Wir danken der UMass Durchflusszytometrie Kern: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu und Tammy Krupoch. Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) und NIH CA T32-130807 (JRS) finanziert. Core-Ressourcen durch die Diabetes Endocrinology Research Center gewähren DK32520 unterstützt wurden ebenfalls verwendet.

1. Harvesting von Geweben <ol><li> Bereiten Röhrchen mit 2 bis 5 ml kaltem Färbepuffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Zusatz von 0,2% BSA und 5 mM Glucose). Keep Röhrchen auf Eis vor der Gewebe zu ernten. </li><li> Cull Mäusen nach geeigneten genehmigten Protokoll (z. B. CO 2-Inhalation durch Genickbruch folgte). </li><li> Draw Blut durch Herzpunktion in EDTA-oder Heparin-Blut-Sammlung Rohre für eine spätere Analyse, z. B. von Hämatokrit, Retikulozyten oder CBC-Analyse. </li><li> Ernte der Milz und Knochen, indem Gewebe aus jeder Maus in ein separates Röhrchen, die in Schritt 1 vorbereitet. Einfacher Zugang zu Milz ist von der linken Seite. Für das Knochenmark, die Ernte eines oder beider Oberschenkel. Keep geerntet Gewebe auf Eis. </li><li> Wenn gewünscht, wiegen die Milz. Mäuse Einwirkung einer Erythropoetin-Stress-Reaktion geeignet sind, einen signifikanten Anstieg in Milzgewicht zeigen. </li></ol> 2. Vorbereitung von Milzzellen <ol><li> Mit einem vorbefeuchtete 3 ml Spritzenkolben, schieben Sie die Milz, oder ein Teil der Milz (idealerweise 0,1 Gramm oder weniger, das entspricht ungefähr 10 8 Zellen) durch ein 40 um sterile Zellsieb (Fisherbrand Katalog-Nummer 22363547 oder andere) platziert auf einem 50 ml konischen Rohr. Halten Sie das Röhrchen auf Eis während dieses Vorgangs. Waschen Sie die Zellen durch das Sieb mit einer Gesamtfläche von 2 ml Färbepuffer. </li><li> Gently Pipette die angespannte Zellsuspension aufzubrechen jede kleine Klumpen. Falls erforderlich, erneut belasten die Zellen. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal durch Zentrifugieren und in kaltem Puffer resuspendieren. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Typische Ausbeuten sind 1-2 x 10 8 Zellen / Milz. Für Durchflusszytometrie-Analyse, aliquot 1 bis 2.000.000 Zellen pro Probe, entweder in FACS Färbung Röhrchen (BD Falcon Polystyrol Rundboden-Röhrchen, 352008) oder U-Boden 96-Well-Platte (BD Falcon 353910). Beispiel Färbung Volumen 200 ul, um eine endgültige Zellkonzentration von 0,5 bis 1 x 10 7 Zellen / ml oder 1-2 x 10 6 Zellen / 200 ul Probe. </li></ol> 3. Vorbereitung von Knochenmarkzellen <ol><li> Bereiten Sie 1 oder 3 ml Spritzen mit einem angehängten 26G Nadel, mit kaltem Färbepuffer vorgefüllt. </li><li> Entfernen Sie Muskeln, die an den Oberschenkelknochen, so dass der Knochen deutlich sichtbar zu machen. </li><li> Mit scharfen chirurgischen Schere, schneiden Sie beide Enden des Oberschenkelknochens, so nah wie möglich an den Enden der Knochen. Dies sollte ein kleines Loch an jeder abgeschnittene Ende zeigen, was in das Knochenmark Hohlraum, der durch die Länge des Oberschenkelknochens läuft. </li><li> Mit dem Fertigspritzen in Schritt 1 Führen Sie die Nadel durch eines dieser Löcher, und sanft spülen das Knochenmark durch das Loch am anderen Ende, in ein Rohr. </li><li> Dissoziieren die gespülten Zellen durch vorsichtiges Pipettieren, und durch ein 40 um Sieb für die Milz vor (siehe Abschnitt 2.1). </li><li> Wash Zellen zweimal durch Zentrifugation in kalten Färbepuffer </li><li> Zählen Sie die Zellen und Zellen, wie in Abschnitt 2.4. Typische Ausbeuten sind ungefähr 10 7 Zellen pro Femur. </li></ol> 4. Vorbereitung der fötalen Leberzellen <ol><li> Zur Vorbereitung timed-trächtigen weiblichen Mäusen, Einrichten Mäusen zur Paarung in den Abend, zu untersuchen auf Vaginalpfropf vor 10 Uhr des folgenden Tages, der Tag, an dem die Vaginalpfropf erkannt wird als Tag 0,5. Veterinary Mitarbeiter können möglicherweise Ermittler, die nicht mit dieser Technik, um schwangere Frauen zu identifizieren, zu unterstützen. Eine Schwangerschaft kann auch durch die Überwachung der Maus Gewicht bestimmt werden. </li><li> Timed-schwangeren