Este trabajo fue financiado por el apoyo a través de la Fundación McNair, NARSAD y NINDS conceder R00NS064171-03.

1. En la fijación del cerebro in situ * Prepare una jeringa de 10 ml (28 aguja de calibre) lleno de solución salina de fosfato (PBS). * Prepare una jeringa de 10 ml (28 aguja) llena con 4% paraformaldehído (PFA) en PBS. Reserva un 50-10 ml adicionales de PFA / PBS para la fijación del mensaje. <ol><li> Se inyecta por vía intraperitoneal ratón experimental con una dosis letal de Nembutal o Avertin. </li><li> Una vez que el ratón está sedado, mojado el abdomen con etanol y seguro con el ratón al fondo de una bandeja con capas de corcho, la cera, o de elastómero de silicona con alfileres de disección. Con el abdomen hacia arriba, seguro las cuatro patas a la superficie - la difusión de ellas lo más amplia posible. </li><li> Agarrar la piel con una pinza a nivel del esternón, y cortadas transversalmente para exponer el hígado. Cortar lateralmente y luego hacia arriba a través de las costillas y el diafragma. Quitar el colgajo de tejido costilla y continuar cortando hasta que el corazón es accesible. </li><li> Perforar ni cortar la aurícula derecha para drenar la sangre circulando. </li><li> Lavar la sangre residual del sistema circulatorio de una perfusión de PBS a través del ventrículo izquierdo. </li><li> Acceso al agujero de la aguja misma, fijar ratón todo por perfusión posterior de PBS / PFA a través del ventrículo izquierdo. </li></ol> 2. La disección y extracción del cerebro <ol><li> Retire la piel de la cabeza, el cuello y cráneo cortando alrededor del canal auditivo y las órbitas oculares, seguido tirando de la piel para exponer la parte anterior del cráneo. * Ver Figura 2 para una ilustración de los pasos 2,2) a 2,5) </li><li> Utilizando unas tijeras hueso, corte transversal del ojo de la toma de corriente a través de los huesos de los cornetes nasales. Haga esto para cada lado. El corte transversal debe ser anterior a los ojos y los bulbos olfatorios. </li><li> Cortado a lo largo de cada canal auditivo para cuenca del ojo. </li><li> Usando una tijera pequeña disección, corte al hueso occipital cubre el cerebelo en el canal auditivo de una a la otra. </li><li> Con la misma tijera de disección, corte anterior a lo largo de la línea media con el nivel de los bulbos olfatorios. </li><li> Con unas pinzas, retire cada placa ósea del cerebro, teniendo cuidado de eliminar cualquier tejido conectivo para que el cerebro permanece intacto cuando el levantamiento del hueso. </li><li> Cortar los nervios ópticos y craneal, cortar la parte superior vértebras cervicales, y eliminar el cerebro en fijador. </li><li> Después de fijar durante 1-2 horas a 4 ° C. Lavar 3 veces 15 minutos cada uno en PBS. </li></ol> 3. Agarosa incrustación <ol><li> Derrita 2% de alta resistencia, baja gel de agarosa al punto de tipo IB (número de catálogo de Sigma: A0576) en PBS solución salina con horno de microondas. </li><li> Transferencia de agarosa fundida a un tubo de ensayo. Coloque el tubo de ensayo en un baño caliente o incubadora de agua (40 ° -41 ° C) hasta el equilibrio de temperatura. </li><li> Pegue el tejido cerebral fija en el émbolo de la jeringa con la muestra de pegamento de cianoacrilato (Figura 3). Brocha una fina capa de grasa saturada de sacarosa PBS solución en la superficie del tejido cerebral para facilitar la posterior liberación del anillo de agarosa de los cortes de cerebro. </li><li> Sacar el émbolo con el tejido cerebral en la caja del émbolo (Figura 3B). </li><li> Pipeta o verter caliente de agarosa en el alojamiento del émbolo, que cubre el tejido cerebral. Evitar que queden atrapadas burbujas de aire en la agarosa. Burbujas de aire en la agarosa se compromete la calidad de división. </li><li> Sujete la jeringa con una muestra de frío (0 ° a -25 ° C) Bloque de refrigeración durante 1 minuto para ajustar la agarosa (Figura 3C). </li></ol> 4. Seccionar parte del cerebro con la Compresstome <ol><li> Montar la muestra con una jeringa en el tejido cerebral en el Compresstome (Figura 3D). </li><li> Alinear el borde de la hoja de afeitar en estrecha colaboración con la salida de la jeringa de la muestra (Figura 3E). </li><li> Llene el tanque de reserva con una solución de PBS. </li><li> Gire el micrómetro de un grosor de corte hacia adelante para la extrusión del bloque de tejido de agarosa-cerebro de la jeringa de la muestra. </li><li> Pulse el botón &quot;Inicio&quot; en la unidad de control de la Compresstome para iniciar el proceso de corte. </li><li> Repita los pasos 4,4) a 4,5) hasta que las rebanadas deseadas se obtienen al determinar el espesor. </li><li> Rodajas de cerebro de la cosecha con un cepillo o una pipeta a viales o pozos tinción llena de PBS (Figura 3F). </li></ol> 5. Compensación óptica <ol><li> Prepare un 75% vol: vol solución de glicerol: PBS. </li><li> Vierta (o pipeta) de la mitad del volumen de lavado PBS a partir de las rodajas de cerebro de recogida. </li><li> Añadir de nuevo el volumen extraído con glicerol / PBS. </li><li> Hasta que se estabilice con una mezcla suave a 4 ° C hasta que el disipador rodajas. </li><li> Repita