1. Preparación <ol><li> Prepare xilazina-ketamina solución (La ketamina es una sustancia controlada. Registros detallados deben mantenerse y las soluciones de almacenarse en un lugar seguro, bajo llave). </li><li> Limpiar y esterilizar el equipo. </li><li> Prepare el área de la cirugía de la limpieza con agente de asepsia y luego cubrir con papel absorbente estéril, y establecer el micromanipulador. </li></ol> 2. Preparación de células para trasplante <ol><li> Las células deben ser resuspendidas a una concentración de 100.000 células / l É y, aunque sólo 250.000 se trasplantan las células por ratón, un exceso de células es necesaria a efectos de carga jeringa (preparar por lo menos 300.000 células por ratón que reciben las células). </li><li> Lavar las células para ser trasplantadas tres veces en HBSS en un frasco cónico de 50 ml. Contar las células antes de que el giro final. </li><li> Después de que el giro final hacia abajo, y dejar decantar HBSS vial en posición invertida para evitar que las gotas lleguen a la bolita. </li><li> Muros de piedra seca en el interior con un irradiados con UV, Kimwipe estéril. No permita que se seque el precipitado. </li><li> Sosteniendo el tubo en posición vertical, poco a poco y con mucha delicadeza resuspender las células en la mitad del volumen final deseado de HBSS. </li><li> Medir el volumen total de pipeteado de la mayoría de la suspensión en una punta de pipeta y luego se ajusta el dial de la pipeta de la suspensión hasta que todo está en la punta de la pipeta. Esto le dirá cuánto más HBSS es necesario para la concentración deseada. </li><li> Aumentar el volumen hasta la cantidad deseada mediante la adición de HBSS. </li><li> Vuelva a colocar en el hielo. Comprobar la viabilidad de las células si debe estar en el hielo durante más de 2 hrs. </li></ol> 3. Preparación de los ratones para la cirugía y el trasplante <ol><li> Anestesiar el ratón por inyección intraperitoneal de ketamina (100mg/kg) y xilazina (10mg/kg) en dosis de 100 l ~ o un equivalente de anestesia. Todo el procedimiento de la preparación quirúrgica para suturar se de 30-40 minutos. </li><li> (Opcional: aplicar numeradas, cinta de color a la cola de cada ratón para asegurar la identificación) </li><li> Afeitar el área dorsal del ratón desde la parte baja del cuello, y se extiende 2 cm bilateral de la línea media, con una maquinilla eléctrica. El pelo se debe cortar lo más cerca posible (puede que sea necesario para revisar el área varias veces). </li><li> Para eliminar el resto del cabello, aplique una fina capa de crema de depilación (Nair), con un aplicador con punta de gasa. </li><li> Después de 1-2 minutos, limpie con una gasa de Nair mojada ligeramente con agua y jabón. El área preparada debe limpiar la piel desnuda, sin ninguna pieza perdida de pelo que podría entrar en la herida durante la intervención quirúrgica posterior. Esterilizar el área preparada con una solución de yodo. </li></ol> 4. Laminectomía <ol><li> Cambian con frecuencia y / o esterilizar los guantes durante todo el procedimiento. Posición de la parte dorsal del ratón con la cabeza apuntando hacia la izquierda (si eres diestro). Coloque los animales para asegurar la esterilidad y que sólo el área afeitada se expone. Haga una incisión vertical (~ 1,3 cm) sobre el sitio laminecomy que van desde unos vértebras torácicas T8 a T12. </li><li> Con las pinzas Graefe en la mano izquierda, sujetar firmemente la columna vertebral en T9 (Figura 1) y levante el ratón hacia arriba para exagerar la curvatura de la columna. </li><li> Usar el bisturí para marcar la unión entre T10 y T11, el espacio entre las dos protuberancias espinosas. Además expone el cruce con cuidado el desguace de la capa muscular para exponer el hueso (ver Figura 1 B, C). </li><li> Use las tijeras para más músculo clara distancia de la lámina y alrededor del pedículo con tijeras pequeñas. Esto abrirá un pequeño espacio entre las vértebras. Lentamente y con delicadeza insertar una hoja de la tijera en esta brecha y cortar el pedículo. Asegúrese de que la curvatura de la tijera siempre se coloca lateralmente, lejos del cordón. Repetir en el otro lado. (Ver Figura 1 D, E) </li><li> Levante la lámina para exponer la médula y con cuidado recortar. Asegúrese de no dejar fragmentos de hueso libre o irregulares atrás. (Ver Figura 1 F) </li><li> Antes de la inyección, limpie la sangre fuera con hisopos de algodón estériles. </li></ol> 5. La inyección de células <ol><li> Coloque la aguja con una aguja tuerca a la jeringa Hamilton y limpiarlas por lavado varias veces con agua, luego de etanol al 70%, y finalmente HBSS. Inserte el émbolo después de cada llenado con agua, etanol al 70%, o HBSS. </li><li> Prepare la jeringa Hamilton para cargar celulares, eliminando el émbolo y aflojar la tuerca de la aguja y tirar de la aguja fuera de la jeringa para evitar la contrapresión. Asegúrese de que el manejo cuidadoso de la aguja y la tuerca se hace con guantes estériles. </li><li> 15μl de células de carga en punta de la pipeta y presione firmemente la punta en la parte de atrás de la jeringa para cargar las células en la jeringa. </li><li> Inserte el émbolo de unos 5 mm y luego apretar la tuerca de la aguja. </li><li> Presione el émbolo de la ONUhasta que alguna de la suspensión celular se ve salir de la aguja. </li><li> Asegúrese de que no haya burbujas en la jeringa y coloque la jeringa en posición horizontal para evitar