weiblichen Mäusen werden an den Tagen 12,5 bis 14,5 der Schwangerschaft getötet. Die Uterushörner in eine Petri-Schale mit eiskaltem Kulturmedium oder Färbepuffer entfernt. </li><li> Die Embryonen werden von jedem Gebärmutter entfernt und die fetale Leber präpariert. Ein Binokular ist für Embryonaltag 12,5 (E12.5) oder jünger erforderlich. </li><li> Livers kann getrennt werden mechanisch durch Pipettieren in Puffer und werden entweder einzeln in 96-Well-Platten verarbeitet, oder zusammen, je nach experimentellen Anforderungen zusammengefasst. </li><li> Eine fetale Leber bei E13.5 hat ~ 10 7 Zellen. Die Zellen werden zweimal in Färbepuffer gewaschen und bei 1-2 x 10 6 Zellen / 200 ul Probe für die durchflusszytometrische Analyse. </li></ol> 5. Antikörper-Färbung für die Durchflusszytometrie <ol><li> Bereiten Sie eine primäre Antikörper-Färbung Pre-Mix für alle Proben verwendet werden, mit Ausnahme von Kontrollproben, mit folgendem Inhalt: <ul><li> ChromePure Rabbit IgG (Jackson, 015-000-003), bis zu einer Endkonzentration von 200μg/ml. Prüfen Sie die Lager-Konzentration auf der Flasche (es kann variieren). Dies wird verwendet, um Fc-Rezeptoren in Zellen der Maus blockieren; alternative Arten, die dafür verwendet werden können, sind IgG-oder Ratten-IgG. Species Wahl wird durch die mögliche Anwesenheit in der Färbung Protokoll sekundäre Antikörper gegen primäre Ratte / Maus / Kaninchen-Antikörper, in welchem ​​Fall diese Arten nicht verwenden können gerichtet bestimmtd als blockierende Antikörper. Alternativ können 5% Kaninchenserum auch anstelle von gereinigtem IgG verwendet werden. Eine weitere Alternative ist die Verwendung von monoklonalen Antikörpern oder Fab-Fragmente an der Maus Fc-Rezeptoren gerichtet. Das grundlegende Protokoll unten enthält keine Sekundärantikörper und so IgG von jeder der drei Arten verwendet werden kann. </li><li> CD71-FITC, verdünnt 1:200 (stock 0,5-Promillegrenze, BD-Biosciences, 553266) </li><li> TER119-PE, 1:200 (Lager 0.2mg/ml, BD-Biosciences, 553673) verdünnt </li><li> Jede weitere Antikörper an der Oberfläche Epitope von Interesse gerichtet, z. B. Antikörper an Fas oder FasL (siehe 1,2) gerichtet. Mix der Antikörper-Lösung vorsichtig durch Invertieren des Röhrchens 2-3 mal. </li></ul></li><li> Add 200 ul der Pre-Mix für jede Zelle Probe und sanft wieder aussetzen Zellen. </li><li> Bereiten Kontrolle Zellproben wie folgt: <ul><li> &quot;Ungefärbte &#39;: Diese Zellen sind in Färbepuffer links und bilden den Hintergrund Autofluoreszenz der Zellen. </li><li> &#39;Single color&#39; steuert: eine solche Kontrolle ist für jeden Antikörper / Farbe in das verwendete Protokoll benötigt. Die Zellen in dieser Kontrollen sind entweder mit einem direkt konjugierten Primärantikörper gefärbt, oder sowohl mit einem primären Antikörper und einem konjugierten sekundären Antikörper. Diese Kontrollen dienen dazu, für die spektrale Überlappung zwischen den Kanälen zu korrigieren. </li><li> &quot;Fluorescence minus eins&quot; (FMO) steuert: eine solche Kontrolle ist für jeden Antikörper / Farbe in das Protokoll erforderlich: die Zellen werden mit allen Farben / Antikörper in das Protokoll mit Ausnahme der Farbe gefärbt / Antikörper, bei denen dies der FMO-Steuerung. Die FMO-Steuerung für einen bestimmten Kanal bietet den wahren Hintergrund für diesen Kanal. Es können auch nicht-spezifische Antikörper der gleichen Isotyp und konjugiert mit der gleichen Fluoreszenz-Markierung wie der Test Antikörper (Isotyp-Kontrolle). </li></ul></li><li> Inkubieren Proben und entsprechende Kontrollen in den primären Antikörper auf Eis Fleck für 45 &#39;bis 1 Stunde im Dunkeln (put Alufolie abdecken auf Eis-Eimer). </li><li> Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 3 ml Färbepuffer jedem Probenröhrchen und Spin für 3 &#39;bis 5&#39; bei etwa 400 xg bei 4 ° C. Bei Verwendung von 96-Well-Platten, waschen Sie die Zellen dreimal in einem Volumen von 200 ul. </li><li> Wenn relevant, gelten sekundären Antikörper-Färbung. Übernehmen und waschen wie für den ersten