El objetivo general del protocolo es generar un modelo de ratón humanizado con sistema inmune humano funcional e hígado utilizando células madre hematopoyéticas humanas y sitio de hepato. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en ratones humanizados en hígado genético. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar la inmunopatología causada por el VIH como se observa en las personas.
Demostrando el proceso será a través de Yimin Sun, un supervisor del departamento de patología y microbiología, junto con Weimin Wang y Edwrd Makarov, tecnólogo de investigación. Para comenzar, transfiera la sangre del cordón umbilical recolectada en tubos heparinizados a un armario de flujo laminar estéril. Agregue PBS hasta que el volumen aumente a 35 mililitros.
Capa de la muestra en la parte superior del medio de separación de linfocitos y centrifugarlo 400 veces G y a cuatro grados centígrados durante 35 minutos sin pausas. A continuación, retire cuidadosamente la capa de plasma superior y utilice una pipeta de transferencia para transferir la interfaz de capa de color blanco a un tubo nuevo. Vuelva a suspender la capa buffy en 30 a 40 mililitros de tampón de frío helado.
Con una pipeta, combine 20 microlitros de la suspensión celular con 20 microlitros de 0,4% azul tripano. Pipetear 10 microlitros de esta mezcla en la abertura exterior de cualquiera de las dos cámaras de un portaobjetos, e insertar la diapositiva en un contador de celdas automatizado para contar las células. Centrifugar las células a 300 veces G y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y añadir 300 microlitros de tampón de frío helado. Añadir 100 microlitros de reactivo de bloqueo de receptores FC humanos y 100 microlitros de microcáuticos monoclonales de ratón monoclonal antihumanos CD34 anticuerpo conjugados MicroBeads para hasta 100 millones de células. Incubar durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Agregue 10 mililitros de tampón de frío helado para lavar las células y centrifugarlo 300 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de frío helado. Después de esto, coloque una columna LS de selección positiva en el campo de clasificación de celdas activadas magnéticas y páselo con tres mililitros de búfer de frío helado.
Cargue la muestra en la columna LS que puede atrapar MicroBeads unidos a células positivas CD34 humanas en muestras, y permita que fluya bajo la influencia de la gravedad en el tubo de recolección. Lave la columna tres veces con un tampón frío y recoja el eluyente en el mismo tubo de recogida. A continuación, sumerja la columna con cinco mililitros de búfer de frío helado para aludir a las células positivas CD34 en un nuevo tubo de recolección.
Repita el procedimiento para lograr una pureza de más del 90%Siguiente, utilice un tinte azul trypan y un hemociclomekómetro para contar las células positivas CD34 eludidas. Después de contar, centrifugar las células a 300 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 125 microlitros de PBS para una inyección que se utilizará inmediatamente en el trasplante.
Para comprobar la pureza del eluyente positivo CD34, tome 50 microlitros de la suspensión e incubarlo con 10 microlitros de anticuerpos CD34 anhumanos conjugados con PE a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Después de esto, lave y vuelva a suspender las células en PBS y proceda a realizar la citometría de flujo. Después de la adquisición, analice los datos como se describe en el protocolo de texto.
En primer lugar, recupere y descongele los hepatocitos crioconservados como se describe en el protocolo de texto. A continuación, retire la tapa biológica y vierta los hepatocitos descongelados en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga un medio de descongelación calentado. Mece el tubo a mano durante unos segundos para suspender las células.
Pele las células a 100 veces G y a temperatura ambiente durante ocho minutos. Lavar las células peletadas en PBS con 0.1%BSA y agruparlas con HSPC frescos o descongelados en PBS a un volumen final de 80 microlitros por ratón. En primer lugar, conecte un extremo de un tubo de extensión estéril a una aguja de calibre 30 y el otro extremo a una jeringa de un mililitro.
Llene la jeringa con la suspensión de HEP y HSPC agrupados. Coloque la jeringa en la muesca de una pipeta dispensadora repetitiva y ajuste el dispensador para dispensar 10 microlitros en cada prensa. Afeitar cada ratón como se describe en el protocolo de texto y frotar el lado izquierdo del cuerpo de cada ratón con 10%yodo povidona seguido 70%alcohol isopropílico.
