Los preparativos antes del día de cultivo: <ul><li> Prepare una solución estéril de disección (DS). </li><li> Prepare NBM/B27 (Mediom Neurobasal con suplementos B27). </li><li> Autoclave ddH2O y esterilizar coversilps vidrio, si es necesario. </li><li> Escudo platos de cultivo de tejidos o cubreobjetos de vidrio con poli-D-lisina. </li></ul> Poli-D-lisina de revestimiento: Preparar el día antes de cultivo en condiciones estériles. <ul><li> Descongele alícuota del PDL 10 veces y el lugar en el hielo. </li><li> Añadir 9 ml estéril ultra filtrado de agua a 1 ml de PDL y mezclar bien (1X). </li><li> Cubra las superficies con 1X PDL noche a temperatura ambiente de la siguiente manera: <ul><li> vidrio cubreobjetos (Bellco gato de cristal, Inc. # 1943-00012.): 75 l / cubreobjetos O </li><li> 24 placas de cultivo, así: 300 l / pocillo O </li><li> 35 mm placa de cultivo: 1ml/dish </li></ul></li><li> Enjuague 5X con agua estéril (uso de pipetas Pasteur estéril para aspirar el contenido). </li><li> Eliminar el agua hasta que la superficie esté completamente seca. </li></ul> Procedimiento de cultivo (que se hace en campana de flujo laminar bajo condiciones estériles) <ol><li> Recorte bloque de agar y péguelo en el bloque de apoyo de la Vibraslicer microtomo (Campden Instruments Ltd.) con pegamento. </li><li> Cuando se utiliza última etapa embrionaria (E17-18) fetos de ratones, presa de la eutanasia, sin extraer el útero y los fetos individuales de saco embrionario. Fetos lugar en placa de Petri estéril y continuar como se indica a continuación. </li><li> Decapitar feto de ratón o crías (las directrices aprobadas por seguir a su animal de Atención Institucional y el empleo). </li><li> Quite la piel y el cráneo y el cerebro el lugar en el disco un papel filtro Whatman en una placa de Petri de 60 mm DS llena de frío. </li><li> Cortar el cerebelo con una hoja de afeitar estéril. </li><li> Recoger el cerebro con una espátula y drenar el líquido en exceso en un papel de filtro, a continuación, transferir el cerebro para bloquear el apoyo Vibraslicer y el cerebro de pegamento en el lugar (lado caudal y parte ventral hacia agar). </li><li> Llene la cámara de frío con síndrome de Down. Selector de velocidad a 8-9. </li><li> Corte secciones 200-400 micras, a partir de bulbo olfatorio. Una vez que la hoja de la Vibraslicer entra en la corteza, empezar a cortar 600μm secciones coronal. Un cerebro de ratón E17-18 por lo general los rendimientos de 3-4 rebanadas utilizable, mientras que un cerebro de ratón P0 rendimientos 4-5 rebanadas utilizable. </li><li> Transferencia de las secciones de cerebro de 35 mm placa de Petri marcada DS 2 con punta opuesta de la ONU conectado 10 ml de vidrio con pipeta Pasteur. </li><li> Diseccionar la corteza y eliminar el uso de agujas de vidrio meninges extraídos de los tubos capilares. </li><li> Cortar las cortezas corticales en trozos pequeños, 0.5-1 mm de largo. </li><li> ES filtro a través del filtro de 0,2 micras unida a una jeringa de 5 cc en un 35 mm placa de Petri. </li><li> Transferencia de las piezas de tejido cortical de placa de Petri que contiene ES filtrada. </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 30 min. </li></ol> Mientras tanto: <ol><li> Limpieza de campana, Vibraslicer y herramientas de disección. </li><li> Añadir 5 ml de agua tibia NBM/B27 en un 60 mm placa de Petri. </li></ol> Después de 30 min. incubación: <ol><li> La transferencia de tejido a 10 ml DS. Dejar reposar durante 1 minuto. </li><li> La transferencia de tejido al primer remolinos tubo de alta y dejar reposar durante 2-3 min. </li><li> Hola