Antikörper-Färbung. </li><li> Gegebenenfalls ist ein Fleck mit Annexin V am Ende der Inkubationszeit aufgetragen, mit einem HEPES-Puffer, wie in der Anleitung des Herstellers. Dieser Fleck ist für 15 Minuten bei Raumtemperatur angewendet, oder für 1 Stunde auf Eis. </li><li> Die Zellen sind für die Durchflusszytometrie-Analyse in Färbelösung mit einem Zell-undurchlässige DNA-Farbstoff resuspendiert, um tote Zellen auszuschließen. Mehrere DNA-Farbstoffe sind verfügbar, einschließlich Propidiumiodid, 7-Amino-Actinomycin D (7AAD) oder DAPI. Die Wahl aus den Reihen dieser hängt von der verfügbaren Kanäle, da die Kanäle für spezifische Antikörper-Färbung genommen und Kanälen auf dem Durchflusszytometer. 7AAD von BD-Biosciences (559925) gewonnen und nach den Anweisungen des Herstellers. Für DAPI-Färbung, einen Bestand von 1mg/ml in Dimethylformamid (DMF) aus Pulver (Roche, Kat. Nr. 236276), halten bei -20 ° C und verdünnt 1:10.000 bis 1:15.000 in Färbepuffer. </li></ol> 6. Durchflusszytometrische Sortierung <ol><li> Die Zellen werden mit Antikörpern gegen CD71, TER119, Abstammung Marker und eine Lebensfähigkeit Farbstoff als für durchflusszytometrische Analyse (Abschnitt 5) beschrieben gekennzeichnet. Zellkonzentration während Kennzeichnung kann auf 5 erhöht werden x 10 7 / ml. </li><li> Mix ein gleiches Volumen an jedem der folgenden Antikörper an die Linie Master-Mix zu machen: <ul><li> FITC Rat Anti-Maus-CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553848 </li><li> FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553087 </li><li> FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553061 </li><li> FITC Rat Anti-Mouse CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557396 </li><li> FITC Rat Anti-Maus-Ly-6G und Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553126 </li><li> Verwenden Sie die Master-Mix auf 1:80 (Dies ist gleichbedeutend mit 1:400 Verdünnung der einzelnen Antikörper Bestände, die alle 0,5 mg / ml sind). </li></ul></li><li> Verwenden Niederdruck-Sortier-Bedingungen und große Düsen. Für die Aria (BD Biosciences) Wir verwenden 100 μ Düse, 20 psi Druck. </li><li> Sammlung Puffer: PBS mit Zusatz von 20% Fetal Bovine Serum. </li><li> Zur Überprüfung der Reinheit der sortierten Populationen, erneut eine kleine Teilmenge von jeder Probe in einem Puffer, der eine Lebensfähigkeit Farbstoff enthält (7AAD oder ähnliches). </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: CD71/Ter119 Färbung der erwachsenen Knochenmark oder Milz identifiziert eine Entwicklungsstörung Sequenz von vier Untergruppen, etikettiert ProE, Erya, EryB und EryC (Abbildung 1) 1. Morphologisch sind diese zunehmend reifen Erythroblasten entsprechen. Abbildung 1 zeigt die Gating-Sequenz an der Datenanalyse Bühne, die sehr kleine Veranstaltung (einschließlich Kerne, roten Blutkörperchen), aggregierten Zellen und tote Zellen verworfen. Expression von Zelloberflächen-Proteine ​​können gleichzeitig für jede dieser Teilmengen gemessen werden, indem die entsprechenden Antikörper zur gleichen Zeit wie TER119 und CD71 Färbung. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel von Zell-Oberflächen-Expression des Todes-Rezeptor Fas 1. Diese Messung wurde in Mäusen mit Epo gespritzt durchgeführt oder in Kontroll-Mäusen mit Kochsalzlösung injiziert. Es ist offensichtlich, dass Epo Fas Ausdruck unterdrückt in der Erya Bevölkerung in vivo 1. Expression von intrazellulären Proteinen oder Zellzyklus-Status kann auch für die Zellen in jeder Teilmenge gemessen werden. Abbildung 2 zeigt repräsentative Zellzyklus-Analyse von frisch geernteten Knochenmarkszellen. Diese Messungen erfordern neben Zelloberflächenfärbung mit CD71 und TER119, die Fixierung und Permeabilisierung von Zellen für den intrazellulären Kennzeichnung (siehe Diskussion Abschnitt). In fetale Leber, sind nicht-erythroiden Zellen zuerst durch Gating auf &quot;Lin-&quot; Zellen, die negativ sind für CD41, Mac-1, Gr-1, B220 und CD3 (Abbildung 3) ausgeschlossen. Die restlichen Zellen sind unterteilt in 6 Teilmengen, S0 bis S5. Die genaue Muster der Zellen