Usando tijeras tipo Vannas, haz una pequeña incisión en la piel, el músculo y el peritoneo a la izquierda de la pared peritoneal para entrar en la cavidad peritoneal aproximadamente 5 milímetros por debajo del borde inferior de la caja torácica. Localice el bazo y utilice fórceps para tirar ligeramente del área de operación para facilitar el acceso e inserte la aguja del calibre 30 en el polo inferior del bazo. A continuación, desbloquee el émbolo de la pipeta dispensadora y dispense 10 microlitros del volumen a la vez, con un límite de 60 a 80 microlitros por bazo.
Retirar la aguja lentamente y sujetar el bazo con clips de ligadura utilizando un aplicador de ligadura. Luego, usa aplicadores con punta de algodón humedecidos con PBS estéril para empujar el bazo de nuevo a la cavidad del cuerpo. Utilice un patrón de sutura interrumpido para cerrar la capa muscular de la pared abdominal.
Lograr el cierre de la piel con un patrón de sutura interrumpido utilizando suturas no absorbibles. Transfiera todos los materiales necesarios a una instalación designada de Nivel Dos Plus de Bioseguridad. Use equipo de protección personal que incluya una cubierta desechable, todas las batas, fundas de zapatos, una máscara facial y guantes dobles, incluidos guantes resistentes a cortes, en todo momento mientras trabaja con el virus.
Seleccione ratones con una reconstitución de más del 15% de las células positivas de CD45 humanas y con presencia de albúmina humana en el suero para la infección por VIH-1. Inyecte intraperitonealmente a los ratones de 1.000 a 10.000 dosis infecciosas de cultivo tisular de 50 ADA VIH-1 en un volumen de 100 a 200 microlitros por ratón. Después de eutanasiar los ratones, exclímese el hígado de cada ratón como se describe en el protocolo de texto.
Recoger y fijar los hígados en 4%paraformaldehído durante la noche. El establecimiento de un modelo de ratón humanizado dual con hígado humano y células inmunitarias se puede controlar fácilmente en cada paso con ELIZA muy simple y citometría de flujo, respectivamente. La citometría de flujo se realiza regularmente para evaluar el desarrollo de un sistema inmunitario funcional y para ver el efecto de la infección por VIH en las células inmunitarias.
En ratones humanizados duales, el desarrollo de células inmunitarias funcionales puede variar del 15 al 90% de la puerta de linfocitos. Para la evaluación del injerto de hepatocitos humanos, ELIZA para los niveles de albúmina específicos para humanos se realiza mensualmente en el suero del ratón. Los ratones injertados con HSPC y HEPs muestran niveles de albúmina específicos para humanos que van desde aproximadamente siete microgramos por mililitro a 377 microgramos por mililitro a un mes, continuando creciendo en el tiempo de observación.
El efecto de la infección por VIH en las células inmunitarias humanas en la sangre de ratones humanizados duales es monitoreado por citometría de flujo y sobre HEP en el hígado por albúmina específica para humanos ELIZA. A las cinco semanas, el VIH-1 causa una disminución en los niveles de albúmina humana en el suero y hay un agotamiento de los hepatocitos positivos CK18 humanos en las secciones hepáticas de ratones humanizados duales. Una menor proporción de CD4 a CD8 se observa típicamente en la sangre y el hígado de ratones infectados por el VIH, en comparación con los niveles observados en el mismo ratón antes de la infección.
La sangre debe colocarse cuidadosamente en capas sobre el medio de separación de linfocitos para los aislamientos de la capa de color. Para la cirugía, sostenga suavemente el bazo e inserte la aguja en el polo inferior del bazo. Tras el aislamiento de las células madre hematopoyéticas, es crucial comprobar la pureza de las células madre hematopoyéticas positivas CD34 para evitar células positivas CD3 e inyecciones agudas de hepatocito de diferentes donantes.
Como los ratones humanizados muestran el aspecto fisiológico del sistema inmunitario humano y el hígado, los ratones desarrollados podrían ser utilizados para estudiar la fisiopatogénesis del VIH y las infecciones físicas y cirrosis.
