Ringraziamo il UMass nucleo citometria a flusso: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu e Tammy Krupoch. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) e NIH CA T32-130807 (JRS). Risorse di base sostenuto dalla Endocrinologia Diabetes Research Center concedere DK32520 sono stati utilizzati anche.

1. La raccolta dei tessuti <ol><li> Preparare provette contenenti 2-5 buffer di colorazione fredda ml (soluzione salina tampone fosfato (PBS) con aggiunta di 0,2% di BSA e glucosio 5mm). Sì che le tubature in ghiaccio prima del raccolto dei tessuti. </li><li> Cull topi in accordo con il protocollo approvato (CO es. 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale). </li><li> Prelievo di sangue da puntura cardiaca in EDTA o eparina tubi di raccolta del sangue per analisi successive, ad esempio, di ematocrito, conta dei reticolociti o analisi CBC. </li><li> Raccolta la milza e le ossa, ponendo tessuti da ogni mouse in un tubo separato, preparato al punto 1. Facile accesso a milza è dal lato sinistro. Per il midollo osseo, la raccolta di uno o entrambi i femori. Mantenere il tessuto raccolte sul ghiaccio. </li><li> Se lo si desidera, pesare la milza. I topi sottoposti a una risposta eritropoietica lo stress è probabile che presentino un significativo aumento del peso della milza. </li></ol> 2. Preparazione di cellule della milza <ol><li> Utilizzando un pre-umidificata 3 ml stantuffo della siringa, spingere delicatamente la milza, o una parte della milza (idealmente, 0,1 grammi o meno, pari a circa 10 8 cellule) attraverso un colino 40 micron cellula sterile (numero di catalogo Fisherbrand 22363547 o altro) collocato su un tubo da 50 ml. Tenere la provetta in ghiaccio durante questa procedura. Lavare le cellule attraverso il filtro con un totale di 2 ml di tampone colorazione. </li><li> Pipetta delicatamente la sospensione forzata delle cellule per rompere eventuali grumi di piccole dimensioni. Se necessario, ri-deformazione delle cellule. </li><li> Lavare le cellule due volte tramite centrifugazione e ri-sospendere in tampone a freddo. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Le rese sono 1-2 x 10 8 cellule / milza. Per le analisi di citometria a flusso, aliquote 1-2000000 cellule per campione, sia in tubi colorazione FACS (BD polistirolo Falcon fondo rotondo tubi, 352008) o U-bottom 96 pozzetti (BD Falcon 353910). Colorazione volume del campione è di 200 microlitri, ad una concentrazione cellulare finale ,5-1 x 10 7 cellule / ml o 1-2 x 10 6 cellule / 200 microlitri del campione. </li></ol> 3. Preparazione di cellule di midollo osseo <ol><li> Preparare 1 o 3 ml siringhe con un ago inserito 26G, pre-riempita con tampone colorazione fredda. </li><li> Rimuovere i muscoli collegati al femore in modo da visualizzare l&#39;osso in modo chiaro. </li><li> Utilizzando taglienti forbici chirurgiche, snip fuori entrambe le estremità del femore, il più vicino possibile alle estremità delle ossa. Questo dovrebbe rivelare un piccolo foro alle estremità tagliata, leader nella cavità del midollo osseo, che attraversa la lunghezza del femore. </li><li> Utilizzando il siringhe pre-riempite al punto 1, inserire l&#39;ago attraverso uno di questi fori, e delicatamente a filo il midollo attraverso il buco dall&#39;altra parte, in un tubo. </li><li> Dissociare le cellule lavata pipettando dolce, e filtrare con un colino 40 micron, come per la milza superiori (vedere paragrafo 2.1). </li><li> Lavare le cellule due volte tramite centrifugazione in tampone colorazione fredda </li><li> Contare le cellule e risospendere come nella sezione 2.4. Le rese sono circa 10 7 cellule per femore. </li></ol> 4. Preparazione delle cellule del fegato fetale <ol><li> Per preparare topi di sesso femminile a tempo-incinta, istituito topi per l&#39;accoppiamento, la sera, per esaminare le spine vaginale entro le ore 10 del giorno successivo, il giorno in cui viene rilevata la spina vaginale è considerato giorno 0,5. Il personale veterinario sia in grado di assistere i ricercatori che non hanno familiarità con questa tecnica per identificare le donne in gravidanza. Gravidanza può essere determinata anche in peso di monitoraggio del