Investigación en el laboratorio de los autores con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R37-HL041026, R01 y R01-HL086483 HL056786 (SSS) y F32-HL097463 y T32 AR048523 (PB) del Servicio de Salud Pública de Estados Unidos.

1. Cuidado de los Animales y el empleo Después de la revisión y aprobación del Cuidado de Animales institucional y el empleo, los ratones machos de al menos 12 semanas de edad se utilizan. Un ratón es anestesiados con pentobarbital sódico (60 mg / kg) vía intraperitoneal (ip). A lo largo de los procedimientos quirúrgicos y protocolos experimentales, la anestesia se mantiene con los suplementos (10-20% de la inyección inicial, ip), según sea necesario (cada 30-60 minutos, se indica por la respuesta de la retirada a los pies o pellizcar la cola). Después de la terminación del procedimiento experimental el ratón es una sobredosis con pentobarbital (ip) y sacrificados por dislocación cervical. 2. Micropipetas y Microiontophoresis <ol><li> Micropipetas Microiontophoresis (diámetro de la punta interna ~ 1 m) se preparan a partir de tubos de vidrio borosilicato capilar mediante un extractor de pipeta horizontal. La nuestra tiene un ~ 5 mm para una rigidez cónica; ya se estrecha son más flexibles. </li><li> Micropipetas se rellena con 1M ACh (Figure1A-C) disueltos en 18,2 mW agua. Para el relleno, un tubo capilar se conecta a 0,2 micras filtro acoplado a una jeringa que contiene el agonista de interés (Figura 1). Estas pueden ser fácilmente fabricados (abajo) o comprados a proveedores comerciales. El tubo capilar se introduce en la parte final de la solución micropipeta y ACh se entrega en la luz mientras se retira el tubo capilar se llena como la micropipeta. La celebración de la micropipeta con punta hacia abajo, las burbujas de aire agitando suavemente la micropipeta. </li><li> La micropipeta se fija en un soporte montado en un micromanipulador (Figura 2). El titular tiene un alambre de plata de conectar la solución de ACh en la micropipeta a un pin externo, que a su vez está conectado al terminal positivo de un programador microiontophoresis. Un hilo de plata segundo asegurado en el borde de la preparación del tejido está conectado a la terminal negativa para completar el circuito como la punta de la micropipeta se avanza en la solución salina fisiológica sobre la preparación. </li><li> Una corriente de retención se aplica para evitar la vasodilatación (o la respuesta fluorescente) cuando la punta de la micropipeta se coloca junto a la pared de las arteriolas. Retención actual variará con el tamaño de la punta de la micropipeta (diámetro interno = 1 m) y la concentración de agonista, pero es altamente reproducible para los parámetros definidos (se utiliza ~ 200 nA para 1M ACh, una punta de micras). La corriente de retención deja coincidiendo con la entrega de eyección actual a través del disparador electrónico (Figura 1) sincronizado con el inicio de la adquisición de la imagen. </li></ol> 3. Micromanipulación <ol><li> Una plataforma personalizada para un platina del microscopio XY fue fabricado en acero inoxidable ferromagnético. Dimensiones de la plataforma (1 / 8 &quot;X 12&quot; X 13 &quot;) permitirá el espacio suficiente para micromanipuladores posición en torno a la preparación experimental Micromanipuladores deseada (Figura 2A). Asegurado a las bases magnética (Figura 2B) permiten una colocación según lo dictado por la preparación. Estos son coloca directamente