Nos gustaría agradecer a BK agosto en la Universidad de Wisconsin-Madison Fondo microscopio electrónico para la microscopía electrónica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01-DA026067 y P30 HD03352 (a JSM).

1. Preparativos 4.1 <ol><li> Preparar 500 mL de tampón de gradiente medio (GM) al mezclar 50 ml de una suspensión de sacarosa 2,5 M, 2,5 ml de 1M Tris-HCl, pH 7,5 acciones, y 0,1 mL de EDTA 0,5 M, pH 8,0 con valores de mili- Q agua a volumen. Filtro de esterilización de la solución, alícuota y almacenar congelado. </li><li> Preparar un stock de 1.000 veces la tetrodotoxina (TTX), haciendo una solución 1 mM en mili-Q H 2 O. Alícuotas de TTX se pueden almacenar a -20 ° C. </li><li> Prepare el buffer de la estimulación de 10x por lo que una solución de 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO 3, y 800 mM de NaCl en agua milli-Q. De archivo se pueden almacenar a 4 ° C. </li><li> Pre-enfriar centrifugadoras a 4 ° C. </li><li> Prepare una solución madre de Percoll isotónico (SIP) mediante la adición de 9 volúmenes de Percoll (18 ml) a un volumen de 2,5 M de sacarosa (2 ml) en agua milli-Q y mezclar bien. </li><li> Prepare el 3, 10, 15 y 23% mediante la adición de capas de gradiente de las cantidades respectivas de la SIP a GM de amortiguación y de mezcla de cada uno: </li></ol><img alt="Tabla 0" src="/files/ftp_upload/3196/3196table0.jpg" /><ol start="7"><li> Vierta capas de gradiente con pipeta 2 ml cada uno de los 23, 15, 10, y un 3% las soluciones de Percoll isotónico en los tubos de centrífuga Beckman con tapas con un P1000 Gilson Pipetman. La interfaz entre las capas deben ser claramente visibles sin que se mezclen las capas. Tienda de los gradientes a 4 ° C durante al menos 20 minutos antes de su uso. Los gradientes se pueden almacenar hasta 24 horas, aunque el uso mismo día se recomienda. [Personal sin experiencia práctica de laboratorio pueden preparar mediante la adición de los gradientes de tinte azul para el isomotic soluciones de Percoll para la visualización de las interfaces de capa.] </li></ol> 2. Ratón una disección <ol><li> Asegúrese de que todos los cría del ratón y la eutanasia procedimientos se realizan de acuerdo con las directrices de los NIH y la Universidad. La eutanasia a los cachorros (edad P13 a P21) por asfixia de dióxido de carbono o por un método aprobado en el protocolo de los animales. </li><li> Pin con el ratón a una tabla de disección y rociar la parte posterior del cuello y la cabeza con etanol. Usando unas tijeras afiladas cortar a través de la médula espinal en la base del cráneo, quitar la piel de la parte superior del cráneo, corte lateral del cráneo entre el hueso parietal y hueso interparietal o entre el cerebro y las regiones de la corteza. A continuación, cortar el cráneo desde la base hasta la nariz (a lo largo de la sutura sagital), retirar con cuidado el hueso parietal suave tirando de cada hemisferio a un lado y quitar la corteza con una espátula. Inserte la espátula en el cerebro por encima del cerebelo y luego saca la corteza y lo coloca en tampón helado GM. Proceder de inmediato a la etapa de homogeneización. No deje que la corteza se sientan en tampón helado por mucho tiempo ya que esto afectará negativamente a la formación de los ganglios centinela. </li></ol> 3. Preparación de homogeneizado y el SNS 4.1 <ol><li> Enjuague las cortezas de helado de amortiguación de GM y la transferencia de dos cortezas de un vaso Dounce homogeneizadora que contiene 5 ml de tampón enfriado GM. </li><li> Homogeneizado con cuidado la corteza con movimientos 5-10 de la mano del mortero suelto (maja &quot;A&quot;), seguido por los golpes de la mano del mortero 5.10 ajustado (mortero &quot;B&quot;). Movimientos deben ser rápidos, pero lo suficientemente lento como para no provocar burbujas de aire. Una imagen de la homogeneizado después de la homogeneización es en el esquema 1. El número de golpes pueden variar depende de la persona homogeneizador y manos que acompañan. Cuando termine los gradientes debe dar una fuerte banda de SN, en caso contrario, ajustar el número de golpes. </li><li> Transferir el homogeneizado a una cónica de 15 ml y centrifugar a 1000xg durante 10 min a 4 ° C en un rotor basculante (Allegra 6KR centrífuga) para sedimentar los desechos celulares y los núcleos. Una imagen de la homogeneizado hilar es en el esquema 1. </li><li> Capa de 2 ml del sobrenadante por gradiente de Percoll-sacarosa, la tapa de los tubos, y se centrifuga a 32.500 xg durante 5 min a 4 ° C en un rotor de ángulo fijo (Beckman J2-21 centrifugadoras, JA-17 rotor) con los adaptadores adecuados ( Ver Tabla Reactivos y Equipos). </li><li> Pipeta y deseche la solución por encima de la banda de SN con una pipeta Pasteur de vidrio. Pipeta de la banda de SN en la interfaz% 15/23, traslado a una cónica y almacenar en el hielo. Cada gradiente o la corteza produce un 0,9-1,1 ml de SN. </li><li> Ajustar la concentración de sal en el SNS mediante la adición de una décima parte del volumen de tampón de estimulación 10x, 1000x añadir CaCl2 a una concentración final de 12 nM, y añadir 1 mM de archivo TTX a una concentración final de 1 M para suprimir la excitación inespecífica. (La adición de CaCl 2 es opcional si se va a interferir con posteriores aplicaciones de SN). </li><li> Determinar la concentración de proteínas del SNS con el Micro BCA Protein Kit de ensayo. (El ensayo de proteínas Bradford no se recomienda debido a la inferencia de la Percoll.) </li><li> SNS puede ser utilizado directamente y con rapidez para la proteína traducciónción los estudios. Para otras aplicaciones SN lisado puede ser limpiado o se concentra con el Pierce SDS-PAGE de muestras Kit de preparación. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Cuando el ratón corteza se homogeneizó y se separó en sacarosa discontinua de Percoll-gradientes (Esquema 1), 6 bandas o fracciones se observaron (Figura 1). Se ha demostrado previamente para la corteza cerebral de rata 3,5 que los componentes de las bandas de alto peso molecular se rompe la membrana y de la mielina y que el material granulado contiene mitocondrias u orgánulos (Tabla 1). El 23% / 15% de la interfaz (banda 5) que figuran el SNS enriquecido. La banda en el 23% / 15% de la interfaz, que contiene SN intacto, se extrae y se examina por microscopía electrónica (EM) como se describió anteriormente. 2,6 EM mostró la presencia de vesículas sinápticas intacta y la preservación de los elementos presinápticos y postsinápticos (Figura 2). El aislamiento de los compartimentos de pre-y post-sinápticas es importante para el examen de la señalización y la síntesis de proteínas, que se produce en ambos compartimientos. 13.7 El gradiente de Percoll-sacarosa es una purificación del crudo por lo que vimos menor contaminación celular, nuclear y orgánulos en la fracción de SN, pero la separación en general era buena. Cuando se examina por Western blot, las fracciones de Percoll contenía los marcadores de proteínas se espera un aumento en la pureza sináptica en la banda de SN (Figura 3, Tabla 2). Marcadores sinápticos y neuronales se mantuvieron en la banda enriquecido SN (banda 5), ​​pero la abundancia de otros marcadores se redujo significativamente. En particular, la presencia de GFAP, un marcador para las células de astrocitos y neoplásicas de origen glial, y Lamin-B1, un marcador nuclear, eran insignificantes, si bien los indicadores estructurales y sináptica se han mantenido o mejorado. Además, hubo retención de los marcadores de orgánulos, como las mitocondrias y Golgi, que desempeñan un papel en la síntesis de proteínas. Los rendimientos típicos para la banda de 250-500 ng SN fueron de proteína por microlitro, según lo determinado por el ensayo de proteína BCA. La actividad del SNS se determina por la cantidad de la síntesis de proteínas de novo presentan como la supervisión de [35S]-Met incorporación (Figura 4). 2 la actividad basal de traslación se incrementó 1.56 veces cuando fueron estimulados con SN 50 M glutamate/10 M glicina (Glu) o 5,12 veces cuando se activa con el inhibidor de la juglone Pin1. Inhibición Pin1 es sabido que resulta en la síntesis de proteínas. 2 Para confirmar que el aumento de [35S]-Met incorporación fue debido a la síntesis de novo de proteínas, hemos añadido 40 anisomicina M, un inhibidor de la síntesis de proteínas, y vio una marcada disminución en la incorporación en presencia y ausencia de Glu en comparación con los niveles basales. Además, en la adición de 2% Triton X-100, que altera la integridad del Sistema Nacional de Salud, la traducción basal se redujo en un 75%. 2 Además, al examinar las bandas (B4-B6), que mostró el enriquecimiento marcador más sináptica, El SNS o Banda 5 tuvo la mayor actividad para la síntesis de proteínas de novo (Figura 5). Así, la sacarosa discontinua de Percoll-gradientes rápidamente una gran actividad y enriquecido banda SN que se pueden utilizar para estudiar la traducción de proteínas. Lo discontinuo de Percoll-sacarosa procedimiento pendiente es más ventajosa que otros métodos, porque el daño mecánico es causado por condiciones más duras. En comparación con el método de filtración, en la que aclaró homogeneizado cortical pasa a través de una serie de filtros que disminuyen de tamaño, el método de Percoll 3,14-15 formas más ganglios centinela, con una mayor actividad. Como se observa en la Figura 6, cuando una parte alícuota del SNS elaborado por el método de filtración fue pasado por un gradiente de Percoll-sacarosa hay ganglios centinela mucho menos en la interfaz% 15/23 y una mayor cantidad de membranas rotas. Cuando la síntesis de novo de proteínas se midió a través de la incorporación S35-se reunió, el ​​SNS elaborado por el método de filtración son mucho menos activas (Figura 7). Para maximizar la actividad de traducción que utilizamos ratones que son entre las edades de P14 y P18. SN puede ser preparado a partir de ratones adultos, pero se observó una actividad significativamente mayor traslación con SN preparado a partir de ratones jóvenes (Figura 8). <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196table1.jpg" /> Tabla 1. Componentes de las bandas de la discontinua gradiente de Percoll-fraccionamientos de la corteza cerebral del ratón homogeneizado. 3,5 <img alt="Tabla 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196table2.jpg" /> Tabla 2. Resumen del análisis de perno occidental de sacarosa discontinua de Percoll-componentes gradiente de banda. Concentraciones relativas de proteína para cada una de las fracciones de banda aislada con un Percol discontinual-gradiente de sacarosa se determinó por Western blot. Sin presencia de proteínas (-), 0 ≥ 0,2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), o&gt; 0,8 veces (+++) = más de proteína presente en el representante sobrenadante (S, se centrifuga la corteza homogeneizado), de n 3. <img alt="Esquema 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196scheme1.jpg" /> Esquema 1: Esquema de una preparación de SN con una discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad de corteza de cerebro de ratón se disecaron, se homogeneiza y se centrifuga a baja velocidad para eliminar no homogeneizado de tejidos, células, orgánulos enteros, como los núcleos y las membranas.. El gradiente discontinuo debe tener claramente definidas las capas. La imagen insertada se muestra un ejemplo de las capas, que se han teñido de azul para fines ilustrativos con el fin de visualizar las capas. El sobrenadante se coloca sobre la parte superior de una discontinua de Percoll-gradiente de sacarosa y se centrifuga a una velocidad media. La banda de SN se recupera de la pendiente y está listo para usar. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig1.jpg" /> Figura 1. Fraccionamiento homogeneizado en una discontinua de Percoll-gradiente de sacarosa. Ratón corteza se homogeneizó y se separó en forma discontinua de Percoll-sacarosa gradiente que da lugar a seis bandas o fracciones. El purificado, activo SN (*) se encontraron en la banda 5. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig2.jpg" /> Figura 2. Preparaciones SN dar una mezcla heterogénea de GC que retienen los elementos presinápticos y postsinápticos. Una micrografía electrónica de una preparación de SN preparado a partir de ratones C57BL / 6 (edad P13 a P21) se realizó como se describió anteriormente y se muestra con SN conserva elementos presinápticos y postsinápticos. 2 , 6 puntos flechas rojas a la post-sináptica densidades. Barra de escala es de 1 micras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig3.jpg" /> Figura 3. Análisis de Western blot de los preparativos SN mostraron que los marcadores sinápticos y neuronales se mantuvieron en el SNS purificada (banda 5), pero la abundancia de otros marcadores se redujo significativamente. Inmunotransferencias de sobrenadante (S, se centrifuga homogeneizado cortical) y las bandas 1-6 de forma discontinua Percoll-gradiente de sacarosa se probaron para β-actina (control estructural, carga), GFAP (astrocitos), GP73 (Golgi), HSC70 (citoplasmática y nuclear), Lamin-B1 (nuclear), la prohibitina (mitocondrial), PSD95 (densidad postsináptica ), SNAP25 (sinapsis), sinaptofisina (sináptica) y β3-tubulina (neuronal específica). Las bandas se visualizaron con una tormenta de 860 PhosphorImager, representante de n = 3. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig4.jpg" /> Figura 4. GC se activa y muestra la síntesis de proteínas de novo a través de [35S]-Met incorporación. SNs se pre-equilibrio a 37 ° C durante 10 min. A continuación, el SNS no fueron tratadas o tratadas previamente durante 15 minutos con anisomicina M 40 o un juglone M a 37 ° C seguido por la adición de [35S]-Met, 20 l expreso Pro Label Mix S35 etiquetas de uso sencillo, más o menos Glu a 37 ° C durante 30 minutos. Las muestras se prepararon utilizando el Pierce SDS-PAGE de muestras Kit de preparación, se ejecutan en un gel de poliacrilamida al 15%, se seca y se cuantificaron utilizando una dinámica molecular Tormenta 860 PhosphorImager, representante de n = 3, ± SEM. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig5.jpg" /> Figura 5. Banda de 5 a partir de lo discontinuo de Percoll-gradiente de sacarosa contenía los niveles más altos de la síntesis de proteínas de novo. Las bandas 4, 5 y 6 y el sobrenadante (S, se centrifuga homogeneizado cortical) se pre-equilibrio a 37 ° C durante 10 min. Entonces, [35S]-Met, Express Mix Pro Label S35 etiquetas de uso sencillo, se añadió, más o menos Glu a 37 ° C durante 30 min. Las muestras se prepararon utilizando el Pierce SDS-PAGE de muestras Kit de preparación, se ejecutan en un gel de poliacrilamida al 15%, se seca y se cuantificaron utilizando una dinámica molecular Tormenta 860 PhosphorImager, representante de n = 3, ± SEM. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig6.jpg" /> Figura 6. SN preparado a partir de un método de filtración contienen membranas más roto y el SNS menos que todo SN preparado por el método del gradiente discontinuo de Percoll-sacarosa. GC fueron preparados por pasar a través de la corteza homogeneizado una serie de filtros con la disminución de tamaño de poro como se describió anteriormente. 3,14-15 una alícuota del SNS elaborado por el método de filtración se centrifugó durante un discontinuo de Percoll-gradiente de sacarosa y se compara con una cantidad equivalente de material con el discontinuo de Percoll-sacarosa método del gradiente. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig7.jpg" /> Figura 7. SN preparado a partir de un método de filtración contienen menos proteínas de novo actividad de síntesis de SN preparado aquí para allám lo discontinuo de Percoll-sacarosa método del gradiente. GC fueron preparados por pasar a través de la corteza homogeneizado de una serie de filtros con poros de tamaño cada vez menor como se describió anteriormente, 3,14-15 y por los métodos de gradiente discontinuo de Percoll-sacarosa. SN de ambas preparaciones se pre-equilibrio a 37 ° C durante 10 min. Entonces, [35S]-Met, Express Mix Pro Label S35 etiquetas de uso sencillo, se añadió, más o menos Glu a 37 ° C durante 30 min. Las muestras se prepararon utilizando el Pierce SDS-PAGE de muestras Kit de preparación, se ejecutan en un gel de poliacrilamida al 15%, se seca y se cuantificaron utilizando una dinámica molecular Tormenta 860 PhosphorImager, representante de n = 3, ± SEM. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig8.jpg" /> Figura 8. SN de ratones más jóvenes (P14) tienen una mayor actividad de traslación de los ratones más viejos (P85). Ganglios centinela fueron preparados a partir de diferentes ratones de edad avanzada con el discontinuo de Percoll-sacarosa método del gradiente, preequilibrated a 37 ° C durante 10 minutos, tratados o no con Glu en la presencia de [35S]-Met (Express Pro Label Mix S35 etiquetas de uso sencillo) durante 30 minutos, se congelaron, y luego limpiarse con el Pierce SDS-PAGE Kit preparación de muestras. El SNS se ejecuta sobre un 12% SDS-gel de poliacrilamida, secado y la imagen de una tormenta de dinámica molecular 860 PhosphorImager, representante de n = 3, ± SEM. SN de los ratones P14 por lo menos tres veces más activos que los ratones P85.