los pasos 6,2) a 6,4) hasta una concentración final de glicerol alcanza el 75%. </li><li> Reemplace la solución con un 90% de glicerol en PBS y hasta que se estabilice. * Nota: Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire, mientras que la adición de soluciones de glicerol. Vierta las soluciones poco a poco y mezclar suavemente, ya que las burbujas de aire va a interferir con uniforme Equilibración y se llevará a la diapositiva de montaje. </li></ol> 6. Rebanada de montaje de imágenes <ol><li> Corte adhesivo de doble cara del sello (SA-S-1L, Grace Bio-Labs) en un rectángulo abierto para adaptarse a la zona más visible de una diapositiva micro (Superfrost Plus, 25 X 75 X 1 mm, cat. # 48311-703, VWR ) con los lados 2-3 mm de ancho. </li><li> Coloque rebanadas de cerebro dentro del centro del rectángulo de cinta adhesiva con una pipeta o un pincel. Retire el exceso de glicerol con aspiración suave. </li><li> Las rodajas de cerebro de la diapositiva en el orden deseado con un pincel. </li><li> Vidrio con cuidado la tapa inferior (24 X 60 mm, cat. # 48383-139, VWR) en la cinta adhesiva, con cuidado de no introducir burbujas de aire. Para aplicar una suave presión sobre cubierta de vidrio para asegurar el contacto con cinta adhesiva. </li><li> Aspirar glicerol exceso de los bordes entre las diapositivas y cubre objetos. </li><li> Sello portaobjetos y un cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. </li><li> Deje que se seque antes de exponer, o almacenar a largo plazo en las cajas de diapositivas a 4 ° C. </li></ol> 7. Los resultados representativos: Procesamiento, imágenes y análisis de los tejidos del cerebro marcados con fluorescencia se han convertido en indispensables para el estudio de la neurobiología. Muchas de estas investigaciones requieren sofisticadas manipulaciones genéticas para obtener reportero de la expresión en blanco subconjuntos neuronales, seguido de los dos análisis de imagen de alta y baja resolución. A menudo, las limitaciones experimentales y técnicas que hacen imposible la obtención de estos tipos de datos del mismo animal, o de una manera rápida. Preparación de la óptica con despacho, las secciones del cerebro semi-gruesa para fluorescentes ayudas imágenes en este desafío. Un ejemplo de una rodaja de cerebro intacto gruesa marcada con un virus genéticamente modificado para expresar la rabia EGFP, y utilizando imágenes de microscopía confocal de epifluorescencia y se muestra en la Figura 4 y Figura 5, respectivamente. Para obtener imágenes de epifluorescencia se utilizó un Leica M205 FA y para la adquisición de la imagen confocal se utilizó un Zeiss LSM 510. Debido a la relativa simplicidad del protocolo que se adjunta, este método es capaz de producir información útil imagen de los tejidos que expresan los reporteros fluorescentes con un tiempo de respuesta de menos de un día, y es compatible tanto con microscopía de luz de alta y baja resolución. Si el investigador decide incorporar otros métodos de etiquetado post mortem, la tinción inmunohistoquímica, o hacer que las secciones más finas, el protocolo se alarga en consecuencia. Sin embargo, el método descrito anteriormente representa un método sencillo y relativamente de alto rendimiento para los patrones de detección del reportero de la expresión vital en el cerebro intacto. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Diagrama de flujo de diagramación de la fijación, la disección, corte, limpieza, y el procedimiento de montaje de las secciones de cerebro semi-espesa. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Esquema de los pasos secuenciales de corte para extraer el cerebro del ratón intacto. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Pasos para montar y cortar el tejido cerebral con el Compresstome. A) La colocación de tejido cerebral en el corte de émbolo con superglue. B) la elaboración por el tejido cerebral montado en el émbolo para la incorporación de agarosa. C) La solidificación un plug cerebro de agarosa utilizando un bloque de compresión refrigerados. D) La inserción de plug cerebro de agarosa y el émbolo en la cámara de corte Compresstome. E) La alineación de la hoja de afeitar en el dispositivo de émbolo. F) de corte y la recolección de las secciones de cerebro en la cámara de amortiguación Compresstome. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Imágenes de microscopía de luz de un buen pedazo de glicerol con despacho de tejido cerebral a través de la corteza frontal que expresa aumento de proteína verde fluorescente (EGFP). Una rebanada) coronal a través de un cerebro de ratón (200 um de espesor) una etiqueta con un vector viral que expresan EGFP y con imágenes a baja resolución utilizando un estereoscopio de epifluorescencia. Barra de escala, de 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Ampliación de imagen en alta capa de la etiqueta fluorescente 6.5 neuronas corticales en un trozo del cerebro despejado de espesor. Una imagen) de alta resolución confocal de una proyección máxima Z-stack (150 um de espesor) a través de la región seleccionada en la (Figura 4). Barra de escala, de 25 um.