traslado al segundo. Repita lo anterior. </li><li> Traslado a la primera Li. Repita lo anterior. </li><li> Traslado a la segunda batería. Repita lo anterior. </li><li> Transferencia a terceros Li. Repita lo anterior. </li><li> La transferencia de tejido para el plato de 60 mm con los medios de comunicación. </li></ol> Bajo el microscopio de disección: <ol><li> Limpie los residuos de los tejidos y triturar cada pieza con cuidado que pasa a través de una pipeta de vidrio tirado (uso de disminuir el tamaño de diámetro) para aflojar el tejido. </li><li> Transferencia de suspensión de células a un tubo cónico de 15 ml que contiene el resto de NBM + B27 (hacen un total de 13 ml para una placa de 24 ml o bien 11 para 5 -. Placas de 35 mm Mezclar suavemente y esperar a que grandes pedazos de tejido para resolver). </li><li> Transferencia de suspensión de células (0,5 ml / pocillo de una placa de 24 pocillos o 2 ml / placa de cultivo de 35 mm). </li><li> Cuando se utiliza cubreobjetos de vidrio, añadir 80 l de suspensión celular por cubreobjetos y dejar una hora en el cultivo de tejidos incubadora para que las células se adhieran antes de la inundación de la cámara con más NBM/B27 los medios de comunicación. </li><li> Mantener los cultivos a 37 ° C y 5% CO 2. </li></ol> Día Siguiente 24 y placa: Feed cada pocillo con 0,5 ml de células no neuronales acondicionado NBM/B27 medio (cNBM/B27; Protocolo para la preparación de cNBM/B27 medio aparece a continuación) Platos de 35 mm: Vuelva a colocar 0,5 ml con cNBM/B27 medio. Mantener la cultura mediante la sustitución de 0,5 ml de medio fresco con cNBM/B27 cada 2-3 días. Aunque los medios de cultivo no promueve la proliferación de células gliales, las culturas pueden ser tratados con 5μM FDU (5-fluoro-2&#39;-desoxiuridina, Sigma F0503) en el día 03/05 en la cultura de reducir aún más el número de células gliales, si es necesario. JUEGO<html> -UP para la disección y la Cultura Esterilizar las herramientas de disección en el 70% EtOH o autoclave ellos: <ul><li> Tijeras (empresas medianas y pequeñas) Espátulas (empresas medianas y pequeñas) </li><li> Pinzas (empresas medianas y pequeñas) Razor blade </li><li> Hoja de baño Buffer vibraslicer </li><li> Pequeña cuña de metal de hoja de soporte para el cerebro </li></ul> Otros materiales: <ul><li> Placas de Petri (60 mm) </li><li> Placas de Petri (35 mm) </li><li> Papel de filtro </li><li> Pipeta de vidrio de 10 ml </li><li> Pipetas desechables estériles, 5,10 y 25 ml </li><li> Filtro de jeringa de 0,2 micras </li><li> Jeringa de 5 cc </li><li> Tubos de centrifugación de 15 ml </li><li> Pasteur de vidrio estéril pipetas </li><li> PDL placas de cultivo recubiertos o cubreobjetos de vidrio </li></ul> Etiqueta seis tubos de 15 ml centrífuga y seguir la preparación: Tubo # 1: La solución de la enzima: Añadir 50 U de la papaína (Worthington LS 03126) a 5 ml contiene DS: <ul><li> 100μl de la L-cisteína (0,8 mg) </li><li> 7 l de NaOH 0,1 N </li><li> 50 l APV (5 mM) </li></ul> Deje la solución a temperatura ambiente para despejar. Tenga en cuenta que la solución de la enzima aparecerá &quot;nublado&quot; en un primer momento y las necesidades para eliminar antes de su uso. Tubo # 2 y # 3: Inhibidor de la Enzima de alta: 3 ml DS + 300 l BSA / Ti + 30 l APV (5 mm). Mezclar con cuidado para evitar las burbujas, y se divide en dos alícuotas de 1,5 ml. Tubo # 4 - # 6: inhibidor de la enzima de baja: 8 ml DS + 80 l de BSA / Ti + 80 l APV (5 mm). Mezclar con cuidado para evitar las burbujas, se divide en tres alícuotas de 2,6 ml. Se colocan los tubos numerados # 2 al # 6 en el hielo. Deja