que las células de hacer un gradiente de gravedad. </li><li> Coge el ratón laminectomized por el músculo dorsal ancho espinales conectan las espinas de T8 y T9 (Figura 2B, C). </li><li> Abrazadera de la pinza en el brazo izquierdo micromanipulador (vertical) de modo que las patas delanteras del ratón están en el aire y sus patas traseras tocando ligeramente una plataforma de toallas de papel estéril como en las Figuras 2A y 2B. </li><li> Conecte la jeringa en el brazo derecho micromanipulador (a un ángulo de 70 °) y deslice la jeringa a la posición más baja posible, antes de sujeción. </li><li> Estabilizar el ratón fijando su cola contra las toallas de papel y baje lentamente la jeringa (Figura 2B). </li><li> Baje la aguja hacia el cordón y la inserción de la aguja de 1 mm en el hemisferio opuesto a través de la línea media dorsal (Fig. 2C). La punta de la aguja debe estar en la materia gris cerca del canal central. </li><li> Inyecte lentamente 2.5μl de las células. Inyectar a un ritmo de 1μl / 5 segundos. Después de inyectar las células, espere unos 10 segundos y retirar la aguja de una décima de vuelta a la vez cada 10 segundos hasta que la aguja está fuera de la médula. Preste atención a la posible emanación de la suspensión celular. </li><li> Rápidamente retirar la jeringa y separarlo del brazo micromanipulador. Coloque la jeringa en posición horizontal. </li><li> Suelte el ratón y la transferencia a la mesa de sutura. </li><li> Repita los pasos 5.7 hasta 5.14 para cada ratón hasta que la jeringa se vacía. Esterilizar las herramientas (en el esterilizador) y la aguja (la limpieza con etanol), entre los animales. Deseche las células y recargar si aglutinación es visible. </li><li> Limpie la jeringa en el paso 5.1 entre las cargas. </li></ol> 6. Puntos de sutura y el cuidado post-operatorio <ol><li> Sutura de la incisión. Aguja de sutura se inserta en la fascia superficial en ambos lados de la incisión. El hilo se encadenan a través de, tirando de la fascia superficial juntos (Figura 3), con lo que cubre la médula espinal expuesta en el sitio de la lámina eliminado. No suturar el músculo cutáneo adheridos a la piel o el músculo esquelético de la espalda. Tirar del hilo a través de toda, dejando aproximadamente 1 / 2 &quot;. Con el porta-agujas, tres nudos se forman y el hilo se corta lo más cerca posible del nudo como sea posible. </li><li> Cerrar la incisión mediante la aplicación de dos-tres grapas (dependiendo del tamaño de la incisión) en la piel (Figura 3B). Tire con cuidado de la piel lejos del ratón para evitar grapado el músculo subyacente. </li><li> El uso de un 26G3 / aguja 8 inyectar 0,5 ml de Ringer lactato por vía subcutánea en la espalda baja lejos de la incisión. </li><li> Lugar del ratón de nuevo en su jaula. Para asegurarse de que es capaz de respirar cómodamente mientras está bajo anestesia, el ratón debe ser colocado en su lado de la jaula, evitando el contacto entre el sitio de la cirugía y camas jaula. Las jaulas deben ser colocados en las compresas calientes. </li><li> Los ratones son monitoreados después de la anestesia desaparezca para asegurar que cese el sangrado, las suturas permanecen cerradas, y que los ratones que volver a la movilidad antes de la cirugía. </li><li> Tratar a los ratones una vez con el analgésico buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg) después de la cirugía. </li><li> Asegúrese de que los ratones con discapacidad tengan acceso suficiente a los alimentos y el agua: botellas de agua están equipados con extenderse 3,5 pulgadas caños y los ratones que no pueden caminar a mano agua que se alimenta y / o alta en calorías, suplementos dietéticos (Nutri-Cal, Tomlyn). </li></ol> 7. Los resultados representativos: Resultados deseados serán identificables por la falta de flujo de salida de la suspensión celular durante la inyección y la aparición intacta de la médula espinal después del procedimiento. Para ello, es vital contar con una iluminación brillante y directo sobre la columna vertebral del ratón durante la laminectomía y durante la inyección. Iluminación óptima se ve facilitada por la iluminación de fibra óptica (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 - laminectomía (A) Una vez vértebra T9 está sólidamente mantenidas con las pinzas de Graefe, (B, C) ​​El puntaje de la columna vertebral con el bisturí entre T10 y T11 para facilitar la entrada de las tijeras de micro.. (D) Retire con cuidado las tijeras micro a través del espacio entre T10 y T11 (flechas y cuadro E), y cortar los pedículos en cada lado (los guiones, E) para liberar a la lámina dorsal. (F) Mueva la lámina hasta rostral y córtala. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. La inyección de NSCs. (A) La configuración general de la micromanipulador con la pinza mantiene el ratón conectado al brazo izquierdo y la jeringa Hamilton en el brazo derecho en un ángulo de 70 años. (B) La pinza hemostática mantener los músculos espinales dorsal conecta la columna vertebral de T8 y T9. (C) La aguja se baja a través de tque la línea media y en la sustancia gris en el hemisferio opuesto, proximal al canal central. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Suturas y cierre de la herida. (A) Las suturas se aplica a la fascia superficial en ambos lados de la incisión. (B) La incisión se cierra con 2-3 grapas según sea necesario (un alimento básico que aparece en una herida que necesitan 3).