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	<li>Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Connectome Project. , (2009).</li><li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques.">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy.">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244, 1288-1292 (1989).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification,+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+Aequorea.">Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Gene fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-224 (2006).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

Jian-Qiang Kong es un empleado de Precisionary Instruments, Inc., que fabrica un producto utilizado en este artículo.

Teniendo en cuenta la aplicación generalizada del uso de proteínas fluorescentes para apuntar subconjuntos neuronales para la investigación a través de microscopía de luz, la necesidad de rapidez de pantalla, la imagen, y analizar las redes neuronales en el tejido cerebral intacto se ha convertido en un valor incalculable. Los avances técnicos en el desarrollo de funciones fáciles de vectores virales, en las técnicas de electroporación in vivo, y modificad...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<th&gt; Nombre del elemento</th&gt;<th&gt; Empresa</th&gt;<th&gt; Número de catálogo</th&gt;<th&gt; Comentarios (opcional)</th&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hueso tijeras</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 16044-10</td&gt;<td&gt;-O su equivalente</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tijeras de disección</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 14084-08</td&gt;<td&gt;-O su equivalente</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tipo IB agarosa</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A0576</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Compresstome</td&gt;<td&gt; Instrumentos Precisionary</td&gt;<td&gt; VF-200</td&gt;<td&gt;-Otros vibratomes son compatibles</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adhesiva de doble cara</td&gt;<td&gt; Grace Bio-Labs</td&gt;<td&gt; SA-S-1L</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Superfrost Plus diapositivas</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48311-703</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cubierta de vidrio</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48383-139</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glicerol</td&gt;<td&gt; EMD Chemicals Inc.</td&gt;<td&gt; GX0185-6</td&gt;<td&gt;-O su equivalente</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;

a rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices

Un objetivo fundamental tanto para la neurociencia básica y clínica es comprender mejor la identidad, estructura molecular, y los patrones de conectividad que son característicos de las neuronas en el cerebro, tanto normales y enfermos. Con este, un gran esfuerzo se ha puesto en la construcción de mapas de alta resolución neuroanatómicas 1-3. Con la expansión de la genética molecular y los avances en microscopía de luz ha llegado la posibilidad de consultar no sólo morfologías neuronal, sino también la composición molecular y celular de las neuronas individuales y sus redes asociadas 4. Los principales avances en la capacidad de marcar y manipular las neuronas a través de tecnologías para los transgénicos y de genes en los roedores, ahora permiten a los investigadores a subconjuntos neuronales &quot;programa&quot; a voluntad 5-6. Sin duda, una de las contribuciones más influyentes de la neurociencia contemporánea ha sido el descubrimiento y la clonación de genes que codifican las proteínas fluorescentes (PM) en los invertebrados marinos 8.7, junto con sus posteriores de ingeniería para producir una caja de herramientas cada vez mayor de periodistas vitales 9. La explotación de la célula de tipo específico para impulsar la actividad del promotor dirigido expresión FP en poblaciones neuronales discretos permite ahora la investigación neuroanatómica con precisión genética. Ingeniería de expresión en las neuronas de FP ha mejorado enormemente nuestra comprensión de la estructura y función del cerebro. Sin embargo, las neuronas individuales de imágenes y sus redes asociadas en los tejidos cerebrales profundos, o en tres dimensiones, sigue siendo un desafío. Debido al alto contenido de lípidos, tejido nervioso, es más bien opaco y de fluorescencia muestra de automóviles. Estas propiedades biofísicas inherentes hacen que sea difícil de visualizar la imagen y las neuronas marcados con fluorescencia de alta resolución mediante microscopía confocal estándar epifluorescencia o más allá de las profundidades de decenas de micras. Para evitar este problema los investigadores suelen emplear serie de secciones delgadas de imágenes y 10 métodos de reconstrucción, o de 2 fotones microscopía de escaneo láser 11. Inconvenientes actuales de estos enfoques son los asociados de trabajo intensivo de preparación de tejidos, o la instrumentación un costo prohibitivo, respectivamente. A continuación, presentamos un método relativamente rápido y sencillo para visualizar las células marcados con fluorescencia en semi fijos de grosor del cerebro del ratón en la limpieza de óptica y de imagen. En el protocolo que se adjunta se describen los métodos de: 1) la fijación de tejido cerebral in situ a través de la perfusión intracardíaca, 2) la disección y remoción de todo el cerebro, 3) incorporación del cerebro estacionario en agarosa, 4) la precisión semi-gruesa rebanada preparación utilizando nuevos instrumentos vibratome de compensación, 5) el tejido cerebral a través de un gradiente de glicerol, y 6) de montaje en portaobjetos de vidrio para microscopía de luz y z-stack de reconstrucción (Figura 1). Para la preparación de cortes de cerebro se implementó una pieza relativamente nuevo de la instrumentación de la llamada &#39;Compresstome &quot;VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Este instrumento es un microtomo semi-automático equipado con un avance de motor y sistema de vibración hoja de características similares en función a vibratomes otros. A diferencia de otros vibratomes, el tejido a cortar está montado en un enchufe de agarosa dentro de un cilindro de acero inoxidable. El tejido se extruye a espesores que desee en el cilindro, y se corta con la hoja hacia adelante el avance de vibración. El tapón de agarosa / sistema de cilindro permite reproducir el tejido de montaje, alineación y corte de precisión. En nuestras manos, el &#39;Compresstome &quot;altos rendimientos cortes de tejidos de calidad para electrofisiología, inmunohistoquímica y directa tejido fijado de montaje y de imagen. Combinado con la limpieza de óptica, aquí se demuestra la preparación de los semi-rodajas de cerebro fija de alta resolución de imagen fluorescente.

