Biz UMass flow sitometri çekirdek teşekkür ederim: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu ve Tammy Krupoch. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü / NHLBI RO1 HL084168 (MS) ve NIH CA T32-130.807 (JRS) tarafından finanse edildi. Diyabet Endokrinoloji Araştırma Merkezi hibe DK32520 tarafından desteklenen temel kaynakları da kullanılmıştır.

1. Dokuların hasat <ol><li> 2 ila 5 ml soğuk boyama tamponu (salin (PBS)% 0,2 BSA ve 5mM glikoz fosfat tamponlu) içeren tüplere hazırlayın. Doku hasat öncesi buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> Cull fareler uygun onaylanan protokole göre (örneğin CO 2 inhalasyon servikal dislokasyon takip). </li><li> EDTA veya heparin kan toplama tüpleri içine kalp ponksiyon daha sonra analiz, hematokrit örneğin, retikülosit sayımı veya CBC analizi için kan çizin. </li><li> 1. adımda hazırlanan ayrı bir tüp, her bir fare doku yerleştirerek, dalak ve kemik Hasat. Dalak kolay erişim sol tarafında. Kemik iliği, hasat biri veya her ikisi femur. Hasat doku buz üzerinde tutun. </li><li> İsterseniz, dalak tartın. Eritropoetik bir stres yanıtı geçiren Fare dalak ağırlığı önemli bir artış göstermesi muhtemeldir. </li></ol> 2. Dalak hücrelerinin hazırlanması <ol><li> Önceden ıslatılmış 3 ml şırınga pistonu kullanarak, dalak, dalak parçası (ideal olarak, yaklaşık 10 8 hücre eşdeğer 0.1 gram veya daha az) 40 mikron steril hücre süzgeç (Fisherbrand katalog numarası 22.363.547 veya diğer) ile hafifçe itmek 50 ml konik bir tüp yerleştirilir. Bu işlem sırasında tüp buz üzerinde tutun. Toplam 2 ml boyama tampon bir süzgeç vasıtasıyla hücrelere yıkayın. </li><li> Herhangi bir küçük öbekler kırmak için hafifçe gergin hücre süspansiyonu pipetle. Gerekirse, hücrelerin tekrar süzün. </li><li> Santrifüj yoluyla hücreler iki kez yıkayın ve soğuk tampon yeniden askıya. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücrelerin güvenin. Tipik verimi 1-2 x 10 8 hücre / dalak. Akış sitometri analizi için, aliquote ya FACS boyama tüp içine örnek başına 1 ila 2 milyon hücre, (BD Falcon polistiren yuvarlak alt tüpler, 352.008) veya U-bottom 96 plaka (BD Falcon 353.910). Örnek boyama hacmi son bir hücre konsantrasyonu 0,5 için 1 x 10 7 hücre / ml veya 1-2, ul 200 x 10 6 hücre / 200 ul örnek. </li></ol> 3. Kemik iliği hücreleri hazırlanması <ol><li> 1 veya 3 ml bağlı bir 26g iğne, soğuk boyama tamponu ile önceden doldurulmuş şırınga hazırlayın. </li><li> Femur kemik açıkça görselleştirmek şekilde bağlı kaslar çıkarın. </li><li> Kemik uçları mümkün keskin cerrahi makas, femur iki ucu kapalı snip, yakın kullanma. Bu femur uzunluğu boyunca çalışan kemik iliği boşluğu, giden, her kesim sonunda küçük bir delik ortaya çıkarmak gerekir. </li><li> 1. adımda önceden doldurulmuş şırınga kullanarak, iğne, bu delikler aracılığıyla takın, ve bir tüp içine yavaşça, diğer ucunda kemik iliği delikten dışarı floş. </li><li> Yukarıdaki dalak olarak 40 mikron (bkz. bölüm 2.1) süzgeç ile kızarmış yumuşak pipetleme hücreleri ve zorlanma ayrıştırmaları. </li><li> Soğuk boyama tamponu santrifüj hücreler iki kez yıkayın </li><li> Hücre sayımı ve bölüm 2.4 &#39;te olarak tekrar süspansiyon haline getirin. Tipik verim femur başına yaklaşık 10 7 hücrelerdir. </li></ol> 4. Fetal karaciğer hücrelerinin hazırlanması <ol><li> Zaman gebe dişi farelerde hazırlamak için, akşam çiftleşme için fareler kurmak; vajinal fişler için 10, takip eden gün saat önce incelemek; vajinal fiş tespit edildiği gün, günde 0,5 olarak kabul edilir. Veteriner personelin hamile kadın tanımlamak için bu tekniği ile yabancı araştırmacılar yardımcı