mouse. </li><li> Topi femmina incinte sono scadute abbattuti nei giorni 12,5-14,5 di gravidanza. Le corna uterine vengono rimossi in una Petri-piatto contenente ghiacciata terreno di coltura o di buffer colorazione. </li><li> Gli embrioni sono stati rimossi da ogni dell&#39;utero e del fegato fetale è sezionato. Un microscopio da dissezione è richiesto per il giorno embrionale 12,5 (E12.5) o più giovani. </li><li> Fegato può essere dissociato meccanicamente pipettando nel buffer, e sono trattati singolarmente in piastre a 96 pozzetti, o in pool insieme, a seconda delle esigenze sperimentali. </li><li> Un fegato fetale a E13.5 ha ~ 10 7 cellule. Le cellule vengono lavate due volte in colorazione buffer e risospese a 1-2 x 10 6 cellule / 200 microlitri del campione per l&#39;analisi di citometria di flusso. </li></ol> 5. Colorazione anticorpi per citometria a flusso <ol><li> Preparare un anticorpo primario colorazione pre-mix da utilizzare per tutti i campioni, ad eccezione di campioni di controllo, contenente quanto segue: <ul><li> ChromePure coniglio IgG (Jackson, 015-000-003), ad una concentrazione finale di 200μg/ml. Controllare la concentrazione magazzino sulla bottiglia (che può variare). Questo è usato per bloccare i recettori Fc in cellule di topo, specie alternative che possono essere utilizzati per questo sono IgG di topo o ratto IgG. Scelta delle specie è determinata dalla potenziale presenza nel protocollo di colorazione di anticorpi diretti contro secondaria primari di ratto / topo / coniglio anticorpi, nel qual caso tali specie non può essere utilizzatod come anticorpi bloccanti. In alternativa, siero di coniglio 5% può inoltre essere utilizzato al posto di IgG purificate. Un&#39;ulteriore alternativa è l&#39;uso di anticorpi monoclonali o frammenti Fab diretto a livello dei recettori Fc mouse. Il protocollo di base di seguito non include alcun anticorpi IgG secondario e quindi di una qualsiasi delle tre specie possono essere utilizzati. </li><li> CD71-FITC, diluito 1:200 (stock 0.5mg/ml, BD-Biosciences, 553266) </li><li> Ter119-PE, diluito 1:200 (stock 0.2mg/ml, BD-Biosciences, 553673) </li><li> Eventuali ulteriori anticorpi diretti a epitopi superficie di interesse, ad esempio, gli anticorpi diretti al Fas o FasL (vedi 1,2). Mescolare la soluzione di anticorpi delicatamente invertendo il tubo di 2-3 volte. </li></ul></li><li> Aggiungere 200 ml di pre-mix per ogni campione cellulare e risospendere delicatamente le cellule. </li><li> Preparare i campioni di cellule di controllo come segue: <ul><li> &#39;Non colorati&#39;: queste cellule vengono lasciate in colorazione tampone e di fornire l&#39;autofluorescenza di sfondo delle celle. </li><li> Controlli &#39;monocolore&#39;: un tale controllo è richiesto per ogni anticorpo / colore utilizzato nel protocollo. Le cellule di questi controlli sono macchiati o con un anticorpo coniugato direttamente primario, o sia con un anticorpo primario e un anticorpo secondario coniugato. Questi controlli vengono utilizzati per correggere sovrapposizione spettrale tra i canali. </li><li> &#39;Fluorescenza meno uno&#39; (FMO) controlli: un controllo tale è richiesto per ogni anticorpo / colore nel protocollo: le cellule sono colorate con tutti i colori / anticorpi nel protocollo, tranne per il colore / anticorpo per cui questo è il controllo FMO. Il controllo QOR per un particolare canale fornisce lo sfondo vero per quel canale. Può includere non specifici anticorpi dello stesso isotipo e coniugato con lo stesso marchio fluorescenza come l&#39;anticorpo test (controllo isotipico). </li></ul></li><li> Incubare i campioni ed i controlli rilevanti nel anticorpo primario macchia in ghiaccio per 45 &#39;a 1 ora al buio (messo foglio di copertura in alluminio su ghiaccio secchio). </li><li> Alla fine di incubazione, lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 3 ml di tampone colorazione ad ogni provetta e girare per 3 &#39;a 5&#39; a circa 400 xga 4 ° C. Se si utilizza piastre a 96 pozzetti, lavare le cellule tre volte in un volume di 200 l. </li><li> Se del caso, applicare anticorpo secondario macchia. Applicare e lavare come per il primo anticorpo macchia. </li><li> Se