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C., Constantine-Patton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+control+of+proteins+synthesis+at+developing+synapses.">NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses.</a> Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).</li><li>Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+synaptoneurosomes+and+postsynaptic+densities+from+adult+mouse+hippocampus.">Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).</li><li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptors+trigger+postsynaptic+protein+synthesis.">Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).</li><li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+nerve+endings+from+brain:+An+electron+microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation.">The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J. Anat. 96, 79-88 (1962).</li><li>Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+Presynaptic+and+Postsynaptic+Markers+by+Size-Based+Gating+Analysis+of+Synaptosome+Preparations+From+Rat+and+Human+Cortex.">Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex.</a> Cytometry A. 60, 90-96 (2004).</li><li>Haj&#243;s, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+preparation+of+synaptosomal+fractions+in+high+purity.">An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity.</a> Brain Res. 93, 485-489 (1975).</li><li>Bai, F., Witzmann, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptosome+Proteomics.">Synaptosome Proteomics.</a> Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).</li><li>Rao, A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+protein+constituents+of+postsynaptic+membrane+specializations+are+locally+synthesized:+analysis+of+proteins+synthesized+within+synaptosomes.">Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes.</a> J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).</li><li>Pertoft, H., Laurent, T. C., Catsimpoolas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isopycnic+separation+of+cells+and+cell+organelles+by+centrifugation+and+modified+colloidal+silica+gradients.">Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients.</a> Methods of Cell Separation. , 25-65 (1977).</li><li>Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+uptake+of+L-glutamate+and+&amp;gamma;-aminobutyric+acid+in+Drosophila+melanogaster.">High affinity uptake of L-glutamate and &amp;gamma;-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster.</a> J. Biosci. 11, 119-135 (1987).</li><li>Munteanu, L. S., Dinu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+granulocytes+from+whole+human+blood+by+centrifugation.+Practical+hints.">Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints.</a> Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).</li><li>Vlasselaer, P., Van Palathumpat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separation+composition,+kit+and+method.">Cell separation composition, kit and method.</a> US patent. , (1997).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Lo discontinuo de Percoll-sacarosa gradiente de preparación descrito en este documento es un método rápido y fiable para aislar activos del SNS, que se puede utilizar en una variedad de experimentos de transmisión sináptica. Este método del gradiente, que se basa en el método desarrollado por Dunkley et al. 3,4, es un procedimiento de fraccionamiento subcelular cerebro que aísla tanto de pre-y post-sinápticas derivados vesículas de membrana que se asocian unas con otras. Sin más purificación estos...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Micro BCA Protein Kit de ensayo </td><td> Atravesar </td><td> 23235 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> Pescador </td><td> C79-500 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 gas </td><td> Airgas (UW-MDS) </td><td> CD 50 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> RPI </td><td> E57020 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Pescador </td><td> A407SK-4 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Pescador </td><td> A142-212 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Pescador </td><td> P285-500 </td><td></td></tr><tr><td> PierceSDS-PAGE preparación de muestras Kit </td><td> Atravesar </td><td> 89888 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> RPI </td><td> S23020 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Pescador </td><td> BP328-500 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 PHO 4 </td><td> Pescador </td><td> S381-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> RPI </td><td> S24060 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> RPI </td><td> T60040 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrodotoxina </td><td> Sigma </td><td> T5651 </td><td></td></tr><tr><td> Expresa Pro Label Mix S35 etiquetas de uso sencillo </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEG772 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th> Equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Herramientas de disección </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dounce homogeneizadora, 7 ml (viene con dos morteros de vidrio tipo &quot;A&quot; y &quot;B&quot;) </td><td> Wheaton </td><td></td><td></td></tr><tr><td> P1000 Gilson Pipetman </td><td> Gilson </td><td> F123602 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra 6KR centrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 366830 </td><td></td></tr><tr><td> GH 3.8 del rotor, el rotor basculante </td><td> Beckman Coulter </td><td> 360581 </td><td></td></tr><tr><td> Beckman J2-21 Centrífuga </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beckman tubos con tapas </td><td> Beckman </td><td> 355672 </td><td></td></tr><tr><td> Blancas paredes de adaptadores </td><td> Beckman </td><td> 342327 </td><td></td></tr><tr><td> Azul adaptadores de pared </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> JA-17 Rotor, Rotor de ángulo fijo </td><td> Beckman </td><td> 369691 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla de los anticuerpos utilizados para western blots: <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre de anticuerpos </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Especie huésped </th><th> Factor de dilución </th></tr><tr><td> β-actina </td><td> Sigma </td><td> A5441 </td><td> ratón </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-65343 </td><td> ratón </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> GP73 </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-134509 </td><td> conejo </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> HSC70 </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-7298 </td><td> ratón </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Laminβ </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-6261 </td><td> cabra </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Prohibitina </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-28259 </td><td> conejo </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> PSD95 </td><td> Millipore </td><td> MAB1596 </td><td> ratón </td><td> 5 g / l </td></tr><tr><td> SNAP25 </td><td> AbCam </td><td> ab5666-100 </td><td> conejo </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> Sinaptofisina </td><td> Millipore </td><td> MAB368 </td><td> ratón </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> β-3-tubulina </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-80016 </td><td> ratón </td><td> 1:200 </td></tr></tbody></table>