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A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Aquí se describe un método rápido y sencillo a las células de la imagen marcados con fluorescencia en rodajas de cerebro semi-espesa. Mediante la fijación, corte, limpieza y ópticamente el tejido cerebral se describe la forma de imagen estándar de epifluorescencia y confocal se puede utilizar para visualizar las células individuales y las redes neuronales en el tejido nervioso intacto.

Un enfoque rápido para imágenes de fluorescencia de alta resolución en rodajas de cerebro semi-gruesa

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K vistas.  Baylor College of Medicine (BCM). Aquí se describe un método rápido y sencillo a las células de la imagen marcados con fluorescencia en rodajas de cerebro semi-espesa. Mediante la fijación, corte, limpieza y ópticamente el tejido cerebral se describe la forma de imagen estándar de epifluorescencia y confocal se puede utilizar para visualizar las células individuales y las redes neuronales en el tejido nervioso intacto.

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An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Investigación

Neurociencias

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

De alta resolución Magnética Funcional por imágenes de los métodos de resonancia cerebro medio humano

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Alta resolución<em&gt; En Vivo</em&gt; Protocolo Segmentación Manual for Human hipocampo subcampos Usando 3T Imágenes por Resonancia Magnética

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

De alta resolución de imagen de resonancia magnética estructural del subcorteza Humano<I&gt; En Vivo</I&gt; Y Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Alta resolución imagen Confocal de la barrera hemato - encefálica: proyección de imagen, reconstrucción 3D y cuantificación de transcitosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique cells regarding their extended ramified morphologies and consequently raise several methodological challenges for volume measurement. In the particular case of in vitro neuronal growth, the chosen methodology should include sub-micrometric axial resolution combined with full-field observation on time scales from minutes to hours or days. Unlike other methods like cell shape reconstruction using confocal imaging, electrically-based measurements or Atomic Force Microscopy, the recently developed Fluorescence eXclusion method (FXm) has the potential to fulfill these challenges. However, although being simple in its principle, implementation of a high-resolution FXm for neurons requires multiple adjustments and a dedicated methodology. We present here a method based on the combination of fluorescence exclusion, low-roughness multi-compartments microfluidic devices, and finally micropatterning to achieve in vitro measurements of local neuronal volume. The high resolution provided by the device allowed us to measure the local volume of neuronal processes (neurites) and the volume of some specific structures involved in neuronal growth, such as growth cones (GCs).

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of cells. We describe a fluorescent exclusion method allowing full-field measurement of in vitro neuronal volume with sub-micrometric axial resolution required for the analysis of neurites and dynamic structures implied in neuronal growth.

Alta resolución volumen imágenes de neuronas por la exclusión de uso de fluorescencia método y dispositivos microfluídicos dedicada

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Un enfoque alternativo para estudiar acontecimientos primarios en neurodegeneración con rodajas de cerebro de rata Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en el tejido cerebral con disolventes

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...