El marcado de células madre y su progenie con una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación de células madre adultas en el cerebro in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la potencia múltiple. Las ventajas de los enfoques de rastreo de linaje transgénico incluyen la especificidad de rastrear un linaje celular en particular, la expresión indeleble de la proteína fluorescente independientemente de la renovación o diferenciación celular, la baja toxicidad de la doxiciclina, la activación condicional y la facilidad de uso con ensayos comunes aguas abajo en tejidos traza del linaje, incluida la inmunotinción y la inmunofluorescencia.
Debido a la amplia implicación de la plasticidad y la célula en el cerebro adulto, la caracterización y el análisis de las células madre adultas ayudarán a informar sobre el estudio de las enfermedades neurodegenerativas, los impactos metabólicos en la plasticidad cerebral, el envejecimiento y otras afecciones relacionadas. Para comenzar, calienta los portaobjetos a temperatura ambiente y pos-fija con acetona helada durante 15 minutos. Lave los portaobjetos durante cinco minutos en un tampón de enjuague 1X, agitando a 60 rotaciones por minuto a temperatura ambiente entre cada paso.
Permeabilizar para la posición de antígenos nucleares con 0.3%Triton X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Permeabilizar para la posición de antígenos citoplasmáticos con 0.3%Tween-20 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Realice la recuperación de antígenos mediante portaobjetos de microondas en 50 a 100 mililitros de 1 x DAKO Antigen Retrieval Solution en baja durante 10 minutos, dos veces.
A continuación, enjuague con tampón durante cinco minutos a temperatura ambiente. incubar portaobjetos en 0.3% Typogen Black en 70% etanol durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego lavar con tampón de enjuague. Dibuje una barrera hidrofóbica alrededor del tejido.
Bloquee durante 20 minutos a 37 grados centígrados con reactivo de bloqueo. E incubar con anticuerpo primario diluido en diluyente de anticuerpos durante la noche a cuatro grados centígrados. Lave los portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Al día siguiente, incuba secciones en anticuerpos secundarios de Alexa Fluor durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego lave las diapositivas dos veces en el tampón de enjuague durante 10 minutos. Cubra las secciones cerebrales en 100 microlitros de uno a 500 anticuerpos anti-GFP conjugados con AlexaFluor 488, e incube durante la noche a cuatro grados Celsius para aumentar el Fluor4 endógeno, marcando las células trazadas.
Al día siguiente, lavar con tampón de enjuague dos veces. Y luego lavar en agua corriente di durante cinco minutos. Contramancha con 100 nanogramos por mililitro 4'6-diamidino-2-fenilindol durante cinco minutos.
Luego lavar en agua corriente di durante cinco minutos. Agregue una gota de medio de montaje seguro fluorescente en la parte superior de cada sección de tejido y selle con una cubierta de 22 milímetros por 22 milímetros. Se recomiendan imágenes el día del montaje para garantizar una señal óptima.
Para comenzar la fijación y la seccionamiento después de la perfusión transcárdica post-fijación de cerebros en 4% PFA durante la noche a cuatro grados centígrados. Y luego de nuevo durante una hora a temperatura ambiente. Lave los cerebros en 1x PBS durante una hora dos veces a temperatura ambiente.
Corte el cerebro en secciones de un milímetro de grosor usando el bloqueo cerebral sagital y colóquelo en tubos de micro centrífuga de cinco mililitros que contengan 1x PBS. Para el pretratamiento con metanol, comience lavando con 1x PBS durante una hora dos veces a temperatura ambiente. Lavar en etanol al 50% durante una hora a temperatura ambiente.
Lavar en etanol al 80% durante una hora a temperatura ambiente. Lavar en 100% metanol durante una hora, dos veces, a temperatura ambiente. Muestras de lejía con peróxido de hidrógeno al 5% en sulfuro de dimetilo al 20% y metanol a cuatro grados centígrados durante la noche.
Después del blanqueo, lave las muestras en metanol durante una hora dos veces a temperatura ambiente. Lavar en 20% dimetilsulfóxido y metanol durante una hora dos veces a temperatura ambiente. Lavar en etanol al 80% durante una hora a temperatura ambiente.
Lavar en etanol al 50% durante una hora a temperatura ambiente. Lavar en PBS durante una hora dos veces a temperatura ambiente. Lavar en PBS 0.2%Triton X-100 durante una hora dos veces a temperatura ambiente.
