Este protocolo permite la identificación y el aislamiento de progenitores eritroides BFU-E y CFU-E directamente de tejido de ratón recién cosechado como médula ósea y bazo. Utilizando esta técnica, podemos aislar poblaciones puras de progenitores eritroides, lo que no era posible con los protocolos de flujo anteriores. Este método mejora en gran medida nuestra capacidad para estudiar modelos de ratón con enfermedad eritroide al permitir el aislamiento de progenitores para muchos experimentos posteriores.
Para comenzar, coloque los fémures y la tibia recién disecados directamente en el tampón de tinción fría o SB-5 y mantenga los tubos en hielo hasta que estén listos para extraer la médula ósea. Coloque un mortero esterilizado limpio sobre hielo en un cubo y transfiera los huesos al mortero. Usando las tijeras de disección, corte aproximadamente 1 milímetro de cada hueso.
Use una jeringa de 3 mililitros equipada con una aguja de calibre 26 que contenga SB-5 para eliminar la médula de los huesos y recogerla en el mortero y repita el proceso de 3 a 5 veces usando tampón nuevo cada vez hasta que los huesos parezcan incoloros. Filtre la médula enjuagada a través de una malla de 100 micrómetros y recoja las células en un tubo de centrífuga de 50 mililitros colocado en hielo. A continuación, use el mortero para aplastar los huesos enjuagados en 5 a 10 mililitros de SB-5.
Filtre la mezcla de huesos triturados y tampare a través del filtro celular de 100 micrómetros para agruparlo con las células recolectadas previamente. Coloque un filtro de malla de 100 micrómetros en un tubo centrífugo vacío de 50 mililitros colocado sobre hielo. Coloque un solo bazo en el filtro de malla y agregue de 0.5 a 1 mililitro de SB-5 al bazo para asegurarse de que no se seque.
Usando el lado de goma de un émbolo de jeringa de 3 o 5 mililitros, machaca el bazo a través de la malla. Agregue más SB-5, 5 mililitros a la vez, y continúe triturando hasta que todas las células se hayan recogido en el tubo. Prepare una suspensión de una sola célula pipeteando hacia arriba y hacia abajo las celdas recolectadas con 2 mililitros de SB-5 usando una punta de orificio grande.
Manche la fluorescencia menos uno o los controles FMO agregando todos los anticuerpos excepto el anticuerpo homónimo del FMO a la suspensión celular en el tubo FACS. Para teñir los controles de un solo color, agregue un solo anticuerpo a la suspensión celular en el tubo FACS. Vortex cada tubo de control durante 2 a 3 segundos a 3000 RPM y luego incubar a 4 grados centígrados balanceándose durante 2.5 horas en la oscuridad.
Después de la incubación, lave las células con SB-5 y enrase el volumen de la suspensión celular a 4 mililitros con SB-5. Gire las células a 900 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados y aspire el sobrenadante. Vuelva a suspender los controles sin teñir y todos los controles de un solo color en 300 microlitros de SB-5 y filtre a través de una malla de filtro de 40 micrómetros en nuevos tubos FACS.
Haga una solución DAPI SB-5 diluyendo el stock DAPI en una proporción de 1 a 10, 000 en SB-5. Vuelva a suspender el FMOS en 1.8 mililitros de DAPI SB-5 y el control de un solo color DAPI en 300 microlitros de DAPI SB-5, luego fíjelos a través de una malla de filtro de 40 micrómetros en nuevos tubos FACS. Después de agregar la mezcla maestra de anticuerpos a cada muestra, haga un vórtice de los tubos durante 2 a 3 segundos a 3000 rpm, seguido de la incubación a 4 grados centígrados en la oscuridad durante 2,5 horas en condiciones de balanceo.
Después de lavar las células como se demostró anteriormente, vuelva a suspender las muestras en 1,8 mililitros de DAPI SB-5 y filtre a través de una malla de filtro de 40 micrómetros en un nuevo tubo FACS y analice las muestras con un cistómetro. Utilice la dispersión directa para eliminar los residuos en función del tamaño y, a continuación, utilice el histograma de altura de dispersión directa frente al área de dispersión directa para excluir agregados de celdas y seleccionar celdas individuales. Repita la exclusión con el histograma de altura de dispersión lateral frente a la altura de dispersión lateral.
Excluya las células muertas eliminando las células positivas para DAPI. Seleccione el linaje negativo TUR uno 19 células negativas kit positivo. Y de estos seleccionamos una subpoblación que expresa CD 55.
Subdividir el linaje negativo TUR uno 19, kit negativo, positivo, células CD 55 positivas en 2 poblaciones principales, P seis y P siete basadas en la expresión de CD 49 F y CD 1 0 5. Ahora basado en la expresión de CD 150 y CD 41, subdivida P 6 en P 3, P 4 y P 5. Del mismo modo, basándose en la expresión de CD 150 y CD 71, subdivida P 7 en BFUE, CFUE temprana y CFUE tardía.
En el presente estudio, se identificaron unidades formadoras de estallidos y colonias a partir de las células de médula ósea y bazo recién cosechadas. Después de 72 horas de eritropoyetina, o inyección de vehículo en los ratones, la estimulación de eritropoyetina mostró expansión de las poblaciones de unidades formadoras de colonias tempranas y tardías P 1 baja y P 1 alta en la médula ósea y las células del bazo cosechadas. La respuesta de los progenitores de médula ósea y bazo a la eritropoyetina in vivo también mostró un mayor número de células en la colonia temprana y tardía formando las poblaciones de unidades P 1 baja y P 1 alta, en comparación con el vehículo control.
Es muy importante generar una suspensión de una sola célula antes de etiquetar las células con anticuerpos. Esto se puede lograr pipeteando hacia arriba y hacia abajo repetidamente e incluyendo EDTA en el búfer. Los progenitores purificados se pueden utilizar para cualquier análisis celular y molecular posterior.
Por ejemplo, transcriptómica de células individuales, atesque, ensayos de colonias y bioquímica. Esta técnica nos ayudó a probar las predicciones de experimentos de RNA-seq de una sola célula.