sobre la plataforma fabricada en torno a la preparación para micropipetas posicionamiento en los sitios de interés (Figura 2C). </li></ol> 4. Resultados representante <ol><li> Con la punta de la micropipeta posición adyacente a una arteriola, no hay respuesta de fluorescencia de ACh (retención actual de ajustadas para evitar fugas de ACh). Por debajo de un umbral de estímulo no hubo ningún efecto. Sin embargo, como aumento de la intensidad del estímulo, la fluorescencia de células endoteliales de calcio mayor a través de distancias cada vez mayores a lo largo de la arteriola, al igual que la intensidad de fluorescencia en el sitio de estimulación (Figura 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Método de Relleno pipetas Microiontophoresis. A) Un tubo capilar (flecha verde) se fija en un conector de compresión (flecha azul) unido a un filtro de 0,2 micras (flecha morada), que luego se fija a una jeringa llena de 1M ACh. B) El tubo capilar se introduce en la pipeta microiontophoresis a través de la parte de atrás y la solución se desplaza a llenar la luz de la micropipeta. C) Una vez que la pipeta se llena, mantenga la punta hacia abajo y dé golpecitos encima de la vela para eliminar las burbujas (flecha negro). <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Plataforma personalizada para la colocación de micromanipulador. .. A) una plataforma de acero inoxidable ferromagnético se coloca sobre una base del microscopio contiene una costumbre MVX10 XY traslación B) Circular bases magnética colocada en la parte inferior del compacto de 3 ejes micromanipuladores C) Micromanipuladores colocados alrededor de la preparación experimental (ver protocolo asociado: ID JoVe # 2874) para estudiar los sitios específicos de interés. Latamaño compacto y la versatilidad ir micropipetas permiten múltiples para ser utilizados simultáneamente. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Fluorescencia de calcio en arteriolas. Fluorescencia de calcio de las células endoteliales que recubren la pared arteriolar aumenta con la intensidad del estímulo. Los primeros tres paneles que se muestran imágenes de fluorescencia de las respuestas a A) 250 nA, B) 500 nA y C) 1000 eyección nA de corriente (los 500 ms duración del pulso). La distancia a la que la fluorescencia de células endoteliales de calcio aumento se indica con corchetes en el AC (~ 130, 270 y 400 micras, respectivamente). La línea de referencia a través de la arteriola en cada panel indica que las respuestas de fluorescencia (F / Fo) a ACh se registraron en el sitio de estimulación. D) Las grabaciones de F / Fo tiempo frente a los estímulos para aumentar la ACh. Como eyección corriente aumentó, F / Fo aumento en la amplitud y la duración. Tenga en cuenta que 100 nA estímulo estaba por debajo del umbral y no tuvo ningún efecto. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900sup1.jpg" alt="Complementaria la figura 1" /> Complementaria la figura 1. Diagrama del circuito de disparador electrónico. Este circuito está conectado con un puerto paralelo de un ordenador personal. Cuando se activa proporciona un constante pulso TTL de 5V. El chip 7805 es un regulador de voltaje 5V conectada a una fuente de alimentación de 9-12V DC (una batería de voltaje adecuado está bien). La salida de la 7805 proporciona energía al interruptor bilateral Quad y la salida del circuito. De entrada a través de la resistencia de 1K es desde el ordenador.

