Damos las gracias a la base de citometría de flujo la Universidad de Massachusetts: Richard Konz, Giehl Ted, Gosselin Barbara, Gu Yuehua y Krupoch Tammy. Este trabajo fue financiado por NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) y NIH CA T32-130 807 (JRS). Los recursos básicos con el apoyo de la Diabetes Endocrinología del Centro de Investigación de subvención DK32520 también fueron utilizados.

1. La recolección de los tejidos <ol><li> Prepare los tubos que contienen 2 a 5 ml de tampón de tinción de frío (tampón fosfato salino (PBS) con adición de 0,2% de BSA y glucosa 5 mM). Mantenga los tubos en hielo antes de la cosecha de tejidos. </li><li> Ratones sacrificio acuerdo con el protocolo adecuado aprobado (por ejemplo, CO 2 por inhalación seguido por dislocación cervical). </li><li> Extracción de sangre por punción cardiaca en tubos con EDTA o heparina de recogida de sangre para su posterior análisis, por ejemplo, de hematocrito, recuento de reticulocitos o análisis CBC. </li><li> Cosecha el bazo y los huesos, la colocación de los tejidos de cada ratón en un tubo separado, preparado en el paso 1. Fácil acceso a las bazo es desde el lado izquierdo. De la médula ósea, la cosecha de uno o ambos fémures. Mantener el tejido cosechado en el hielo. </li><li> Si lo desea, un peso del bazo. Los ratones sometidos a una respuesta de estrés eritropoyética es probable que muestran un aumento significativo en el peso del bazo. </li></ol> 2. Preparación de las células del bazo <ol><li> El uso de un pre-humedecidos 3 ml émbolo de la jeringa, empuje suavemente el bazo, o parte del bazo (lo ideal es 0,1 gramos o menos, lo que equivale a aproximadamente 10 8 células) a través de un filtro de 40 micras de células estériles (número de catálogo Fisherbrand 22363547 u otros) colocado en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. Mantenga el tubo en hielo durante este procedimiento. Lavar las células a través del filtro, con un total de 2 ml tinción de amortiguación. </li><li> Pipeta suavemente la suspensión celular se esforzó por romper cualquier pequeños grupos. Si es necesario, re-deformación de las células. </li><li> Lavar las células dos veces por centrifugación y vuelva a suspender en tampón frío. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro. Los rendimientos típicos son 1.2 x 10 8 células / bazo. Para el análisis de citometría de flujo, volumen asignado 1 a 2.000.000 células por muestra, ya sea en los tubos de tinción FACS (BD Falcon de poliestireno de fondo redondo-tubos, 352 008) o de fondo en U placa de 96 pocillos (BD Falcon 353 910). Volumen de la muestra es de 200 l tinción, a una concentración final de células 0,5 a 1 x 10 7 células / ml o 1.2 x 10 6 células / muestra de 200 microlitros. </li></ol> 3. Preparación de las células de médula ósea <ol><li> Prepare una o jeringas de 3 ml con una aguja 26G, precargada con tinción de amortiguación frío. </li><li> Quitar músculos que se insertan en el fémur con el fin de visualizar claramente el hueso. </li><li> Usando tijeras quirúrgicas agudas, cortar los dos extremos del fémur, lo más cerca posible a los extremos de los huesos. Esto debe revelar un pequeño agujero en cada extremo del corte, lo que lleva en la cavidad de la médula ósea, que corre a través de la longitud del fémur. </li><li> El uso de las jeringas precargadas en el paso 1, insertar la aguja en uno de estos agujeros, y lave cuidadosamente la médula a través del agujero en el otro extremo, en un tubo. </li><li> Disociar las células bañadas por pipeteo suave, y la tensión a través de un colador de 40 micras, como para el bazo por encima (ver sección 2.1). </li><li> Lavar las células dos veces por centrifugación en frío buffer de tinción </li><li> Contar las células y resuspender como en la sección 2.4. Los rendimientos típicos son alrededor de 10 7 células por fémur. </li></ol> 4. Preparación de las células de hígado fetal <ol><li> Para preparar el tiempo del embarazo los ratones hembra, creado ratones para el apareamiento de la tarde, para examinar tapones vaginales antes de las 10 horas del día siguiente, el día en que se detectó el tapón vaginal se considera día 0,5. El personal veterinario puede ser capaz de ayudar a los investigadores que no están familiarizados con esta técnica para identificar a las mujeres embarazadas. El embarazo también puede ser determinado por el peso de vigilancia del ratón. </li><li> Cronometrada embarazadas ratones hembras son sacrificadas en los días de 12,5 a 14,5 del embarazo. Los cuernos uterinos se retiran en un plato de Petri que contiene helado medio de cultivo o tinción de amortiguación. </li><li> Los embriones se extraen de cada útero y el hígado del feto disecado es. Un microscopio de disección es necesario para el día embrionario 12.5 (E12.5) o menos. </li><li> Hígados pueden ser disociados mecánicamente pipeteando en tampón y se procesan de forma individual en placas de 96 pozos, o agrupados en conjunto, en función de las necesidades experimentales. </li><li> Un hígado fetal en E13.5 ha ~ 10 7 células. Las células se lavan dos veces en buffer de tinción y se resuspendió en 2.1 x 10 6 células / muestra de 200 l para el análisis de citometría de flujo. </li></ol> 5. Tinción de anticuerpos por citometría de flujo <ol><li> Prepare un anticuerpo primario manchas de pre-mezcla que se utilizará para todas las muestras, a excepción de las muestras de control, que contiene lo siguiente: <ul><li> ChromePure conejo IgG (Jackson, 015-000-003), a una concentración final de 200μg/ml. Comprobar la concentración de valores en la botella (puede variar). Esto se utiliza para bloquear los receptores Fc en células de ratón, especies alternativas que pueden ser utilizados