olabilir. Gebelik aynı zamanda izleme fare ağırlığı ile tespit edilebilir. </li><li> Zamanlı gebe dişi fareler için günde 12.5 ile 14.5 ve gebelik üzerine itlaf. Uterin boynuz buz gibi kültür ortamı ya da boyama tamponu içeren bir Petri yemek kaldırılır. </li><li> Embriyolar her rahim kaldırılır ve fetal karaciğer disseke edilir. Diseksiyon mikroskobu embriyonik gün 12.5 (E12.5) veya genç için gereklidir. </li><li> Karaciğerleri mekanik tampon içinde pipetleme dissosiye olabilir ve 96 plaka ayrı ayrı ya da işlenmiş, ya da deneysel gereksinimlerine bağlı olarak, bir araya toplanmış. </li><li> E13.5 A fetal karaciğer ~ 10 7 hücreleri vardır. Hücreler tampon boyama iki kez yıkanır ve akım sitometri analizi için 1-2 x 10 6 hücre / 200 ul örnek yeniden süspanse edilir. </li></ol> 5. Flow sitometri antikor boyama <ol><li> Kontrol örnekleri dışında, aşağıdaki maddeleri içeren tüm numuneler için kullanılan ön-mix boyama primer antikor hazırlayın: <ul><li> 200μg/ml bir final konsantrasyon ChromePure Tavşan IgG (Jackson, 015-000-003). Şişenin üzerindeki stok konsantrasyonu (değişebilir) kontrol edin. Bu fare hücreleri Fc reseptörleri engellemek için kullanılır; bunun için kullanılıyor olabilir alternatif türlerin fare IgG veya sıçan IgG. Türlerin seçimi, bu türler olamaz bu durumda primer sıçan / fare / tavşan antikorları karşı sekonder antikor boyama protokolde potansiyel varlığı ile belirlenir.d engelleme antikorlar gibi. Alternatif olarak,% 5 tavşan serumu, saf IgG yerine de kullanılıyor olabilir. Bir başka alternatif monoklonal antikorlar veya fare Fc reseptörlerine yönelik Fab parçaları kullanmaktır. Aşağıda temel protokolü, herhangi bir sekonder antikorlar içermez ve herhangi bir üç tür IgG kullanılan olabilir. </li><li> CD71-FITC, 1:200 oranında sulandırılmış (stok 0.5mg/ml, BD Biosciences, 553.266) </li><li> Ter119-PE, 1:200 (stok 0.2mg/ml, BD Biosciences, 553.673) seyreltilmiş </li><li> Herhangi bir ek antikorlar ilgi yüzey epitoplar yönettiği, örneğin antikorlar, Fas ya da FasL (1,2) yönetti . Antikor çözümü tersini tüp 2-3 kez hafifçe karıştırın. </li></ul></li><li> Her bir hücre örneği 200 ul ön karışımı ekleyin ve yavaşça hücrelerin yeniden askıya. </li><li> Kontrol hücre örnekleri aşağıdaki gibi hazırlayın: <ul><li> &#39;Lekesiz&#39; tampon boyama bu hücrelerin sol ve hücrelerin arka plan otofloresans sağlar. </li><li> &#39;Tek renk&#39; denetimleri: antikor / protokolünde kullanılan her renk için böyle bir kontrol gereklidir. Bu kontrollerde hücreler ya doğrudan konjuge primer antikor ile boyanmış ya da birincil bir antikor ve konjuge sekonder antikor ile. Bu kontroller, kanallar arasında spektral örtüşme düzeltmek için kullanılır. </li><li> &#39;Floresans eksi bir&#39; (FMO) kontrolleri: böyle bir kontrol protokolü her antikor / renk için gerekli olan hücreleri hariç protokol tüm renkleri / antikorlar ile boyanarak renk / FMO kontrolü için antikor. FMO kontrolü, belirli bir kanal için bu kanal için gerçek bir arka plan sağlar. Bu non-spesifik antikor, aynı izotip ve test antikor (izotipi kontrol) aynı floresan işareti ile konjuge içerebilir. </li></ul></li><li> Primer antikor inkübe örnekleri ve ilgili denetimler 45 &#39;1 saat karanlıkta (alüminyum folyo kapak buz kovası koymak) için buz üzerinde leke. </li><li> Inkübasyon sonunda, yaklaşık 400 xg 4 ° C 3 &#39;5&#39; için, her numune tüpü ve spin boyama tampon 3ml ekleyerek hücreleri yıkamak 96 kuyucuğu kullanıyorsanız, hacmi 200 ul hücreler üç defa yıkamak. </li><li> Ilgili, ikincil antikor leke geçerlidir. Ilk antikor leke olarak uygulayın ve yıkayın. </li><li> Annexin V ile