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Un trasplante de buena ejecución dependerá principalmente de la laminectomía cuidado y la inyección de las células. El escollo principal para evitar que durante la laminectomía es el daño de la médula espinal. Esto puede ocurrir durante el procedimiento en sí, o por daños causados ​​por los fragmentos de hueso afilados dejado atrás después del procedimiento. Para evitar estos, asegúrese de que los puntos de las tijeras micro curvas son siempre de espaldas a la cuerda y examinar cuidadosamente la columna laminectomized para asegurarse de que todos los fragmentos óseos se borran y que los bordes de la estructura vertebral restantes no han salido o abiertamente irregular. Como se mencionó anteriormente, la detección de flujo de salida será posible si la luz está brillando y directamente en la médula espinal expuesta durante la inyección. Flujo de salida es más probable que ocurra con agujas de calibre 30 (frente al 33 calibre) y si la inyección se hace con demasiada rapidez. Aunque este protocolo nos ha dado buenos resultados, otros han informado de espera más largos períodos (hasta 5 minutos) antes de retractarse de la aguja de inyección después de 8,9. Además, pequeñas agujas de calibre son preferibles, pero hemos observado que algunas células se lisaron con demasiada facilidad cuando pasa a través de agujas de calibre 33. Para maximizar la eficiencia, un equipo de trasplante dotación de las cuatro estaciones diferentes (ratón de preparación, la laminectomía, inyecciones y suturas) es deseable. Además, el calendario para cada procedimiento debe ser optimizado para minimizar el tiempo que las células están esperando en el hielo. Por ejemplo, trasplante de nuestros ratones en grupos de cuatro (el número de dosis en cada carga de la jeringa), la persona inyección de células empieza a cargar la jeringa después de que el ratón ha sido tercero laminectomized y la persona que prepara los ratones debe anestesiar a los siguientes grupo después de que el segundo ratón del grupo anterior se ha laminectomized. De esta manera, se puede trasplantar células (o medios de control) en 40 ratones en alrededor de 3 horas a pesar de que cada ratón se llevará a aproximadamente 30-40 min. Terapias de reemplazo celular para el tratamiento de algunos trastornos del SNC se encuentran actualmente en ensayos clínicos 10. No hay sustituto para los modelos in vivo de la NSC y el trasplante de nuestro protocolo para el injerto de NSCs en la médula espinal de ratones con desmielinización viral inducida facilita el uso de un modelo importante de la EM y también se puede adaptar fácilmente a otros modelos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo / equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> Phoenix Parmaceuticals </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina clorhidrato </td><td> MP Biomedicals </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> Church &amp; Dwight Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10  l Hamilton jeringa w / extraíble aguja </td><td> Hamilton Company </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Agujas Hamilton, 30G o 33 G, de ½ pulgada, 30 ° de bisel </td><td> Hamilton Company </td><td> 7803-077803-05 </td><td> Probar la viabilidad de las células después de la aprobación a través de agujas para identificar el mejor indicador de uso </td></tr><tr><td> Micro Tijeras </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> Unas pequeñas pinzas Graefe </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> Kopf Instruments </td><td> Modelo 1772 Soporte universal </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> Kopf Instruments </td><td> Modelo 1773 Portaelectrodos </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> Kopf Instruments </td><td> Modelo 902 estereotáxica de pequeños animales </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> Kopf Instruments </td><td> Modelo 960 portadora electrodo izquierdo </td><td></td></tr><tr><td> Suturas </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer lactato </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> Grapas </td><td> Ciencia fina </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Hemostático </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> Escalpelos, tamaños 10,11 </td><td> Pescador </td><td> 268878, 268879 </td><td></td></tr><tr><td> Suturas </td><td> ETHICON * </td><td> 1676G </td><td> tamaño de 5-0, 3 / 8 &quot;círculo de agujas de 19 mm, 45 cm hilo trenzado </td></tr><tr><td> Reflejo de la herida 7 aplicador de clip de </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7mm clips herida Reflex </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Olsen-Hegar porta-agujas </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus

Los ratones infectados con la cepa JHM neurotrópico del virus de la hepatitis del ratón (MHV) desarrollar los resultados patológicos y clínicos similares a los pacientes con la enfermedad desmielinizante Esclerosis Múltiple (EM). Hemos demostrado que el trasplante de NSCs en la médula espinal de los resultados de los ratones enfermos en una mejora significativa tanto en la remielinización y en los resultados clínicos. Terapias de reemplazo celular para el tratamiento de las enfermedades crónicas neurológicas son ya una realidad y en modelos in vivo son de vital importancia en la comprensión de las interacciones entre las células injertadas y el microambiente del tejido huésped. Esta presentación ofrece un método adecuado para el trasplante de células en la médula espinal de ratones infectados JHMV. En resumen, ofrecemos un procedimiento para i) la preparación de NSCs antes del trasplante, ii) pre-operatorio de atención de los ratones, iii) la exposición de la médula espinal a través de una laminectomía, iv) la inyección estereotáxica de NSCs, y iv) los cuidados postoperatorios .

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Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

El trasplante de células madre neurales (NSC) en la médula espinal de ratones con desmielinización establecido se detalla. La preparación de los comités directivos nacionales, la laminectomía de vértebra torácica 9 (T9), y el trasplante de NSCs se perfila, junto con la atención pre y post-operatorio de los ratones.

El trasplante quirúrgico de células madre neurales en la médula espinal de los ratones infectados con el virus neurotrópico Hepatitis Ratón

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

surgical-transplantation-mouse-neural-stem-cells-into-spinal-cords

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K vistas.  University of California, Irvine. El trasplante de células madre neurales (NSC) en la médula espinal de ratones con desmielinización establecido se detalla. La preparación de los comités directivos nacionales, la laminectomía de vértebra torácica 9 (T9), y el trasplante de NSCs se perfila, junto con la atención pre y post-operatorio de los ratones.

Video: Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

El aislamiento y la expansión de las células troncales nerviosas de ratones adultos mediante el ensayo de neuroesfera

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Investigación

Neurociencias

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Un ratón, dos culturas: Aislamiento y cultivo de adultos Neural las células madre de las dos zonas neurogénicos de ratones individuales

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Aislamiento y cultivo de células madre adultas neural de la Zona subcallosal Ratón

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Desarrollo de un protocolo de refinado para Trans-escleral transplante Subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano humano a ojos de rata

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Diferenciación de células madre embrionarias de ratón en precursores corticales interneurona

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Homochronic trasplante de precursores de interneurona en cerebros de ratón Postnatal temprana

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Aislamiento y cultivo de las células madre neurales embrionarias de ratón

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Trasplante de progenitores interneuronas corticales de ingeniería química en cerebros de ratón postnatal temprano

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

La detección de 5-Hidroximetilcitosina en células madre neuronales y cerebros de ratones

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...