para esto son IgG de ratón o rata IgG. La elección de especies se determina por la posible presencia en el protocolo de tinción de anticuerpos secundarios contra primarios de rata / ratón / conejo anticuerpos, en cuyo caso las especies no se pueden utilizard como anticuerpos bloqueantes. Por otra parte, el 5% de suero de conejo también puede ser utilizado en lugar de IgG purificada. Otra alternativa es el uso de anticuerpos monoclonales o fragmentos Fab dirigido a los receptores Fc de ratón. El protocolo básico a continuación no incluyen los anticuerpos IgG secundaria y por lo tanto de ninguna de las tres especies pueden ser utilizados. </li><li> CD71-FITC, diluido 1:200 (stock 0.5mg/ml, BD Biosciences-, 553.266) </li><li> Ter119-PE, diluido 1:200 (stock 0.2mg/ml, BD Biosciences-, 553673) </li><li> Los anticuerpos adicionales dirigidos a epítopos superficie de interés, por ejemplo, anticuerpos dirigidos a Fas o FasL (ver 1,2). Mezclar la solución de anticuerpos suavemente invirtiendo el tubo 2-3 veces. </li></ul></li><li> Añadir 200 ul de la pre-mezcla para cada muestra de células y suavemente volver a suspender las células. </li><li> Preparar las muestras de control celular de la siguiente manera: <ul><li> &quot;Teñir&quot;: estas células se dejan en el buffer de tinción y proporcionar la autofluorescencia de fondo de las celdas. </li><li> Controles &quot;de un solo color: una de control, se requiere para cada anticuerpo / color que se utiliza en el protocolo. Las células de estos controles se tiñen bien con un anticuerpo primario conjugado directamente, o con ambos un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario conjugado. Estos controles se utilizan para corregir el solapamiento espectral entre canales. </li><li> &quot;Fluorescencia menos uno&quot; (FMO) controles: un control es necesario para cada anticuerpo / color en el protocolo: las células se tiñeron con todos los colores / anticuerpos en el protocolo, excepto por el color / del anticuerpo para el cual este es el control de FMO. El control de FMO para un canal en particular proporciona el fondo verdadero de ese canal. Puede incluir no específica del anticuerpo del mismo isotipo, conjugado y con la misma marca de fluorescencia como la prueba de anticuerpos (control de isotipo). </li></ul></li><li> Incubar las muestras y los controles pertinentes en el anticuerpo primario mancha en hielo durante 45 &#39;a 1 hora en la oscuridad (colocar la cubierta de papel de aluminio en cubo de hielo). </li><li> Al final de la incubación, se lavan las células mediante la adición de 3 ml de solución tampón de tinción para cada tubo de muestra y el giro de 3 &#39;a 5&#39; aproximadamente a 400 xg a 4 ° C. Si utiliza placas de 96 pocillos, se lavan las células tres veces en un volumen de 200 l. </li><li> En su caso, aplicar el anticuerpo secundario mancha. Aplicar y lavar como para el primer anticuerpo mancha. </li><li> Su caso, una mancha con anexina V se aplica al final de la incubación, utilizando un tampón HEPES como en las instrucciones del fabricante. Esta mancha se aplica durante 15 minutos a temperatura ambiente, o durante 1 hora en hielo. </li><li> Las células se volvió a suspender para el análisis de citometría de flujo en la tinción de solución que contiene un tinte de ADN de células impermeable, para excluir a las células muertas. Varios colorantes de ADN están disponibles, incluyendo yoduro de propidio, 7-amino-actinomicina D (7AAD), o DAPI. La elección de entre estos depende de los canales disponibles, teniendo en cuenta los canales de toma para la tinción de anticuerpos específicos, y los canales disponibles en el citómetro de flujo. 7AAD se obtiene a partir de BD Biosciences, (559.925) y se utiliza según las instrucciones del fabricante. Para la tinción DAPI, hacer un balance de 1mg/ml en dimetilformamida (DMF) a partir de polvo (Roche, Cat # 236 276), mantener a -20 ° C y diluir 1:10.000 a 1:15.000 en buffer de tinción. </li></ol> 6. Citometría de flujo clasificación <ol><li> Las células son marcadas con anticuerpos contra CD71, Ter119, marcadores de linaje, y un tinte de viabilidad como se describe para el análisis por citometría de flujo (sección 5). La concentración de células durante el etiquetado puede ser mayor a 5 x 10 7 / ml. </li><li> Mezclar un volumen igual de cada uno de los siguientes anticuerpos para hacer la mezcla maestra linaje: <ul><li> FITC rata anti-CD41 de ratón MWReg30, BD Pharmingen 553848 </li><li> FITC rata anti-ratón CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553087 </li><li> Hamster FITC anti-ratón CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553061 </li><li> FITC rata anti-ratón CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557396 </li><li> Rata FITC anti-ratón Ly-6G y Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553126 </li><li> Use la mezcla maestra a 1:80 (Esto es equivalente a 1:400 de dilución de cada anticuerpo acciones individuales, que son de 0,5 mg / ml). </li></ul></li><li> Uso bajo condiciones de presión y boquillas de clasificación de ancho. Para el Aria (BD Biosciences) utilizamos 100 μ de la boquilla, la presión de 20 psi. </li><li> Colección de búfer: PBS con adición de 20% de suero fetal bovino. </li><li> Para comprobar la pureza de las poblaciones ordenados, vuelva a ejecutar una pequeña alícuota de cada muestra en un búfer que contiene un tinte de viabilidad (7AAD o similar). </li></ol> 7. Los resultados representativos: CD71/Ter119 coloración de los adultos de médula ósea o el bazo identifica una secuencia de desarrollo de los cuatro grupos, con la etiqueta ProE, Erya, EryB y Eryc (Figura 1) 1. Morfológicamente, estos corresponden a los eritroblastos cada vez más maduro. La