preparation of synaptoneurosomes from mouse cortex using a discontinuous percoll-sucrose density gradient

Synaptoneurosomes (SN) se obtienen después de la homogeneización y fraccionamiento de la corteza cerebral del ratón. Que se hara vesículas o terminales aislados que rompen con terminales de los axones en el tejido cortical se homogeneiza. El SNS conservar las características pre-y post-sináptica, lo que hace que sean útiles en el estudio de la transmisión sináptica. Conservan la maquinaria molecular utilizados en la señalización neuronal y que son capaces de captación, almacenamiento y liberación de neurotransmisores. La producción y el aislamiento de ganglios centinela activa puede ser problemático, utilizando como medios de Ficoll, que pueden ser citotóxicos y requieren centrifugación extendido debido a la alta densidad, y la filtración y el método de centrifugado, que puede resultar en una baja actividad debido a los daños mecánicos del SNS. Sin embargo, el uso de gradientes de densidad de sacarosa discontinua de Percoll para aislar SN proporciona un método rápido para producir un buen rendimiento del SNS translationally activo. El método del gradiente de Percoll-sacarosa es rápida y suave, ya que emplea a condiciones isotónicas, tiene menos y más cortas tiradas centrifugación y evita pasos de centrifugación que la SNS pellet y causar daños mecánicos.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient at JoVE.com

