias heridos por lesiones raíz espinal no se regeneran en la médula espinal, causando dolor crónico y pérdida sensorial permanente. La regeneración de la raíz dorsal (DR) los axones en la médula espinal se previene en la zona de la raíz dorsal de entrada (DREZ), la interfaz entre el SNC y SNP. Nuestra comprensión de los eventos moleculares y celulares que impiden la regeneración en DREZ es incompleta, en parte debido a los cambios complejos asociados con la lesión del nervio se han deducido del análisis post-mortem. Dinámica de procesos celulares, tales como la regeneración axonal, se estudia mejor con las técnicas que la captura de eventos en tiempo real con múltiples observaciones de cada animal vivo. Nuestra capacidad para controlar las neuronas en serie en vivo ha aumentado dramáticamente debido a las innovaciones revolucionarias en la óptica y los transgénicos de ratón. Varias líneas de thy1-GFP ratones transgénicos, en el que los subgrupos de neuronas son genéticamente etiquetados en distintos colores fluorescentes, permiten las neuronas individuales para ser captado en vivo 1. Estos ratones se han utilizado ampliamente para imágenes in vivo de los músculos y el cerebro 2-4 5-7, y han proporcionado nuevos conocimientos sobre los mecanismos fisiológicos que los análisis estáticos no se podría haber resuelto. Los estudios de imágenes de las neuronas en la médula espinal que viven sólo recientemente han comenzado. Lichtman y sus colegas han demostrado su viabilidad mediante el seguimiento de heridos columna dorsal (DC), los axones con un amplio campo de la microscopía 8,9. Multi-fotón de imágenes in vivo de la profunda posición axones DC, microglia y los vasos sanguíneos también se ha logrado 10. En los últimos años, hemos sido pioneros en la aplicación de imágenes in vivo para controlar la regeneración de los axones DR con amplio campo de la microscopía y la línea H de thy1-YFP ratones. Estos estudios nos han llevado a una nueva hipótesis acerca de por qué los axones DR se les impide la regeneración de la médula espinal 11. En la línea H de thy1-YFP ratones, distintas YFP + axones son superficialmente posición, que permite a varios axones a ser monitoreados simultáneamente. Hemos aprendido que los axones DR llegar a DREZ son mejores imágenes en el lumbar que en la médula espinal cervical. En el presente informe se describen varias estrategias que nos han sido útiles para asegurar imágenes de éxito a largo plazo y de la regeneración de los axones repetidas DR. Estos incluyen métodos que eliminan la intubación y la interrupción de las vías respiratorias repetidas, minimizar la cirugía asociada con el estrés y la formación de cicatrices, y obtener imágenes estables en alta resolución sin fototoxicidad.

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Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de protocolo para monitor principal axones sensoriales después de aplastar a la raíz dorsal se describe. Utilizar los procedimientos de campo amplio microscopía de fluorescencia y thy1-YFP ratones transgénicos, y permitir imágenes repetidas de la regeneración de axones más de 4 cm en el SNP y la interacción axón con la interfaz del sistema nervioso central.

Imágenes en vivo de los axones de la raíz dorsal después de rizotomía

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

live-imaging-of-dorsal-root-axons-after-rhizotomy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K vistas.  Shriners Hospitals Pediatric Research Center and Department of Anatomy and Cell Biology. Un In vivo Imágenes de protocolo para monitor principal axones sensoriales después de aplastar a la raíz dorsal se describe. Utilizar los procedimientos de campo amplio microscopía de fluorescencia y thy1-YFP ratones transgénicos, y permitir imágenes repetidas de la regeneración de axones más de 4 cm en el SNP y la interacción axón con la interfaz del sistema nervioso central.

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Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Investigación

Neurociencias

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Imágenes en vivo de nicotina señalización de calcio inducido y neurotransmisor lanzamiento Junto ventrales hipocampo axones

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

En Vitro Modelado de canceroso Neural Invasion: Modelo del ganglio de la raíz dorsal

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Inyección de raíz dorsal ganglio de raíz dorsal y Lesión por aplastamiento como modelo para la regeneración del axón sensorial

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomía para acceso de ganglio de raíz Dorsal Lumbar y de la inyección en los cerdos

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Aislamiento de los ganglios de raíz dorsal y en cultivo primario para el estudio de liberación de neurotransmisor

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.

Microscopía espectral reflectométrico en axones mielinizados en Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Aislamiento rápido de macrófagos de ganando de raíz dorsal

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, neurons and Schwann cells engage in a complex interaction to control the myelination of axons. Disturbances of this interaction and breakdown of the myelin sheath are hallmarks of inflammatory neuropathies and occur secondarily in neurodegenerative disorders. Here, we present a coculture model of dorsal root ganglion explants and Schwann cells, which develops a robust myelination of peripheral axons to investigate the process of myelination in the peripheral nervous system, study axon-Schwann cell interactions, and evaluate the potential effects of therapeutic agents on each cell type separately. Methodologically, dorsal root ganglions of embryonic rats (E13.5) were harvested, dissociated from their surrounding tissue, and cultured as whole explants for 3 days. Schwann cells were isolated from 3-week-old adult rats, and sciatic nerves were enzymatically digested. The resulting Schwann cells were purified by magnetic-activated cell sorting and cultured under neuregulin and forskolin-enriched conditions. After 3 days of dorsal root ganglion explant culture, 30,000 Schwann cells were added to one dorsal root ganglion explant in a medium containing ascorbic acid. The first signs of myelination were detected on day 10 of coculture, through scattered signals for myelin basic protein in immunocytochemical staining. From day 14 onward, myelin sheaths were formed and propagated along the axons. Myelination can be quantified by myelin basic protein staining as a ratio of the myelination area and axon area, to account for the differences in axonal density. This model provides experimental opportunities to study various aspects of peripheral myelination in vitro, which is crucial for understanding the pathology of and possible treatment opportunities for demyelination and neurodegeneration in inflammatory and neurodegenerative diseases of the peripheral nervous system.

In the coculture system of dorsal root ganglia and Schwann cells, myelination of the peripheral nervous system can be studied. This model provides experimental opportunities to observe and quantify peripheral myelination and to study the effects of compounds of interest on the myelin sheath.

Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...