Figura 1 ilustra la secuencia de disparo en la etapa de análisis de datos, lo que descarta eventos muy pequeños (incluyendo los núcleos, los glóbulos rojos), las células agregadas y las células muertas. Expresión de proteínas de la superficie celular se puede medir de forma simultánea para cada uno de estos subconjuntos, mediante la adición de los anticuerpos relevantes en el momento mismo que Ter119 y la tinción de CD71. La figura 1 muestra un ejemplo de expresión de la superficie celular de los receptores de muerte Fas 1. Esta medición se llevó a cabo en ratones inyectados con EPO, o en el control de ratones inyectados con solución salina. Es evidente que la Epo suprime la expresión de Fas en la población Erya en vivo 1. Expresión de las proteínas intracelulares o el estado del ciclo celular también se puede medir por las células en cada subgrupo. La figura 2 muestra un análisis representativo del ciclo celular de las células recién cosechadas de la médula ósea. Estas medidas requieren, además de la tinción de la superficie celular con CD71 y Ter119, la fijación y permeabilización de las células para el etiquetado intracelular (ver sección de Discusión). En el hígado fetal, las células no eritroides son los primeros excluidos por gating en &quot;Lin-&#39;las células que son negativas para CD41, Mac-1, Gr-1, B220 y CD3 (Figura 3). Las células restantes se sub-divide en seis subgrupos, S0 a S5. La estructura precisa de las células en el hígado fetal depende de la edad embrionaria (ver sección de Discusión). Un análisis del ciclo celular representante del subgrupo de S3 en E13.5 hígado fetal se muestra (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 El CD71/Ter119 subconjuntos eritroides en el bazo del ratón estrategia de apertura de puerta A.:.. Las células del bazo fueron procesados ​​y etiquetados con anticuerpos dirigidos a CD71, Ter119 y Fas. Esta figura muestra la estrategia de análisis después de la etapa de adquisición de datos. Histograma que muestra todos los eventos adquiridos. La puerta de diagonal representa eventos que es probable que sean las células individuales, con exclusión de dobletes o agregados más grandes. Las celdas de esta puerta se analizan más en el histograma II. Acontecimientos que tienen lugar muy pequeño, probablemente núcleos o residuos, están excluidos. Las células cerradas se muestran en el histograma III, donde DAPI de células positivas, que probablemente permeable la membrana de las células apoptóticas, se excluyen del análisis posterior. Histograma IV muestra la población como resultado de las células del bazo viable. La puerta de ProE contiene CD71 de alta Ter119 células intermedias. Ter119 células de alta se analizan más en el histograma V. Aquí CD71 células de alta se subdividen en menos maduros, grandes &#39;Erya&#39; eritroblastos (CD71 Ter119 alta alta alta FSC) y el más pequeño, más maduro &quot;EryB &#39;eritroblastos (CD71 alta Ter119 alto bajo FSC) . El subconjunto eritroblastos más madura es Eryc (CD71 baja Ter119 alto bajo FSC). VI histograma muestra la superficie celular expresión de Fas, específicamente en el subconjunto Erya, en ratones, en el estado basal (inyección de solución salina), y los ratones inyectados con una sola dosis de EPO. Tinción con el anticuerpo Fas se llevó a cabo simultáneamente con la tinción CD71/Ter119. B. Cytospin preparativos de células seleccionadas de cada uno de los subgrupos indicó. Las células fueron teñidas con Giemsa y con Diaminobencidina, este último genera una mancha marrón con la hemoglobina. Datos Cytospin fue publicado originalmente en Liu et al., Blood. 2006 01 de julio, 108 (1) :123-33. Epub 2006 09 de marzo. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Análisis del ciclo celular de CD71 de alta Ter119 eritroblastos de alta en la médula ósea de ratones. Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con BrdU y el bazo o la médula ósea fueron cosechadas 30 a 60 minutos más tarde. Las células fueron fijadas y permeabilized y además de ser teñidas con CD71 y Ter119, se tiñeron de incorporación de BrdU en su ADN replicar con un anticuerpo monoclonal dirigido a BrdU (protocolo de fijación, la permeabilización y BrdU mancha fue de acuerdo a las instrucciones del fabricante). BrdU-positivas las células se encuentran en la fase S del ciclo. Las células en interfase se BrdU-negativas y pueden ser resueltos en las fases G1 y G2 / M, utilizando el ADN tinte 7AAD. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3 CD71/Ter119 subconjuntos eritroides en el hígado fetal de ratón A. estrategia de apertura de puerta:.. Las células fetales de hígado fueron etiquetados para CD71, Ter119, y un cóctel de FITC anticuerpos dirigidos a marcadores de linaje no eritroides (&#39;Lin&#39;). Células viables (7AAD negativos) fueron analizados para la expresión de Lin, y el Lin-células se subdividen en los S0 a S5 subconjuntos eritroides. Joven, E13 hígado fetal se compone de eritroblastos menos maduros, que se muestra por la ausencia de células maduras en el S4/S5 subconjuntos. B. Cytospin preparativos de las células se separa de cada uno de los subgrupos indicó. Las células fueron teñidas con Giemsa y con Diaminobencidina, este último genera una mancha marrón con la hemoglobina. Datos Cytospin fue originalmente pPrevistos en Pop et al, PLoS Biol 8 (9):. e1000484. doi: 10.1371/journal.pbio.1000484. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Análisis del ciclo celular de hígado fetal subconjuntos eritroides. Ratones embarazadas fueron inyectados con BrdU, y el hígado fetal se cosecharon 30 a 60 minutos después, fijo, permeabilized y teñidas con anticuerpos contra CD71, Ter119 y BrdU. El ciclo celular de las células de S3 se muestra.