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Un método para preparar translationally activa, synaptoneurosomes intacta (SN) de la corteza cerebral del ratón se describe. El método utiliza una discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad que permite la rápida preparación de los ganglios centinela activa.

Preparación de Synaptoneurosomes de ratón con una corteza discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.2K vistas.  University of Wisconsin. Un método para preparar translationally activa, synaptoneurosomes intacta (SN) de la corteza cerebral del ratón se describe. El método utiliza una discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad que permite la rápida preparación de los ganglios centinela activa.

Video: Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Investigación

Neurociencias

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Aislar las células que expresan LacZ de tejidos de ratón del oído interno mediante citometría de flujo

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Preparación de sináptica Membrana plasmática y proteínas postsináptica densidad utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Investigating the Function of Deep Cortical and Subcortical Structures Using Stereotactic Electroencephalography: Lessons from the Anterior Cingulate Cortex

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure involves the chronic placement of multiple depth electrodes into regions of the brain typically inaccessible via subdural grid electrode placement. SEEG thus provides a unique opportunity to investigate brain function. In this paper we demonstrate how SEEG can be used to investigate the role of the dorsal anterior cingulate cortex (dACC) in cognitive control. We include a description of the SEEG procedure, demonstrating the surgical placement of the electrodes. We describe the components and process required to record local field potential (LFP) data from consenting subjects while they are engaged in a behavioral task. In the example provided, subjects play a cognitive interference task, and we demonstrate how signals are recorded and analyzed from electrodes in the dorsal anterior cingulate cortex, an area intimately involved in decision-making. We conclude with further suggestions of ways in which this method can be used for investigating human cognitive processes.

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is an operative technique used in epilepsy surgery to help localize seizure foci. It also affords a unique opportunity to investigate brain function. Here we describe how SEEG can be used to investigate cognitive processes in human subjects.

La investigación de la función de profunda cortical y estructuras subcorticales Usando estereotáctica Electroencefalografía: Lecciones de la corteza cingulada anterior

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Proyección de imagen de las células de la corteza Cerebral primaria usando un sistema 2D de la cultura en vivo

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...