ilgili ise, bir leke üreticinin talimatlarına gibi HEPES tamponu kullanarak, inkübasyon sonunda uygulanır. Bu leke, oda sıcaklığında 15 dakika süreyle uygulanır, ya da 1 saat buz üzerinde. </li><li> Hücreleri ölü hücreleri hariç, geçirimsiz bir hücre DNA boya içeren çözüm boyama akış sitometri analizi için yeniden askıya alınır. Birkaç DNA boyaları Propidium İyodür, 7-amino-aktinomisin D (7AAD), ya da DAPI da dahil olmak üzere mevcuttur. Bunların arasından seçim spesifik antikor boyama için alınan kanallar mevcut kanalları, akış sitometresinde mevcut kanalları bağlıdır. 7AAD BD-Biyobilimler (559.925) elde edilen ve üreticinin talimatlarına göre kullanılır. DAPI boyama için, (Roche, Kedi # 236.276) toz 1mg/ml bir stok dimetilformamid (DMF) -20 ° C&#39;de tutmak ve tampon boyama 1:15,000 için 1:10,000 sulandırmak. </li></ol> 6. Flow-sitometrik sıralama <ol><li> Hücreler CD71 karşı antikorlar, Ter119, soy işaretleri ve akış sitometri analizi (Bölüm 5) açıklandığı gibi bir canlılığı boya ile etiketlenir. 5 etiketleme sırasında hücre konsantrasyonu artabilir x 10 7 / ml. </li><li> Soy ana karışımı yapmak için aşağıdaki antikorların her bir eşit miktarda karıştırın: <ul><li> FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553.848 </li><li> FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553.087 </li><li> FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553.061 </li><li> FITC Rat Anti-Mouse CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557.396 </li><li> FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G ve Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553.126 </li><li> (Bu her 0,5 mg / ml &#39;her bir antikor hisse senetleri, 1:400 dilüsyon eşdeğerdir) 1:80 ana karışımı kullanın. </li></ul></li><li> , Düşük basınç sıralama koşulları ve geniş memeleri kullanın. Aria (BD Biosciences) 100 μ memesi, 20 psi basınç kullanın. </li><li> Koleksiyon tampon: PBS ile% 20 fetal sığır serumu ekledi. </li><li> Sıralanmış popülasyonlarının saflık kontrol etmek için, bir canlılığı boya içeren bir tampon (7AAD veya benzeri) her örnekten küçük bir kısım yeniden çalıştırın. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: CD71/Ter119 yetişkin kemik iliği veya dalak boyama etiketli ProE Erya, EryB ve EryC (bkz. Şekil 1) 1, dört alt kümelerini bir gelişim sırasını belirler. Morfolojik olarak, bu giderek daha olgun erythroblasts karşılık gelir. Şekil 1, çok küçük bir olay (çekirdek, kırmızı kan hücrelerinin de dahil olmak üzere), toplu hücreler ve ölü hücreleri atar veri analizi aşamasında, yolluk sırasını göstermektedir. Hücre yüzey proteinleri İfade Ter119 ve CD71 boyama aynı zamanda ilgili antikorlar ekleyerek, bu alt gruplarının her biri için eş zamanlı olarak ölçülür. Şekil 1, 1 Fas ölüm reseptörü hücre yüzey ekspresyonu bir örnek gösterir . Bu ölçüm Epo ile enjekte edilen farelerde gerçekleştirilen ya da kontrol farelerde serum fizyolojik enjekte edildi. Epo in vivo 1 Erya nüfus Fas ifade bastırır açıktır. Her alt hücreleri için hücre içi proteinler ya da hücre döngüsü durumu ifade de ölçülebilir. Şekil 2 taze hasat edilen kemik iliği hücreleri temsilcisi hücre döngüsü analizi göstermektedir. Bu ölçümler gerektiren CD71 ve Ter119 hücre yüzeyi boyama ek olarak, hücre içi etiketleme (Tartışma bölümüne bakınız) hücrelerinin fiksasyon ve permeabilization. Fetal karaciğer, non-eritroid hücreler CD41 için negatif &#39;Lin-hücreler, Mac-1, Gr-1, B220 ve CD3 (Şekil 3) ilk yolluk tarafından dışlanır. Geri kalan hücrelerin alt ayrılmıştır S0 S5 6 alt kümelerini içine. Fetal karaciğer hücrelerinin hassas desen (Tartışma