Para la inmunotinción de cerebros de limpieza, comience incubando muestras en 1x PBS, 0.2% Tritón X-100, 20% DMSO, 0.3 glicina molar, a 37 grados Celsius durante la noche en un agitador orbital. Bloquee en 1x PBS, 0.2% Triton X-100, 10% DMSO, 6% suero de cabra a 37 grados Celsius durante tres días en un agitador orbital. Lave las muestras en 1x PBS, 0.2% Tween-20, 10 microgramos por mililitros de sal de sodio de heparina de la mucosa porcina durante una hora dos veces a 37 grados centígrados.
A continuación, incube en 1x PBS, 0.2% Tween-20, 10 microgramos por mililitros de heparina, 5% DMSO, 3% de suero de cabra que contiene de una a 500 concentraciones de conejo anti GFP AlexaFluor 488 a 37 grados Celsius en un agitador orbital durante dos días. Lave las muestras en 1x PBS, 0.2% Tween-20 con 10 microgramos por mililitro de heparina durante una hora a 37 grados Celsius en un agitador orbital tres veces y luego una vez al día durante dos días. Incubar muestras durante la noche en un mililitro de tetrahidrofurano al 50% y agua.
Incubar muestras durante una hora en un mililitro de tetrahidrofurano 80%THF y agua. Incubar muestras dos veces durante una hora en 100%Tetrahidrofurano. Seque las muestras con una toallita estéril e incube en diclorometano hasta que se hundan en el fondo del vial.
No incubar por más de 60 minutos. Incubar muestras en un mililitro de éter dibencil hasta que estén claras. Almacene las muestras en éter de dibencil a temperatura ambiente hasta que estén listas para obtener imágenes.
Para obtener imágenes de secciones cerebrales inmunoteñidas, analice las diapositivas a través de microscopía confocal, donde se puede confirmar la coexpresión de múltiples anticuerpos. Utilizamos un microscopio leica Stellaris de cinco con detectores híbridos HyD S. Para obtener imágenes de cerebros despejados, use un microscopio confocal invertido con una etapa automatizada y una función de mosaico automatizada.
Comience colocando una sección cerebral despejada plana contra un plato con fondo de vidrio sumergido en éter dibencil. Se observó una diferencia notable en la intensidad fluorescente en diferentes regiones del cerebro y varios tipos de células después de un período de persecución de pulsos en los cerebros trazados por el linaje. Las células epiteliales coroideas en el plexo coroideo tenían una membrana celular gruesa y una fuerte señal fluorescente verde que indicaba que derivaban de células Tert positivas que eran fácilmente distinguibles de las células circundantes.
Los otros tipos de células más pequeñas en el estroma del plexo coroideo tenían una señal GFP más débil. En el cerebelo, las células gliales de Bergmann expresaron niveles más altos de GFP que las células de la canasta, y también existió variación en la expresión de GFP entre las células individuales de la canasta. Para los axones de las neuronas sensoriales de fábrica dentro de la capa glomerular del bulbo olfatorio también se expresan altos niveles de GFP Los axones de las neuronas sensoriales olfativas que llenan la capa glomerular del bulbo olfatorio expresaron altos niveles de tomate de membrana, o fluorescencia roja en comparación con la mayoría de las otras regiones del cerebro, incluso cuando las mismas neuronas son GFP positivas, lo que indica que algunas células parecían perder la señal de mTomato más lentamente durante el rastreo del linaje.
Por el contrario, en el plexo coroideo las células GFP positivas expresaron mTomato bajo. En la mayoría de las otras regiones del cerebro, las señales de tomate se expresan a bajo nivel en la mayoría de los tipos de células, siendo las células endoteliales algunas de las únicas células cuya señal fluorescente era lo suficientemente brillante como para destacarse claramente del fondo fluorescente rojo del tejido cerebral. Lo más importante a recordar es que la señal fluorescente en los cerebros despejados se desvanece más rápido que la mayoría de los otros ensayos inmunológicos.
Recuerde obtener imágenes de sus muestras lo antes posible y dentro de los siete días. A continuación, las imágenes de las rebanadas cerebrales o cerebros claros, la coloración de los marcadores con las señales GFP y nuestra cuantificación de la fluorencia se pueden llevar a cabo utilizando programas de software.