in der fötalen Leber ist abhängig von embryonalen Alter (siehe Diskussion Abschnitt). Ein Vertreter des Zellzyklus Analyse der S3 Teilmenge in E13.5 fetale Leber wird angezeigt (Abbildung 4). <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1 Die CD71/Ter119 erythroiden Teilmengen in Mäusemilz A. Gating-Strategie:.. Milzzellen wurden verarbeitet und gekennzeichnet mit Antikörpern an CD71, TER119 und Fas gerichtet. Diese Abbildung zeigt die Analyse-Strategie nach der Datenerfassung fort. Histogramm I zeigt alle erfassten Ereignisse. Die Diagonale Tor repräsentiert Ereignisse, die wahrscheinlich einzigen Zellen, ohne Dubletten oder größere Aggregate werden. Cells in diesem Tor sind weitere in Histogramm II analysiert. Hier sehr kleine Veranstaltungen, wahrscheinlich Kerne oder Schmutz sind ausgeschlossen. Die gated Zellen werden in Histogramm III, wo DAPI-positive Zellen, die wahrscheinlich sind membranpermeabel apoptotischen Zellen, von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden angezeigt. Histogramm IV zeigt die resultierende Population von lebensfähigen Milzzellen. Die ProE Tor enthält CD71 hohen TER119 intermediären Zellen. TER119 hohen Zellen werden weiter in Histogramm analysiert V. Hier CD71 hohen Zellen in weniger reifen, großen &#39;Erya &quot;Erythroblasten (CD71 hohen TER119 hohen FSC hoch) und kleiner, reifer&#39; EryB&quot; Erythroblasten (CD71 hohen TER119 hohen FSC niedrig) unterteilt . Die reifsten Erythroblasten Teilmenge EryC (CD71 niedrigen TER119 hohen FSC low). Histogramm VI zeigt Zelloberflächen-Fas Ausdruck, insbesondere in den Erya Teilmenge, bei Mäusen in den Grundzustand (Injektion von Kochsalzlösung) und Mäuse, die mit einer Einzeldosis von Epo gespritzt. Die Färbung mit Fas-Antikörper wurde gleichzeitig mit der CD71/Ter119 Färbung durchgeführt. B. Cytospin Präparate von Zellen aus jeder der angegebenen Teilmengen sortiert. Die Zellen wurden mit Giemsa gefärbt und mit Diaminobenzidin, erzeugt diese eine braune mit Hämoglobin Fleck. Cytospin Daten ursprünglich in Liu et al., Blood. 2006 Jul 1, 108 (1) :123-33. Epub 2006 Mar 9. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Zellzyklus-Analyse von CD71 hohen TER119 hohen Erythroblasten im Knochenmark der Maus. Die Mäuse wurden intraperitoneal mit BrdU injiziert und Milz oder Knochenmark wurden 30 bis 60 Minuten später geerntet. Die Zellen wurden fixiert und permeabilisiert und abgesehen davon, dass für CD71 und TER119 gebeizt, wurden BrdU-Einbau in die DNA-Replikation mit einem monoklonalen Antikörper an BrdU gerichtet gefärbt (Fixierung, Permeabilisierung und BrdU-Färbung Protokoll wurde nach Herstellerangaben). BrdU-positive Zellen in S-Phase des Zyklus. Interphase-Zellen sind BrdU-negative und kann in G1 oder G2 / M Phasen gelöst werden, mit dem DNA-Farbstoff 7AAD. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3 CD71/Ter119 erythroiden Teilmengen in Maus fetale Leber A. Gating-Strategie:.. Fötalen Leberzellen wurden für CD71, TER119 beschriftet und ein Cocktail von FITC-markierter Antikörper bei nicht-erythroiden Linie Marker (&quot;Lin&quot;) inszeniert. Lebensfähige Zellen (7AAD-negativ) wurden für Lin Ausdruck analysiert und die Lin-Zellen werden weiter in die S0 bis S5 erythroiden Teilmengen unterteilt. Jüngere, ist E13 fetale Leber von weniger reifen Erythroblasten, die durch das Fehlen von Zellen in den reifen S4/S5 Teilmengen gezeigt zusammen. B. Cytospin Präparate von Zellen aus jeder der angegebenen Teilmengen sortiert. Die Zellen wurden mit Giemsa gefärbt und mit Diaminobenzidin, erzeugt diese eine braune mit Hämoglobin Fleck. Cytospin Daten ursprünglich published in Pop et al, PLoS Biol 8 (9):. e1000484. doi: 10.1371/journal.pbio.1000484. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Zellzyklus-Analyse der fötalen Leber erythroiden Teilmengen. Schwangere Mäuse wurden mit BrdU injiziert und fötalen Lebern wurden 30 bis 60 Minuten später geerntet fixiert, permeabilisiert und gefärbt mit Antikörpern gegen CD71, TER119 und BrdU. Zellzyklus-Status der S3-Zellen gezeigt.