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	<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis.">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li><li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry.">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li><li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis.">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis.">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li><li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+dysplasia,+megaloblastic+anemia,+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction.">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li><li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells.">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li></ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Universidad de Massachusetts Medical School IACUC comité.

La metodología de citometría de flujo permite la investigación simultánea de cualquier función celular que puede ser detectada con un anticuerpo específico conjugado con fluorescencia o ligando, incluidos los marcadores de superficie celular, expresión de la proteína, la supervivencia celular, la señalización celular utilizando fosfato anticuerpos específicos 3 y el estado del ciclo celular. Estas mediciones se pueden hacer en cada uno de una serie de subgrupos específicos de la etapa de diferenci...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Fas-biotina </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554256 </td></tr><tr><td> Estreptavidina-APC </td><td> Las sondas moleculares </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 micras filtro de células estériles </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> Poliestireno de fondo redondo de tubos para la tinción FACS </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td></tr><tr><td> De fondo en U placa de 96 pocillos </td><td> BD Falcon </td><td> 353910 </td></tr><tr><td> ChromePure conejo IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) </td><td> BD Biosciences- </td><td> 553266 </td></tr><tr><td> Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) </td><td> BD Biosciences- </td><td> 553673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD Biosciences- </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> DAPI en polvo </td><td> Roche </td><td> 236276 </td></tr><tr><td> FITC rata anti-CD41 de ratón MWReg30 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553848 </td></tr><tr><td> FITC rata anti-ratón CD45R/B220 RA3-6B2 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553087 </td></tr><tr><td> FITC rata anti-ratón CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557396 </td></tr><tr><td> Rata FITC anti-ratón Ly-6G y Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553126 </td></tr><tr><td> Hamster FITC anti-ratón CD3e 145-2C11 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553061 </td></tr><tr><td> APC BrdU flujo kit </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557892 </td></tr><tr><td> Anexina V-biotina </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556418 </td></tr></tbody></table>

identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay

El estudio de la eritropoyesis tiene como objetivo entender cómo las células rojas se forman a partir de progenitores hematopoyéticos y antes eritroides. En concreto, la tasa de formación de glóbulos rojos está regulada por la hormona eritropoyetina (EPO), cuya síntesis es provocada por la hipoxia tisular. Una amenaza para la adecuada oxigenación a los tejidos en los resultados de un rápido aumento de la EPO, impulsando un aumento en la tasa de eritropoyesis, un proceso conocido como la respuesta al estrés eritropoyética. El aumento resultante en el número de glóbulos rojos mejora la entrega de oxígeno tisular. Una respuesta eficaz estrés eritropoyética tanto, es fundamental para la supervivencia y la recuperación de las condiciones fisiológicas y patológicas como la altitud, anemia, hemorragia, la quimioterapia o trasplante de células madre. El ratón es un modelo clave para el estudio de la eritropoyesis y su respuesta al estrés. Eritropoyesis definitiva del ratón (tipo adulto) se lleva a cabo en el hígado fetal entre los días embrionarias 12,5 y 15,5, en el bazo neonatal, y en el bazo y la médula ósea adulta. Los métodos clásicos de identificación de los progenitores eritroides en el tejido de confiar en la capacidad de estas células para dar lugar a colonias de glóbulos rojos cuando se siembran en la EPO que contienen medio semi-sólido. Su progenie precursores eritroides se identifican con base en criterios morfológicos. Ninguno de estos métodos clásicos permiten el acceso a un gran número de diferenciación de etapas específicas de las células eritroides para el estudio molecular. Aquí presentamos un método de citometría de flujo de identificación y estudio de la diferenciación etapa específica de los progenitores eritroides y precursores, directamente en el contexto de tejido de ratón recién aisladas. El ensayo se basa en los marcadores de superficie celular CD71, Ter119, y en la citometría de flujo parámetro &quot;dispersión frontal, que es una función del tamaño de la celda. El ensayo CD71/Ter119 puede ser usado para estudiar los progenitores eritroides en su respuesta al estrés eritropoyética en vivo, por ejemplo, en ratones con anemia o ratones alojados en condiciones de poco oxígeno. También puede ser utilizado para estudiar los progenitores eritroides directamente en los tejidos de ratones adultos o de embriones genéticamente modificados, a fin de evaluar la función específica de la vía de modificación molecular de la eritropoyesis.