bölümüne bakınız) embriyonik yaşına bağlıdır. E13.5 fetal karaciğerde S3 alt kümesi bir temsilci hücre döngüsü analizi (Şekil 4) gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. fare dalak CD71/Ter119 eritroid altkümelerini A. Ayırıcı stratejisi: Dalak hücreleri işlenmiş ve CD71, Ter119 ve Fas yönelik antikorları ile etiketlenir. Bu rakam, veri toplama adım izleyerek analiz strateji gösterir. Histogram ben edinilmiş tüm etkinlikleri gösterir. Çapraz kapı, çiftlerin ya da büyük agrega hariç, tek hücre, olması muhtemel olayları temsil eder. Hücreler bu kapıdan daha histogram II analiz edilmektedir. Burada çok küçük olaylar, büyük olasılıkla çekirdekleri veya enkaz, dışlanır. Kapılı hücrelerin membran geçirgen apoptotik hücreleri muhtemeldir DAPI-pozitif hücreler, daha fazla analiz dışında tutulmuştur histogram III gösterilmiştir. Histogram IV yaşayabilir dalak hücrelerinin ortaya çıkan nüfus gösterir. ProE kapısı CD71 yüksek Ter119 ara hücreleri içerir. Ter119 yüksek hücreleri daha histogram analiz V. Burada CD71 yüksek hücreler daha az olgun, büyük &#39;Erya&#39; erythroblasts (CD71 yüksek Ter119 yüksek FSC yüksek) ve daha küçük, daha olgun &#39;EryB&#39; erythroblasts (CD71 yüksek Ter119 yüksek FSC düşük) bölünmüştür . En olgun erythroblast altkümesi EryC (CD71 düşük Ter119 yüksek FSC düşük). Histogram VI, özellikle Erya alt grubunda bazal durumda fareler (tuzlu su enjekte) ve Epo tek bir doz ile enjekte edilen farelerde hücre yüzey Fas ifade, gösterir. Fas antikoru ile boyama, CD71/Ter119 boyama ile eşzamanlı olarak yapıldı. Belirtilen alt gruplarının her birinden sıralanmış hücre B. sitospin preparatları . Hücreler Giemsa ile boyanmış ve diaminobenzidin, ikincisi hemoglobin ile kahverengi bir leke üretir. Sitospin veri aslında Liu ve ark yayımlandı, Kan. Tem 1, 2006, 108 (1) :123-33. Epub 2006 Mar 9. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 fare kemik iliğinde CD71 yüksek Ter119 yüksek erythroblasts Hücre döngüsü analizi. Fareler BrdU intraperitoneal olarak enjekte edildi ve dalak ve kemik iliği 30 ila 60 dakika sonra toplandı. Hücreleri sabit ve permeabilize (fiksasyon, permeabilization ve BrdU boyama protokol, üreticinin talimatlarına göre), CD71 ve Ter119 lekeli BrdU birleştirmek için kendi kopyalayan DNA&#39;sına BrdU yönelik bir monoklonal antikor ile boyandı. BrdU-pozitif hücre döngüsünün S-faz. Interfaz hücreleri BrdU-negatif ve DNA boya 7AAD kullanarak, G1 veya G2 / M aşamaya çözülebilir. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 fare fetal karaciğerde CD71/Ter119 eritroid altkümelerini A. Ayırıcı stratejisi:. Fetal karaciğer hücreleri CD71, Ter119 etiketli, ve olmayan eritroid soy belirteçleri (&#39;Lin&#39;) yönetti FITC etiketli antikorlar bir kokteyl. Canlı hücreler (7AAD-negatif), Lin ifade incelendi ve Lin-hücreler daha S0 S5 eritroid altkümelerini bölünmüştür. Genç ve olgun S4/S5 altkümelerini hücrelerin yokluğunda gösterilen daha az olgun erythroblasts, E13 fetal karaciğer oluşur belirtilen alt gruplarının her birinden sıralanmış hücreler B. sitospin preparatları . Hücreler Giemsa ile boyanmış ve diaminobenzidin, ikincisi hemoglobin ile kahverengi bir leke üretir. Sitospin veri başlangıçta pPop ve ark ublished PLoS Biol 8 (9): e1000484. DOI: 10.1371/journal.pbio.1000484. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4, fetal karaciğer eritroid altkümelerini hücre döngüsü analizi. BrdU ile Hamile farelere enjekte edildi ve fetal ciğeri permeabilize, sabit, 30 ila 60 dakika sonra hasat ve CD71, Ter119 ve BrdU karşı antikor ile boyandı . S3 hücreleri hücre döngüsü durumu gösterilir.