del caso, una macchia con annessina V è applicata alla fine di incubazione, utilizzando un buffer Hepes come nelle istruzioni del produttore. Questa macchia è applicata per 15 minuti a temperatura ambiente, o per 1 ora su ghiaccio. </li><li> Le cellule sono nuovamente sospesi per l&#39;analisi di citometria a flusso nella colorazione soluzione contenente una cella-impermeabile colorante del DNA, di escludere le cellule morte. Coloranti del DNA sono disponibili diversi, tra cui ioduro di propidio, 7-amino-actinomicina D (7AAD), o DAPI. La scelta di questi dipende, tra i canali disponibili, dato i canali ripreso per la colorazione degli anticorpi specifici e canali disponibili sul citometro a flusso. 7AAD è ottenuto da BD-Biosciences (559.925) e utilizzato secondo le istruzioni del produttore. Per la colorazione DAPI, fare uno stock di 1mg/ml in dimetilformammide (DMF) da polvere (Roche, Cat # 236276), tenere a -20 ° C e diluire 1:10.000 a 1:15.000 in colorazione buffer. </li></ol> 6. Citometria a flusso ordinamento <ol><li> Le cellule sono etichettati con anticorpi anti-CD71, Ter119, marcatori lignaggio, e un colorante vitalità come descritto per analisi di citometria di flusso (sezione 5). Concentrazione delle cellule durante l&#39;etichettatura può essere aumentata a 5 x 10 7 / ml. </li><li> Mescolare un uguale volume di ciascuno dei seguenti anticorpi per rendere il master mix lignaggio: <ul><li> FITC Rat anti-topo CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553848 </li><li> FITC Rat anti-topo CD45R/B220 RA3-6b2, BD Pharmingen 553087 </li><li> Hamster FITC anti-topo CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553061 </li><li> FITC Rat anti-topo CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557396 </li><li> FITC Rat anti-topo Ly-6G e Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553126 </li><li> Utilizzare il master mix a 1:80 (Questo è equivalente a diluizione 1:400 di ciascun individuo titoli di anticorpi, che sono tutti 0,5 mg / ml). </li></ul></li><li> Usa bassa pressione condizioni di ordinamento e ugelli di larghezza. Per l&#39;Aria (BD Biosciences) che usiamo 100 ugelli μ, 20 psi di pressione. </li><li> Collezione buffer: PBS con aggiunta del 20% siero fetale bovino. </li><li> Per controllare la purezza delle popolazioni in ordine, ri-eseguire una piccola aliquota di ogni campione in un buffer che contiene un colorante vitalità (7AAD o simili). </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: CD71/Ter119 colorazione degli adulti di midollo osseo o milza identifica una sequenza evolutiva di quattro sottoinsiemi, etichettati ProE, EryA, EryB e Eryc (Figura 1) 1. Morfologicamente, questi corrispondono a eritroblasti sempre più maturo. La figura 1 illustra la sequenza di gating in fase di analisi dei dati, che scarta evento molto piccoli (tra cui nuclei, globuli rossi), le cellule aggregati e cellule morte. Espressione di proteine ​​di superficie cellulare possono essere misurate simultaneamente per ognuno di questi sottoinsiemi, aggiungendo gli anticorpi relativi al tempo stesso Ter119 e CD71 colorazione. La figura 1 mostra un esempio di espressione sulla superficie cellulare del recettore Fas morte 1. Questa misurazione è stata effettuata in topi trattati con Epo, o nei topi di controllo iniettati con soluzione salina. E &#39;evidente che Epo sopprime l&#39;espressione di Fas nella popolazione EryA in vivo 1. Espressione di proteine ​​intracellulari o ciclo cellulare lo stato può anche essere misurata per le cellule in ogni sottogruppo. La figura 2 illustra rappresentante analisi del ciclo cellulare delle cellule del midollo osseo appena raccolte. Queste misure richiedono, oltre alla colorazione della superficie delle cellule con CD71 e Ter119, la fissazione e la permeabilizzazione delle cellule per l&#39;etichettatura intracellulare (vedere la sezione di discussione). Nel fegato fetale, non eritroidi cellule vengono prima esclusi da gating su &#39;Lin-&#39; cellule che sono negative per CD41, Mac-1, Gr-1, B220 e CD3 (Figura 3). Le cellule rimanenti sono suddivisi in 6 sottogruppi, S0 a S5. Il modello preciso di cellule nel fegato fetale dipende dall&#39;età embrionale (vedere la sezione di discussione). Un rappresentante di analisi del ciclo cellulare del sottoinsieme S3 in E13.5 fegato fetale viene visualizzato (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 CD71/Ter119 sottoinsiemi eritroide nella milza del mouse strategia Gating A.:.. Le cellule della milza sono stati elaborati ed etichettato con anticorpi diretti a CD71, Ter119 e Fas. Questa figura mostra la strategia di analisi che segue la fase di acquisizione dati. Istogramma I mostra tutti gli eventi acquisiti. Il cancello diagonale rappresenta gli eventi che possono essere singole cellule, escluse le doppiette o più grandi aggregati. Le cellule in questa porta verranno analizzati nella istogramma II. Eventi qui molto piccoli, nuclei probabile o detriti, sono esclusi. Le cellule gated sono mostrati in istogramma III, in cui sono esclusi DAPI cellule positive, che sono probabilmente cellule apoptotiche membrana permeabile, da ulteriori analisi. Istogramma IV mostra la popolazione risultante di cellule della milza vitali. Il cancello ProE contiene CD71 alto Ter119 cellule intermedie. Ter119 cellule alte sono ulteriormente analizzati in istogramma V. Qui le cellule CD71 elevati sono suddivisi in meno maturi, grandi eritroblasti &#39;EryA&#39; (CD71 alto Ter119 alta FSC alto) e più piccoli, più maturi &#39;EryB&#39; eritroblasti (CD71 alto Ter119 alto FSC basso) . Il sottoinsieme eritroblasti più maturi sono Eryc (CD71 bassa Ter119 alta FSC basso). VI istogramma mostra espressione sulla superficie cellulare Fas, in particolare nel sottogruppo EryA, nei topi, nello stato basale (iniettati con soluzione fisiologica), e topi iniettati con una singola dose di Epo. Colorazione con anticorpi Fas è stata effettuata in contemporanea con la colorazione CD71/Ter119. B. Cytospin preparazioni di cellule ordinate da ciascuno dei sottoinsiemi indicati. Le cellule sono state colorate con Giemsa e con diaminobenzidina, quest&#39;ultimo genera una macchia marrone con l&#39;emoglobina. Dati Cytospin è stato originariamente pubblicato nel Liu et al. Sangue. 1 luglio 2006, 108 (1) :123-33. Epub Mar 2006 9. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Analisi del ciclo cellulare del CD71 alta Ter119 eritroblasti alto nel midollo osseo dei topi. I topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con BrdU, e della milza o del midollo osseo sono state raccolte 30 a 60 minuti dopo. Le cellule sono state fissate e permeabilizzate e oltre ad essere colorate per CD71 e Ter119, sono state colorate per incorporazione di BrdU nel loro DNA la replica con un anticorpo monoclonale diretto a BrdU (protocollo di fissazione, permeabilizzazione e BrdU-colorazione è stata secondo le istruzioni del produttore). BrdU-positive le cellule sono in fase S del ciclo. Cellule interfase sono BrdU-negativi e possono essere risolti in fasi G1 o G2 / M, usando il DNA colorante 7AAD. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3 CD71/Ter119 sottoinsiemi eritroide nel fegato fetale topo strategia Gating A.:.. Cellule del fegato fetale sono stati etichettati per CD71, Ter119, e un cocktail di anticorpi coniugati con fluoresceina direttamente i non eritroide marcatori lignaggio (&#39;Lin&#39;). Cellule vitali (7AAD-negativo) sono stati analizzati per l&#39;espressione Lin, e Lin-cellule sono ulteriormente suddivisi in S0 a S5 sottoinsiemi eritroidi. Giovane, E13 fegato fetale è composto da eritroblasti meno mature, dimostra l&#39;assenza di cellule mature in S4/S5 sottoinsiemi. B. Cytospin preparazioni di cellule ordinate da ciascuno dei sottoinsiemi indicati. Le cellule sono state colorate con Giemsa e con diaminobenzidina, quest&#39;ultimo genera una macchia marrone con l&#39;emoglobina. Dati Cytospin originariamente published in Pop et al, PLoS Biol 8 (9):. e1000484. doi: 10.1371/journal.pbio.1000484. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Analisi del ciclo cellulare di sottoinsiemi fegato fetale eritroide. Femmine di topo gravide sono stati iniettati con BrdU e fegato fetale sono state raccolte 30 a 60 minuti dopo, fissa, permeabilizzate e colorate con anticorpi anti-CD71, Ter119 e BrdU. Ciclo cellulare delle cellule stato S3 è mostrato.