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	<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis.">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li><li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry.">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li><li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis.">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis.">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li><li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+dysplasia,+megaloblastic+anemia,+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction.">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li><li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells.">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Massachusetts Medical School IACUC eingesetzten Ausschusses durchgeführt.

Die durchflusszytometrische Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung aller zellulären Funktion, die mit einem Fluoreszenz-konjugierte spezifische Antikörper oder Liganden, einschließlich Zelloberflächenmarker, Proteinexpression, das Überleben der Zelle, Zell-Signal mit Hilfe phospho-spezifische Antikörper 3 und Zellzyklus-Status nachgewiesen werden kann. Diese Messungen können in jedem der eine Reihe von Differenzierungs-Bühne spezifische Teilmengen erfolgen, die im Rahmen von frisch isolier...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Fas-Biotin </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554256 </td></tr><tr><td> Streptavidin-APC </td><td> Molecular Probes </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 um sterile Zellsieb </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> Polystyrol Rundboden-Röhrchen für FACS-Färbung </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td></tr><tr><td> U-Boden 96-Well-Platte </td><td> BD Falcon </td><td> 353910 </td></tr><tr><td> ChromePure Rabbit IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71-FITC (stock 0,5-Promillegrenze) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553266 </td></tr><tr><td> TER119-PE (stock 0.2mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD-Biosciences </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> DAPI Pulver </td><td> Roche </td><td> 236276 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Maus-CD41 MWReg30 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553848 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553087 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557396 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Maus-Ly-6G und Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553126 </td></tr><tr><td> FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553061 </td></tr><tr><td> APC BrdU Flow Kit </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557892 </td></tr><tr><td> Annexin V-Biotin </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556418 </td></tr></tbody></table>

identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay

Das Studium der Erythropoese möchte verstehen, wie rote Blutkörperchen sind aus früheren hämatopoetischen Vorläuferzellen und erythroiden gebildet. Genauer gesagt, ist die Rate der roten Blutkörperchen Bildung durch das Hormon Erythropoietin (Epo), dessen Synthese durch Hypoxie ausgelöst geregelt. Eine Bedrohung für die ausreichende Sauerstoffversorgung des Gewebes führt zu einem raschen Anstieg der Epo, Fahren eine Erhöhung der Erythropoese-Rate, ein Verfahren, wie der erythropoetischen Stress-Reaktion bekannt. Der daraus resultierende Anstieg der Zahl der zirkulierenden roten Blutkörperchen verbessert Gewebe Sauerstoffzufuhr. Eine effiziente erythropoetischen Stress-Reaktion ist daher entscheidend für das Überleben und die Wiederherstellung von physiologischen und pathologischen Bedingungen wie Höhenlage, Anämie, Blutungen, Chemotherapie oder Stammzelltransplantation. Die Maus ist ein Schlüssel-Modell für das Studium der Erythropoese und ihre Reaktion auf Stress. Maus definitive (Erwachsenen-Typ) Erythropoese findet in der fetalen Leber zwischen embryonalen Tage 12.5 und 15.5, in der Neugeborenen-Milz und in der Erwachsenenbildung Milz und Knochenmark. Klassische Methoden zur Identifizierung erythroiden Vorläuferzellen im Gewebe verlassen sich auf die Fähigkeit dieser Zellen zu steigen, um red cell Kolonien geben, wenn in Epo-haltigen halbfesten ausplattiert. Ihre erythroiden Vorläuferzellen Nachkommen werden auf der Basis morphologischer Kriterien identifiziert. Keiner von diesen klassischen Methoden erlauben den Zugriff auf eine große Anzahl von Differenzierungs-Stadium-spezifischen erythroiden Zellen für die molekulare Untersuchung. Hier präsentieren wir Ihnen eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und Differenzierung Studium-stage-spezifischen erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt im Zusammenhang mit der frisch isolierten Maus Gewebe. Der Test beruht auf der Zell-Oberflächenmarker CD71, TER119, und auf der durchflusszytometrischen &#39;forward-scatter&#39; Parameter ist das eine Funktion der Größe der Zellen. Die CD71/Ter119 Assay verwendet werden, um erythroiden Vorläuferzellen während ihrer Antwort auf erythropoetischen Stress in vivo-Studie werden zum Beispiel bei anämischen Mäusen oder Mäusen in sauerstoffarmen Bedingungen untergebracht. Es kann auch verwendet werden, um erythroiden Vorläuferzellen direkt in das Gewebe von genetisch veränderten adulten Mäusen oder Embryonen zu studieren, um die spezifische Rolle der modifizierten molekularen Signalweg in Erythropoese zu beurteilen.