<ol>
	<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis.">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li><li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry.">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li><li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis.">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis.">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li><li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+dysplasia,+megaloblastic+anemia,+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction.">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li><li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells.">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li></ol>

Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi IACUC komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Akış sitometri yöntemi, hücre yüzey belirteçleri, protein ekspresyonu, hücre sağkalım, fosfor-spesifik antikorların 3 ve hücre döngüsü durumu kullanarak hücre sinyalizasyon dahil olmak üzere bir floresan konjuge spesifik antikor veya ligand, ile tespit edilebilir herhangi bir hücresel fonksiyonları eş zamanlı olarak soruşturma sağlar. Bu ölçümler, taze izole eritropoetik doku bağlamında, farklılaşma aşamasında belirli alt kümelerini bir dizi her yapılabilir. Bu yöntem, bu ned...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> FAS-biotin </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554256 </td></tr><tr><td> Streptavidin APC </td><td> Moleküler Probları </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 mikron steril hücre süzgeç </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> FACS boyama için polistiren yuvarlak alt tüpler </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td></tr><tr><td> U-bottom 96 plaka </td><td> BD Falcon </td><td> 353910 </td></tr><tr><td> ChromePure Tavşan IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71-FITC (hisse senedi 0.5mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553266 </td></tr><tr><td> Ter119-PE (hisse senedi 0.2mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD-Biosciences </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> DAPI tozu </td><td> Roche </td><td> 236276 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553848 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553087 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557396 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G ve Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553126 </td></tr><tr><td> FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553061 </td></tr><tr><td> APC BrdU Akış kiti </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557892 </td></tr><tr><td> Annexin V-biotin </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556418 </td></tr></tbody></table>

identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay

Eritropoez çalışmada, kırmızı kan hücrelerinin erken hematopoetik ve eritroid atalarıdır nasıl şekillendiğini anlamak hedefliyor. Özellikle kırmızı hücre oluşumu oranı sentezi, doku hipoksisi tarafından tetiklenir eritropoietin hormonu (EPO), tarafından düzenlenir. Epo hızlı bir artış yeterli oksijenlenme sonuçları, eritropoetik oranı artış sürüş için bir tehdit, eritropoetik stres yanıtı olarak bilinen bir süreçtir. Dolaşımdaki kırmızı hücrelerin sayısında artış dokuya oksijen taşınmasını artırır. Bu nedenle, verimli bir eritropoetik stres yanıtı yüksek irtifa, anemi, kanama, kemoterapi ya da kök hücre nakli gibi fizyolojik ve patolojik koşullarda hayatta kalma ve kurtarma için kritik öneme sahiptir. Fare eritropoezi çalışma ve stres yanıtı için önemli bir model. Fare kesin (erişkin tip) eritropoezi yenidoğan dalak, ve yetişkin dalak ve kemik iliği, fetal karaciğer embriyonik gün 12,5 ve 15,5 arasında yer alır. Dokusunda eritroid atalarıdır Klasik yöntemler, kırmızı hücre kolonileri Epo içeren yarı-katı medya kaplama yol vermek için bu hücrelerin yeteneği güveniyor. Onların eritroid prekürsör döl morfolojik kriterlere göre tespit edilir. Ne bu klasik yöntemlerle moleküler çalışma için farklılaşma aşamalı özel eritroid hücreler çok sayıda erişim sağlar. Burada doğrudan taze izole fare doku bağlamında farklılaşma aşamalı özel eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve eğitimi bir akış sitometri yöntemi mevcut. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 dayanmaktadır ve akış sitometrik &#39;ileriye dağılım&#39; parametre, hangi hücre büyüklüğünün bir fonksiyonudur. CD71/Ter119 testi in vivo eritropoetik strese tepki sırasında eritroid atalarıdır çalışma için kullanılabilir, örneğin, anemik fare ya da fare düşük oksijen koşullarında ev sahipliği yapmaktadır. Ayrıca eritropoezi değiştirilmiş moleküler yolun belirli bir rolü değerlendirmek üzere, eritroid, genetik olarak değiştirilmiş yetişkin fareler ya da embriyoların dokularda doğrudan atalarıdır çalışma olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay at JoVE.com

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Doğrudan taze hasat fare kemik iliği, dalak veya fetal karaciğer farklılaşma aşamalı özel fare eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve moleküler analiz için bir akış sitometri yöntemi. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 ve hücre boyutu dayanır.

CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

identification-analysis-mouse-erythroid-progenitors-using-cd71ter119

Research

JoVE Journal

Biology

32.0K Görüntüleme.  University of Massachusetts Medical School. Doğrudan taze hasat fare kemik iliği, dalak veya fetal karaciğer farklılaşma aşamalı özel fare eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve moleküler analiz için bir akış sitometri yöntemi. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 ve hücre boyutu dayanır.