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	<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis.">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li><li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry.">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li><li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis.">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis.">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li><li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+dysplasia,+megaloblastic+anemia,+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction.">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li><li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells.">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li></ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dalla University of Massachusetts Medical School IACUC commissione.

Il flusso-citometria metodologia permette indagine simultanea di tutte le funzioni cellulari che possono essere rilevati con una fluorescenza coniugato anticorpo specifico o ligando, tra cui marcatori di superficie cellulare, espressione di proteine, la sopravvivenza cellulare, segnalazione cellulare utilizzando anticorpi fosfo-specifici 3 e lo stato del ciclo cellulare. Queste misurazioni possono essere effettuate in ciascuna di un certo numero di differenziazione fase sottoinsiemi specifici, nel contesto di...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Fas-biotina </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554256 </td></tr><tr><td> Streptavidina-APC </td><td> Molecular Probes </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 micron filtro cellule sterili </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> Polistirolo a fondo rotondo tubi per la colorazione FACS </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td></tr><tr><td> U-bottom 96 pozzetti </td><td> BD Falcon </td><td> 353910 </td></tr><tr><td> ChromePure coniglio IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553266 </td></tr><tr><td> Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD-Biosciences </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> DAPI polvere </td><td> Roche </td><td> 236276 </td></tr><tr><td> FITC Rat anti-topo CD41 MWReg30 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553848 </td></tr><tr><td> FITC Rat anti-topo CD45R/B220 RA3-6b2 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553087 </td></tr><tr><td> FITC Rat anti-topo CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557396 </td></tr><tr><td> FITC Rat anti-topo Ly-6G e Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553126 </td></tr><tr><td> Hamster FITC anti-topo CD3e 145-2C11 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553061 </td></tr><tr><td> APC BrdU flusso kit </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557892 </td></tr><tr><td> Annessina V-biotina </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556418 </td></tr></tbody></table>

identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay

Lo studio dell&#39;eritropoiesi si propone di capire come globuli rossi sono formate da progenitori ematopoietici in precedenza e eritroide. In particolare, il tasso di formazione dei globuli rossi è regolata dalla ormone eritropoietina (Epo), la cui sintesi è innescata da ipossia tissutale. Una minaccia a risultati adeguati ossigenazione dei tessuti in un rapido aumento Epo, guidando un aumento della frequenza eritropoietica, un processo noto come la risposta allo stress eritropoietica. Il conseguente aumento del numero dei globuli rossi circolanti aumenta l&#39;ossigeno di consegna dei tessuti. Una risposta efficace dello stress eritropoietica è quindi fondamentale per la sopravvivenza e il recupero da condizioni fisiologiche e patologiche quali l&#39;altitudine elevata, anemia, emorragia, la chemioterapia o il trapianto di cellule staminali. Il mouse è un modello fondamentale per lo studio della eritropoiesi e la sua risposta allo stress. Eritropoiesi topo definitiva (di tipo adulto) avviene nel fegato fetale tra i giorni embrionale 12,5 e 15,5, nella milza neonatale, e nella milza e nel midollo osseo degli adulti. Metodi classici di identificazione progenitori eritroidi nel tessuto si basano sulla capacità di queste cellule per dare origine a colonie di globuli rossi quando placcato in Epo contenenti semi-solido dei media. Loro progenie precursore eritroidi sono identificate sulla base di criteri morfologici. Nessuno di questi metodi classici consentire l&#39;accesso a un gran numero di differenziazione-stadio-specifiche cellule eritroidi per lo studio molecolare. Qui vi presentiamo un flusso-citometria metodo di identificazione e differenziazione studio-stadio-specifici progenitori eritroidi e precursori, direttamente nel contesto del tessuto del mouse appena isolato. Il test si basa sulla superficie cellulare marker CD71, Ter119, e sul flusso-citometria a parametro &#39;avanti dispersione&#39;, che è una funzione della dimensione della cella. Il CD71/Ter119 test può essere utilizzato per studiare progenitori eritroidi durante la loro risposta allo stress eritropoietica in vivo, per esempio, nei topi anemici o nei topi tenuti in condizioni di scarsità di ossigeno. Può anche essere usata per studiare progenitori eritroidi direttamente nei tessuti di topi adulti geneticamente modificati o embrioni, al fine di valutare il ruolo specifico del pathway molecolare modificata in eritropoiesi.

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Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Un metodo di citometria a flusso per l&#39;identificazione e l&#39;analisi molecolare di cellule progenitrici murino differenziazione fase-specifici eritroide e precursori, direttamente nel midollo del mouse appena raccolte osseo, milza o del fegato fetale. Il test si basa sulla superficie cellulare marker CD71, Ter119, e le dimensioni delle cellule.

Identificazione e analisi dei mouse progenitori eritroidi utilizzando il CD71/TER119 Flow-citometria Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

identification-analysis-mouse-erythroid-progenitors-using-cd71ter119

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31.9K Views.  University of Massachusetts Medical School. Un metodo di citometria a flusso per l'identificazione e l'analisi molecolare di cellule progenitrici murino differenziazione fase-specifici eritroide e precursori, direttamente nel midollo del mouse appena raccolte osseo, milza o del fegato fetale. Il test si basa sulla superficie cellulare marker CD71, Ter119, e le dimensioni delle cellule.