el tubo # 1 (solución enzimática) a temperatura ambiente. SOLUCIONES y las alícuotas <ul><li> Solución A (solución salina tamponada) Sigma Fórmula peso 500 ml [conc.] </li><li> Cloruro de sodio NaCl S-9625 58.45 80.0g 137mm </li><li> Cloruro de Potasio KCl P-4504 74,56 4,0 g 5.4mm </li><li> Fosfato de sodio dibásico anhidro Na 2 HPO 4 S-0876 142,0 0,24 g 0,17 mm </li><li> Fosfato de potasio monobásico anhidro KH 2 PO 4 P-5379 136,09 0,3 g 0.22mm </li></ul> Pesar todos los ingredientes y mezcle hasta que se disuelven con 400 ml de agua ultra filtrada. Alcanzar un volumen final de 500 ml. Coloque en un frasco limpio y autoclave. Almacenar a 4 ° C y la etiqueta de &quot;Solución DS A&quot;. <ul><li> Solución B (Hepes) Sigma Fórmula peso 250 ml [conc.] </li><li> Hepes Hepes H-3375 283,3 9,9 20.97g </li></ul> Añadir agua ultrafiltrada hasta 200 ml. Mezclar hasta que se disuelva y llevar el volumen final de 250 ml. Coloque en un frasco limpio y autoclave. Almacenar a 4 ° C y la etiqueta de &quot;DS solución B&quot;. <ul><li> Solución de trabajo de 500 ml [conc.] </li><li> De agua ultra filtrada 400 ml </li><li> Una solución de archivo de 25 ml </li><li> Solución madre B 14 ml </li><li> D (+)-glucosa Sigma G-8270 3,0 g 33.3mM </li><li> Sacarosa Sigma S-0389 7,5 g 43,8 mM </li></ul> Ajustar el pH a 7.4 con NaOH 1N. Alcanzar un volumen final de 500 ml con agua ultra filtrada. Decantar en un frasco de vidrio limpio y autoclave. Almacenar a 4 ° C. Etiqueta de &quot;Solución de disección&quot;. Poli-D-lisina de preparación: <ol><li> Preparar la solución 10X de poly-D-lisina (PDL; Sigma P-7280) en H 2 O estéril a 1mg/ml. </li><li> Hacer 1,0 ml alícuotas. Esta solución puede conservarse a -20 ° C hasta por 3 meses. </li></ol> MEDIA <ol><li> Añadir 10 ml de B-27 Suplemento (Gibco 17504-044) a 500 ml botella de NBM (Medium Neurobasal, Gibco 21103-049). </li><li> Hacer alícuotas de 40 ml y almacenar a 4 ° C. </li></ol> APV <ol><li> Agregar 10 ml de H2O estéril al vial de 10 mg de APV (2-amino-5-phosphonopentanoic ácido, Sigma A-5282) y mezclar bien. </li><li> Preparar 180 alícuotas y almacenar a -20 ° C. </li></ol> BSA / Ti <ol><li> Disolver 1 g de BSA (albúmina bovina. Sigma A-7030) y 1 g de inhibidor de tripsina (Sigma T-9253) en 10 ml DS. </li><li> Ajustar el pH a 7.4 con NaOH 1N. </li><li> Esterilizar por filtración a través de filtro de 0,2 micras jeringa. </li><li> Se dividen en 400 alícuotas y almacenar a -20 ° C. </li></ol> L-cisteína En un tubo Eppendorf se disuelven 0,6 mg L-cisteína (Sigma C-7755) en 200 l DS. AGAR (4%) <ol><li> Disolver 4 g de agar Bacto (Difco 0140-01) en 100 ml de agua estéril. Mantener a 4 ° C hasta que sea necesario para la cultura. </li><li> Agar microondas para derretir y llenar una caja de Petri de 35 mm. Deje reposar para enfriar y polimerizar. </li></ol> Papaína (Worthington LS 03126) e_title &quot;&gt; no neuronales CULTURAS EN BOTELLAS DE CULTURA NUNC RECUBRIMIENTO frasco de cultivo (4 botellas Nunc) <ol><li> Añadir 9 ml de agua estéril para cada uno de 3 tubos de 10 veces para hacer PDL PDL 1X. </li><li> Transferencia de 30 ml 1X PDL en la primera botella. </li><li> Mover ligeramente hasta que todas las superficies están cubiertas de crecimiento. Deje reposar durante 1 minuto. </li><li> Transferencia 1x PDL a la segunda botella. Deje reposar durante 1 minuto. </li><li> Repita lo mismo con las botellas de tercera y cuarta. </li><li> Enjuague todas las cuatro botellas de 150 ml con 2X estéril H 2 O. </li></ol> Prepare la solución de enzima (ES): <ol><li> En un peso del tubo 0,6 ml de centrífuga de 0.8 mg L-cisteína (Sigma