Video: Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

İnsülin ifade Koloni oluşturan atalarıdır için Kantitatif Testi

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Biyoloji

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

Senoterapötik Ilaçların tanımlanması için SA-β-Galactosidaz tabanlı tarama tahlili

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Hücre şartına ortamdan hücre dışı veziküller sitometrik analizinde akışı

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Sıçandaki İskelet Kasında Fibro-Adipojenik Progenitörlerin (FAP' ler) ve Miyojenik Progenitörlerin (Milletvekilleri) Tanımlanması, İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through megakaryopoiesis. The final stages of this process are complex and classically involve the bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) and the unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). These populations precede the formation of bona fide megakaryocytes and, as such, their isolation and characterization could allow for the robust and unbiased analysis of megakaryocyte formation. This protocol presents in detail the procedure to collect hematopoietic cells from mouse bone marrow, the enrichment of hematopoietic progenitors through magnetic depletion and finally a cell sorting strategy that yield highly purified MEP and MKp populations. First, bone marrow cells are collected from the femur, the tibia, and also the iliac crest, a bone that contains a high number of hematopoietic progenitors. The use of iliac crest bones drastically increases the total cell number obtained per mouse and thus contributes to a more ethical use of animals. A magnetic lineage depletion was optimized using 450 nm magnetic beads allowing a very efficient cell sorting by flow cytometry. Finally, the protocol presents the labeling and gating strategy for the sorting of the two highly purified megakaryocyte progenitor populations: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) and MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright). This technique is easy to implement and provides enough cellular material to perform i) molecular characterization for a deeper knowledge of their identity and biology, ii) in vitro differentiation assays, that will provide a better understanding of the mechanisms of maturation of megakaryocytes, or iii) in vitro models of interaction with their microenvironment.

This method describes the purification by flow cytometry of MEP and MKp from mice femurs, tibias, and pelvic bones.

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Murin Pankreatik β-Hücrelerinde Mitofajinin Kantitatif Analizi

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient insulin release. Advanced quantitative assessments of mitophagy often require the use of genetic reporters. The mt-Keima mouse model, which expresses a mitochondria-targeted pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe for quantifying mitophagy via flow cytometry, has been optimized in &#946;-cells. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions can be used to robustly quantify mitophagy. However, using genetic mitophagy reporters can be challenging when working with complex genetic mouse models or difficult-to-transfect cells, such as primary human islets. This protocol describes a novel complementary dye-based method to quantify &#946;-cell mitophagy in primary islets using MtPhagy. MtPhagy is a pH-sensitive, cell-permeable dye that accumulates in the mitochondria and increases its fluorescence intensity when mitochondria are in low pH environments, such as lysosomes during mitophagy. By combining the MtPhagy dye with Fluozin-3-AM, a Zn2+ indicator that selects for &#946;-cells, and Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE) to assess mitochondrial membrane potential, mitophagy flux can be quantified specifically in &#946;-cells via flow cytometry. These two approaches are highly complementary, allowing for flexibility and precision in assessing mitochondrial quality control in numerous &#946;-cell models.

Yazar Spotlight: Pankreas β hücrelerinde mitofaji akısının etkili ve sağlam tamamlayıcı yaklaşımlar kullanılarak değerlendirilmesi 

This protocol outlines two methods for the quantitative analysis of mitophagy in pancreatic &#946;-cells: first, a combination of cell-permeable mitochondria-specific dyes, and second, a genetically encoded mitophagy reporter. These two techniques are complementary and can be deployed based on specific needs, allowing for flexibility and precision in quantitatively addressing mitochondrial quality control.

Pankreas β Hücrelerinde Mitofaji Akısını Sorgulamak İçin Tamamlayıcı Yaklaşımlar

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak Mikrobiyal Otoagregasyonun Kantitatif Analizi

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

Yazar Spotlight: Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanarak Mikrobiyal Otoagregasyonda Araştırmaları Geliştirme

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

Mikrobiyal otoagregasyonu incelemek için görüntüleme akışı sitometrisi

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...