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Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Un método de citometría de flujo para la identificación y el análisis molecular de la diferenciación de etapas específicas de murino progenitores eritroides y precursores, directamente en la médula ósea recién cosechadas del ratón, el bazo o el hígado fetal. El ensayo se basa en los marcadores de superficie celular CD71, Ter119 y tamaño de la celda.

Identificación y análisis de los progenitores eritroides ratón usando el CD71/TER119 citometría de flujo ensayo

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

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Video: Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

Un análisis cuantitativo de la insulina que expresan la formación de colonias de progenitores

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Investigación

Biología

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

Ensayo de cribado basado en sA-Galactosidasa para la identificación de medicamentos senoterapéuticos

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Análisis Cytometric del vesículas extracelulares de medios acondicionado de célula de flujo

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) en el músculo esquelético en la rata

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through megakaryopoiesis. The final stages of this process are complex and classically involve the bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) and the unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). These populations precede the formation of bona fide megakaryocytes and, as such, their isolation and characterization could allow for the robust and unbiased analysis of megakaryocyte formation. This protocol presents in detail the procedure to collect hematopoietic cells from mouse bone marrow, the enrichment of hematopoietic progenitors through magnetic depletion and finally a cell sorting strategy that yield highly purified MEP and MKp populations. First, bone marrow cells are collected from the femur, the tibia, and also the iliac crest, a bone that contains a high number of hematopoietic progenitors. The use of iliac crest bones drastically increases the total cell number obtained per mouse and thus contributes to a more ethical use of animals. A magnetic lineage depletion was optimized using 450 nm magnetic beads allowing a very efficient cell sorting by flow cytometry. Finally, the protocol presents the labeling and gating strategy for the sorting of the two highly purified megakaryocyte progenitor populations: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) and MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright). This technique is easy to implement and provides enough cellular material to perform i) molecular characterization for a deeper knowledge of their identity and biology, ii) in vitro differentiation assays, that will provide a better understanding of the mechanisms of maturation of megakaryocytes, or iii) in vitro models of interaction with their microenvironment.

This method describes the purification by flow cytometry of MEP and MKp from mice femurs, tibias, and pelvic bones.

Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Análisis cuantitativo de la mitofagia en células β pancreáticas murinas

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient insulin release. Advanced quantitative assessments of mitophagy often require the use of genetic reporters. The mt-Keima mouse model, which expresses a mitochondria-targeted pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe for quantifying mitophagy via flow cytometry, has been optimized in &#946;-cells. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions can be used to robustly quantify mitophagy. However, using genetic mitophagy reporters can be challenging when working with complex genetic mouse models or difficult-to-transfect cells, such as primary human islets. This protocol describes a novel complementary dye-based method to quantify &#946;-cell mitophagy in primary islets using MtPhagy. MtPhagy is a pH-sensitive, cell-permeable dye that accumulates in the mitochondria and increases its fluorescence intensity when mitochondria are in low pH environments, such as lysosomes during mitophagy. By combining the MtPhagy dye with Fluozin-3-AM, a Zn2+ indicator that selects for &#946;-cells, and Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE) to assess mitochondrial membrane potential, mitophagy flux can be quantified specifically in &#946;-cells via flow cytometry. These two approaches are highly complementary, allowing for flexibility and precision in assessing mitochondrial quality control in numerous &#946;-cell models.

Autor destacado: Evaluación del flujo de mitofagia en las células β pancreáticas utilizando enfoques complementarios efectivos y robustos 

This protocol outlines two methods for the quantitative analysis of mitophagy in pancreatic &#946;-cells: first, a combination of cell-permeable mitochondria-specific dyes, and second, a genetically encoded mitophagy reporter. These two techniques are complementary and can be deployed based on specific needs, allowing for flexibility and precision in quantitatively addressing mitochondrial quality control.

Enfoques complementarios para interrogar el flujo de mitofagia en las células β pancreáticas

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Análisis cuantitativo de la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo por imágenes

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

Autor destacado: Avance de la investigación en la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo de imágenes

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

Citometría de flujo por imágenes para estudiar la autoagregación microbiana

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...