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Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und molekulare Analyse von Differenzierungs-Stadium-spezifische murine erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt in frisch geernteten Maus Knochenmark, Milz oder fetale Leber. Der Test beruht auf der Zelloberfläche Marker CD71, TER119 und Zellgröße.

Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

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Research

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Biology

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Serie: Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

A Quantitative Assay für Insulin-exprimierenden Koloniebildende Vorläufern

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Forschung

Biologie

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) in der Skelettmuskulatur der Ratte

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through megakaryopoiesis. The final stages of this process are complex and classically involve the bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) and the unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). These populations precede the formation of bona fide megakaryocytes and, as such, their isolation and characterization could allow for the robust and unbiased analysis of megakaryocyte formation. This protocol presents in detail the procedure to collect hematopoietic cells from mouse bone marrow, the enrichment of hematopoietic progenitors through magnetic depletion and finally a cell sorting strategy that yield highly purified MEP and MKp populations. First, bone marrow cells are collected from the femur, the tibia, and also the iliac crest, a bone that contains a high number of hematopoietic progenitors. The use of iliac crest bones drastically increases the total cell number obtained per mouse and thus contributes to a more ethical use of animals. A magnetic lineage depletion was optimized using 450 nm magnetic beads allowing a very efficient cell sorting by flow cytometry. Finally, the protocol presents the labeling and gating strategy for the sorting of the two highly purified megakaryocyte progenitor populations: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) and MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright). This technique is easy to implement and provides enough cellular material to perform i) molecular characterization for a deeper knowledge of their identity and biology, ii) in vitro differentiation assays, that will provide a better understanding of the mechanisms of maturation of megakaryocytes, or iii) in vitro models of interaction with their microenvironment.

This method describes the purification by flow cytometry of MEP and MKp from mice femurs, tibias, and pelvic bones.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Quantitative Analyse der Mitophagie in murinen Pankreas-β-Zellen

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient insulin release. Advanced quantitative assessments of mitophagy often require the use of genetic reporters. The mt-Keima mouse model, which expresses a mitochondria-targeted pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe for quantifying mitophagy via flow cytometry, has been optimized in &#946;-cells. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions can be used to robustly quantify mitophagy. However, using genetic mitophagy reporters can be challenging when working with complex genetic mouse models or difficult-to-transfect cells, such as primary human islets. This protocol describes a novel complementary dye-based method to quantify &#946;-cell mitophagy in primary islets using MtPhagy. MtPhagy is a pH-sensitive, cell-permeable dye that accumulates in the mitochondria and increases its fluorescence intensity when mitochondria are in low pH environments, such as lysosomes during mitophagy. By combining the MtPhagy dye with Fluozin-3-AM, a Zn2+ indicator that selects for &#946;-cells, and Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE) to assess mitochondrial membrane potential, mitophagy flux can be quantified specifically in &#946;-cells via flow cytometry. These two approaches are highly complementary, allowing for flexibility and precision in assessing mitochondrial quality control in numerous &#946;-cell models.

Autor im Rampenlicht: Bewertung des Mitophagieflusses in Pankreas-β-Zellen unter Verwendung effektiver und robuster komplementärer Ansätze 

This protocol outlines two methods for the quantitative analysis of mitophagy in pancreatic &#946;-cells: first, a combination of cell-permeable mitochondria-specific dyes, and second, a genetically encoded mitophagy reporter. These two techniques are complementary and can be deployed based on specific needs, allowing for flexibility and precision in quantitatively addressing mitochondrial quality control.

Komplementäre Ansätze zur Untersuchung des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Quantitative Analyse der mikrobiellen Autoaggregation mittels bildgebender Durchflusszytometrie

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Forschung in der mikrobiellen Autoaggregation mit bildgebender Durchflusszytometrie

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...