Video: Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

Un dosaggio quantitativo di insulina che esprimono formante colonia Progenitori

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

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Biologia

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

L&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

Saggio di screening basato su SA-Galactosidase per l'identificazione dei farmaci senoterapici

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Identificazione, isolamento e caratterizzazione di progenitori fibro-adipogeni (FAPs) e progenitori miogeni (MP) nel muscolo scheletrico nel ratto

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through megakaryopoiesis. The final stages of this process are complex and classically involve the bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) and the unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). These populations precede the formation of bona fide megakaryocytes and, as such, their isolation and characterization could allow for the robust and unbiased analysis of megakaryocyte formation. This protocol presents in detail the procedure to collect hematopoietic cells from mouse bone marrow, the enrichment of hematopoietic progenitors through magnetic depletion and finally a cell sorting strategy that yield highly purified MEP and MKp populations. First, bone marrow cells are collected from the femur, the tibia, and also the iliac crest, a bone that contains a high number of hematopoietic progenitors. The use of iliac crest bones drastically increases the total cell number obtained per mouse and thus contributes to a more ethical use of animals. A magnetic lineage depletion was optimized using 450 nm magnetic beads allowing a very efficient cell sorting by flow cytometry. Finally, the protocol presents the labeling and gating strategy for the sorting of the two highly purified megakaryocyte progenitor populations: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) and MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright). This technique is easy to implement and provides enough cellular material to perform i) molecular characterization for a deeper knowledge of their identity and biology, ii) in vitro differentiation assays, that will provide a better understanding of the mechanisms of maturation of megakaryocytes, or iii) in vitro models of interaction with their microenvironment.

This method describes the purification by flow cytometry of MEP and MKp from mice femurs, tibias, and pelvic bones.

Isolamento dei progenitori dei megacariociti di topo

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Analisi quantitativa della mitofagia nelle cellule β pancreatiche murine

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient insulin release. Advanced quantitative assessments of mitophagy often require the use of genetic reporters. The mt-Keima mouse model, which expresses a mitochondria-targeted pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe for quantifying mitophagy via flow cytometry, has been optimized in &#946;-cells. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions can be used to robustly quantify mitophagy. However, using genetic mitophagy reporters can be challenging when working with complex genetic mouse models or difficult-to-transfect cells, such as primary human islets. This protocol describes a novel complementary dye-based method to quantify &#946;-cell mitophagy in primary islets using MtPhagy. MtPhagy is a pH-sensitive, cell-permeable dye that accumulates in the mitochondria and increases its fluorescence intensity when mitochondria are in low pH environments, such as lysosomes during mitophagy. By combining the MtPhagy dye with Fluozin-3-AM, a Zn2+ indicator that selects for &#946;-cells, and Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE) to assess mitochondrial membrane potential, mitophagy flux can be quantified specifically in &#946;-cells via flow cytometry. These two approaches are highly complementary, allowing for flexibility and precision in assessing mitochondrial quality control in numerous &#946;-cell models.

Autore in primo piano: Valutazione del flusso mitofagico nelle cellule β pancreatiche utilizzando approcci complementari efficaci e robusti 

This protocol outlines two methods for the quantitative analysis of mitophagy in pancreatic &#946;-cells: first, a combination of cell-permeable mitochondria-specific dyes, and second, a genetically encoded mitophagy reporter. These two techniques are complementary and can be deployed based on specific needs, allowing for flexibility and precision in quantitatively addressing mitochondrial quality control.

Approcci complementari per interrogare il flusso mitofagico nelle cellule β pancreatiche

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Analisi quantitativa dell'autoaggregazione microbica mediante citometria a flusso per immagini

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca nell'autoaggregazione microbica mediante citometria a flusso di imaging

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

Citometria a flusso per lo studio dell'autoaggregazione microbica

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...