La evidencia emergente ha implicado la contribución de los macrófagos ganglionares de raíz dorsal al desarrollo del dolor neuropático y la reparación axonal en el contexto de la lesión nerviosa. Se desea fenotipar rápidamente la respuesta de los macrófagos ganglionares de raíz dorsal para identificar los factores neuroinmunes desconocidos. Aquí demostramos cómo nuestro laboratorio aísla rápida y eficazmente los macrófagos de los ganglios de la raíz dorsal utilizando un protocolo de disociación mecánica libre de enzimas.
Este protocolo consume mucho menos tiempo en comparación con los protocolos enzimáticos estándar, y lo hemos utilizado rutinariamente para nuestro análisis de clasificación de células activado por fluorescencia. Antes de iniciar el experimento, prepare la solución de trabajo del medio de gradiente de densidad mezclando nueve volúmenes del medio con un volumen de calcio y sin magnesio 10X HBSS y manténgalo en hielo. Confirme que el ratón está completamente anestesiado por la falta de respuesta al pellizco de la pata trasera.
Comience colocando un ratón anestesiado dentro de una campana química en la posición supina con cuatro patas aseguradas con cinta adhesiva. Use fórceps para levantar la piel por debajo de la caja torácica. Y luego con tijeras quirúrgicas, hacer una pequeña incisión para exponer el hígado y el diafragma.
Usando las mismas tijeras, corte el diafragma y la caja torácica. Y luego abre la cavidad pleural para exponer el corazón latiendo. A continuación, con tijeras de iris, corte rápidamente el apéndice auricular derecho.
Una vez observado el sangrado, inserte una aguja del calibre 30 en el extremo posterior del ventrículo izquierdo e inyecte lentamente 10 mililitros de 1X PBS pre-refrigerado para perfunde al animal. Para realizar laminectomía dorsal, coloque el ratón en la posición propensa. Utilice un bisturí de tamaño 11 para realizar dos incisiones longitudinales de profundidad laterales desde la región torácica hasta la región sacra.
Luego retire la piel exponiendo la capa muscular dorsal. Luego, con Friedman-Pearson rongeur, despegue los tejidos y músculos conectivos hasta que se expongan los procesos de la columna lumbosacral y los procesos transversales bilaterales. Primero, usa un rongeur Friedman-Pearson para abrir cuidadosamente la columna vertebral dorsal, luego cambia entre un rongeur de Friedman-Pearson y tijeras de resorte Noyes para eliminar los huesos vertebrales, exponiendo la médula espinal con los nervios espinales intactos unidos.
Diseccionar cuidadosamente el DRG lumbar ipsilateral y contralateral. Colóquelo en un mililitro de calcio helado y HBSS 1X sin magnesio en un homogeneizador de tejido Dounce. Homogeneizar el tejido DRG en el homogeneizador Dounce con un pestle suelto durante 20 a 25 veces.
Coloque un colador de células de nylon estéril de 70 micrómetros en un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Utilice 800 microlitros de código de hielo 1X HBSS para mojar el colador celular. Utilice una pipeta para recoger la suspensión de tejido homogeneizado del homogeneizador en el colador de células húmedas, y recórtela en el tubo cónico de 50 mililitros.
Enjuague el homogeneizador dos veces con 800 microlitros de hielo frío 1X HBSS, recogiendo el líquido en el mismo tubo cónico de 50 mililitros para aumentar el rendimiento. Agregue 1,5 mililitros de medio de gradiente de densidad isotónica con hielo equilibrado en un tubo de matraz de poliestireno estéril de cinco mililitros. Transfiera el homogenenato celular del tubo cónico de 50 mililitros a este tubo de matraz.
Y pipetear arriba y abajo para mezclar bien. Agregue 500 microlitros adicionales de 1X HBSS para sellar la parte superior. Centrifugar las células a 800 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.
Aspirar cuidadosamente el sobrenadante que contiene mielina en el medio sin alterar el pellet celular en la parte inferior del tubo. Añadir 100 microlitros de PBS que contengan 5% de suero bovino fetal al pellet, y volver a suspender las células DRG. Luego agregue el anticuerpo alfa ratón CX3CR1 APC a las células e incubar en la oscuridad a cuatro grados Celsius durante una hora.
Lavar las células una vez con cinco mililitros de PBS. Centrifugar las células a 360 veces G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar el sobrenadante, y luego volver a suspender el pellet celular en 300 microlitros de PBS para el análisis de hechos.
Después de las inyecciones intraperitoneales de dimerizador de proteína de unión a FK AP en ratones MaFIA para agotar los macrófagos, hubo una pérdida significativa de células positivas de GFP en las DRG de los ratones tratados con AP en comparación con ratones tratados con vehículos controlados. El análisis de hechos reveló un agotamiento exitoso de la alta población de GFP en ratones tratados con AP y demostró la alta calidad de las células aisladas. El 4% del total de células aisladas del DRG del animal tratado con vehículos eran macrófagos altos de la GFP.
Por el contrario, sólo el 0,4% del total de células DRG eran macrófagos altos de GFP en el ratón tratado con AP. Las células DRG aisladas mecánicamente de ratones de tipo salvaje se tiñeron con anticuerpos CX3CR1-APC de ratón alfa. El 6% de las células DRG fueron macrófagos positivos CX3CR1.
Cuando se evaluó la viabilidad celular con yoduro propidium, reveló que más del 80% de las células DRG recién aisladas eran viables. Si se observa el rendimiento celular insatisfactorio, se puede sospechar una homogeneización insuficiente o excesiva del tejido DRG. Además, la disección de DRG puede requerir prácticas repetidas para principiantes.
Es probable que la aplicación de nuestro protocolo se pueda ampliar para estudiar otras células no neuronales como células satélite y células T. Pueden ser necesarios más estudios para confirmar la eficacia del aislamiento celular.