<ol>
	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+(Rat+Cremaster).">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. 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C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li><li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+arteriolar,+regional,+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle.">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+Role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li><li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels.">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li></ol>

Todos los procedimientos y protocolos con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo de la Universidad de Missouri y realizado de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La producción de este artículo fue patrocinado por Stanford Fotónica.

El protocolo aquí descrito muestra los métodos de preparación y ejecución de micropipetas para microiontophoresis. La entrega de la acetilcolina se usa para ilustrar la señalización del calcio subyacente vasodilatación dependiente del endotelio en las arteriolas del ratón anestesiado. Nuestros resultados muestran que la distancia a la que la ACh aumenta la fluorescencia de las células endoteliales aumenta el calcio con la intensidad de la corriente de expulsión de la micropipeta microiontophoresis (Figura 3). La falta de incremento de fluorescencia en condiciones de reposo indica una fuga insignificante de ACh de la micropipeta. La falta de respuesta a la intensidad del estímulo 100 nA (Figura 3, la leyenda) pone de manifiesto que un umbral de intensidad de la estimulación es necesaria para el calcio de las células endoteliales a aumentar. Estas técnicas se pueden adaptar fácilmente a otros agentes vasoactivos y la preparación del tejido. Consideraciones prácticas: En el trabajo con microiontophoresis para estudiar la reactividad arteriolar, varias cosas deben ser reconocidos. Aunque ha sido difícil determinar la concentración real del agonista entrega, estímulo-respuesta curvas son reproducibles dentro y entre los preparativos. Estas se pueden realizar mediante la celebración de la duración del pulso constante (por ejemplo, 500 ms) y la variación de la expulsión de corriente (por ejemplo, 250, 500 y 1000 nA; Figura 3). Por otra parte, la expulsión de corriente puede mantenerse constante (por ejemplo, 500 nA) y la duración de pulso variable (por ejemplo, 250, 500 y 1000 ms). Para una referencia a las acciones de una concentración de agonista definido, la preparación puede ser superfused con la solución apropiada 5. Debido a que la fuerza impulsora para la eyección de soluto es el movimiento de carga eléctrica, el agente a entregar debe llevar a un cargo neto a ser desplazados de la micropipeta. Para asegurarse de que el agente de interés es el portador de la carga principal, se disuelve en alta concentración (por ejemplo, 1 M de ACh) para minimizar el electro-osmosis. Cuando se requiere la manipulación del pH de la solución de llenado micropipeta, los controles del vehículo necesarios para determinar los efectos no específicos. Los controles adecuados también se debe realizar para el paso de la corriente solo (por ejemplo, utilizando pipetas llenas de solución salina isotónica). La distancia efectiva de difusión del agente de su lugar de liberación debe ser comprobado y es más fácil determinar empíricamente por la desaparición de una respuesta fisiológica (por ejemplo, la vasodilatación o un aumento del calcio intracelular en la expulsión de ACh) como la micropipeta se coloca en define las distancias desde el sitio de destino. En la práctica, la distancia de difusión efectiva está muy influenciada por la forma en la punta de la micropipeta se coloca en el tejido, por ejemplo, si presiona la punta en el tejido y su punta se halla cerrado, que la eyección está alterada. Excesivo del tejido conectivo es particularmente problemático y debe ser removido de la superficie del tejido durante la preparación quirúrgica. También debe prestarse atención a la posibilidad de agotar la punta del agente designado. Esto se reduce al mínimo por medio de pulsos relativamente cortos (por ejemplo, ≤ 1 s). Con las corrientes sostenida (por ejemplo, varios segundos), el agonista puede ser expulsado de la punta más rápido de lo que puede ser sustituida por la difusión de la solución de llenado a granel en la micropipeta. Porque el volumen insignificante se desplaza con microiontophoresis, si uno está tratando de cambiar el medio iónico local (por ejemplo, para ofrecer una K despolarizante estímulo +), esto no puede ser efectivamente logrado con microiontophoresis pero se logra fácilmente con presión de eyección de líquido a granel de la deseada composición. Para la estimulación local de una arteriola, puntas de micropipeta con un diámetro interno de 3.2 micras trabajar bien con la presión de eyección 4-5 psi (28 a 35 kPa) y la duración del pulso (por ejemplo, 1 segundo), controlada con una válvula de solenoide 10. Cuando la entrega sostenida de un agente de una micropipeta en un microvasos es necesario, la expulsión de la presión se prefiere utilizar pipetas de diámetro apropiado punta internos (por ejemplo, ~ 10 mm) 11,12. Una columna hidrostática de altura conocida con una válvula de llave de paso ofrece un barato y bien definido en / de la cabeza de presión constante. Los caudales están determinados por el diámetro interior de la punta de la pipeta y la presión de la conducción. Como siempre, los controles del vehículo son esenciales para excluir las acciones no específicas de expulsión a presión.

<table><tbody><tr><td> Material utilizado </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Borosilicato tubos capilares </td><td> Warner Instrumentos </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> Extractor horizontal con una pipeta </td><td> Sutter Instrumentos </td><td> modelo P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Acetilcolina cloruro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6625 </td><td></td></tr><tr><td> adaptador para Luer centro </td><td> Martech </td><td> AC1343 </td><td> Para asegurar la tubería microcapilar </td></tr><tr><td> 0,2 m de nylon Titan filtro </td><td> Dom Sri </td><td> 42204-NN </td><td> Bajo volumen de retención para minimizar la pérdida </td></tr><tr><td> 5 ml jeringa </td><td> Becton-Dickinson Co. </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta titular </td><td> Warner Instrumentos </td><td> E45W-M12VH </td><td></td></tr><tr><td> Alambre de plata </td><td> Warner Instrumentos </td><td> AG10W </td><td> Diámetro de 0,25 mm </td></tr><tr><td> 3-ejes micromanipulador </td><td> Siskiyou diseñar instrumentos </td><td> DT3-100, MXB, MXC, MGB / 8 </td><td> Componentes de manipulador, como se muestra </td></tr><tr><td> microiontophoresis actual programador </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> Modelo 260 </td><td></td></tr><tr><td> dispositivo de disparo </td><td> Costumbre </td><td> costumbre </td><td> circuito dispuesto en el Supl. Figura 1 </td></tr><tr><td> placas de acero inoxidable </td><td> McMaster-Carr </td><td> 1 / 8 &quot;X 12&quot; X 12 &quot; </td><td> De acuerdo con el diseño </td></tr><tr><td> La intensificación de la cámara digital </td><td> Stanford Fotónica Inc </td><td> XR/Mega-10 </td><td> Integrado con el software de control de Piper </td></tr></tbody></table>

microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation

Microiontophoresis implica el paso de corriente a través de una punta de la micropipeta para ofrecer un soluto en un lugar designado dentro de una preparación experimental. Microiontophoresis puede simular una transmisión sináptica mediante la entrega de los neurotransmisores y los neuropéptidos en las neuronas de forma reproducible 2. Volumen insignificante (líquido) de desplazamiento evita la perturbación mecánica en la preparación experimental. La adaptación de estas técnicas en la microcirculación 3 ha permitido a los mecanismos de la vasodilatación y la vasoconstricción a estudiar a nivel microscópico in vivo 4,5. Una ventaja clave de distribución localizada como está permitiendo a las respuestas vasomotoras a estudiar en los lugares definidos dentro de una red microvascular sin evocar los cambios sistémicos o reflexiva de la presión arterial y el flujo sanguíneo del tejido, lo que revela las propiedades intrínsecas de los microvasos. Una limitación de microiontophoresis es que la concentración del agente entregado en el lugar de interés es difícil de determinar 6. Sin embargo, su liberación de la punta de la micropipeta es proporcional a la intensidad y duración de la expulsión actual 2,7, de modo que reproducir las relaciones de estímulo-respuesta se puede determinar fácilmente en condiciones experimentales definidas (descrito más adelante). Los factores adicionales que afectan la entrega microiontophoretic incluyen la concentración de solutos y la ionización en la solución. El diámetro interior de la punta de la micropipeta debe ser aproximadamente 1 mo menos para minimizar difusional &#39;fuga&#39;, que puede ser contrarrestada con una corriente de retención. Así, una externa (positivo) actual se utiliza para expulsar una educación y una corriente negativa utilizado para mantener dentro de la micropipeta. Fabricación de micropipetas se facilita con sofisticados extractores electrónicos 8. Micropipetas se tiran de los tubos capilares de vidrio que contiene un filamento que la solución de &quot;mechas&quot; en la punta de la micropipeta cuando se llena de la parte de atrás (&quot;rellenadas&quot;). Esto se realiza mediante la inserción de un tubo capilar conectado a una jeringa que contiene la solución de los intereses y la solución de la expulsión en el lumen de la micropipeta. Micromanipuladores permiten la colocación deseada de micropipetas en la preparación experimental. Micromanipulador montados sobre una base móvil se puede colocar alrededor de la preparación de acuerdo a la topografía de las redes microvasculares (desarrollado más adelante). El presente protocolo demuestra microiontophoresis de la acetilcolina (ACh + Cl -) en una arteriola de la preparación del músculo cremáster de ratón (ver protocolo asociado: ID JoVe # 2874) para producir vasodilatación dependiente del endotelio. Entrega de estímulos se sincroniza con la adquisición de imágenes digitalizadas mediante un disparador electrónico. El uso de Cx40 BAC-GCaMP2 9 ratones transgénicos permite la visualización de las respuestas de calcio intracelular subyacente vasodilatación arteriolar en las células endoteliales de la microcirculación de vida.

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Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis implica movimiento de los iones a partir de una micropipeta en respuesta a una diferencia de potencial eléctrico entre el interior y el exterior de la micropipeta. Moléculas biológicamente activas así son liberados en proporción a la corriente eléctrica. Nos ilustran microiontophoresis acetilcolina en conjunto con micromanipulación para estudiar vasodilatación dependiente del endotelio en la microcirculación.

Microiontophoresis y micromanipulación de imagen intravital de fluorescencia de la microcirculación

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

microiontophoresis-micromanipulation-for-intravital-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K vistas.  University of Missouri. Microiontophoresis implica movimiento de los iones a partir de una micropipeta en respuesta a una diferencia de potencial eléctrico entre el interior y el exterior de la micropipeta. Moléculas biológicamente activas así son liberados en proporción a la corriente eléctrica. Nos ilustran microiontophoresis acetilcolina en conjunto con micromanipulación para estudiar vasodilatación dependiente del endotelio en la microcirculación.

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Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

La normalización nació para tomografía de fluorescencia de proyección óptica de imágenes de todo corazón

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Investigación

Biología

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

El ratón Cremaster preparación muscular for Imaging intravital de la microcirculación

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de Imágenes

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Imágenes de fluorescencia con un nanómetros Precisión (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Técnicas de micromanipulación que permite el análisis de las dinámicas morfogenéticas y facturación de los reguladores citoesqueléticos

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Aislamiento y la proyección de imagen de fluorescencia para la reconstrucción de la solo-partícula de Chlamydomonas centriolos

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...