C7755), añadir DS 150 ml y agitar hasta que los cristales se disuelven. </li><li> Transferir 5 ml DS a un tubo cónico de 15 ml y añadir 150 ml de L-cisteína. </li><li> Añadir 50 unidades de papaína. (Worthington LS 03126) </li><li> Añadir 7 ml NaOH 0,1 N. </li></ol> PREPARE MEM (GIBCO 11090-081 #) <ol><li> Quitar 65 ml de la botella de 500 ml del MEM. Ahorre 10 ml para preparar la glucosa. </li><li> Añadir 5 ml de penicilina / estreptomicina (Gibco # 15070-063). </li><li> Agregar 10 ml de glucosa 1M (Sigma G-8270) (1,8 g / 10 ml MEM) </li><li> Añadir 50 ml de suero fetal bovino (Gibco # 16140-071) o bovina de suero de ternera (Omega BC-04). </li><li> Mezclar bien, alícuota y almacenar a 4 ° C. </li></ol> Neurobasal SUPLEMENTO MEDIUM/B-27 (NBM/B27) NBM, 500 ml (Gibco # 21103-049), B-27 (50 veces), 10 ml (Gibco # 17504-044) <ol><li> Añadir todo el contenido de B-27 vial a la botella de NBM y mezclar. </li><li> Alícuota y se almacenan a 4 ° C. </li></ol> DISECCIÓN de tejido cerebral <ol><li> Seco disección herramientas de EtOH al 70% antes de la disección. </li><li> Transferir 10 ml DS en cada una de tubo de 3.15 ml. </li><li> Seleccione crías de ratón (P0 - P3), se necesitan tres cerebros para 4 botellas. </li><li> Añadir DS fría a 35 mm placa de Petri. </li><li> Decapitar cría de ratón y diseccionar el cerebro. </li><li> Lugar en los cerebros de la placa de Petri que contiene DS frío. </li><li> Picar en trozos de tejido, lo suficientemente pequeño para pasar a través de una pipeta de vidrio. </li></ol> ENZIMA DISOCIACIÓN <ol><li> Eliminar la mayor DS tanto como sea posible de la antena con una pipeta Pasteur. </li><li> ES filtro a través de una jeringa de 0,2 micras y filtro de 5 cc. </li><li> ES lugar en el plato con el tejido. </li><li> Incubar el tejido a 37 ° C incubadora (CO 2 libre) durante 30 minutos. </li></ol> LAVADO DE TEJIDO <ol><li> La transferencia de tejido con una pipeta de vidrio para el primer tubo de DS, el asegurarse de obtener como ES posible. </li><li> Centrifugar durante 30 segundos a 1500 rpm. </li><li> Transferencia de tejidos y repetir el procedimiento dos veces más. </li></ol> TRITURACIÓN <ol><li> Coloque 38 ml de MEM / FBS en un tubo de centrífuga de 50 ml </li><li> Añadir 3 ml de MEM / FBS a un plato de 35 mm y transferencia de tejido a esta placa de Petri. </li><li> Disociar el tejido de él con cuidado triturar a través de una punta de la pipeta eppendorf 1000μl. </li><li> Transferencia de suspensión de células en el tubo que contiene 38 ml de MEM / FBS y mezclar bien. </li></ol> CHAPA <ol><li> Coloque la botella en posición vertical para obtener la cultura cantidades iguales de la suspensión celular y los medios de comunicación en cada botella. </li><li> Poner 90 ml de MEM / FBS en cada frasco de cultivo. </li><li> Agregar 10 ml de suspensión celular en cada botella. </li><li> Etiqueta: no neuronales, las iniciales y la fecha. Se incuba a 37 ° C y 5% CO 2. </li></ol> ALIMENTACIÓN <ol><li> El día 3 o 4, alimentación de las celdas con agua tibia MEM / FBS (decantar todos los medios de comunicación y reemplazarlo con 100 ml de MEM / FBS). Los cultivos pueden tardar 7-10 días para confluir. </li><li> En el Día de 10.7 cambiar los medios de comunicación para NBM/B27. </li><li> Al día siguiente, recoger los medios de comunicación. Filtro con 0.22μm </li><li> Hacer alícuotas de 40 ml y se alimentan con la cultura MEM / FBS. </li><li> Próximos 2 o 3 días, los medios de comunicación para el cambio NBM/B27 </li><li> Al día siguiente, recoger y repetir el procedimiento. </li><li> Seguir recogiendo los medios de comunicación durante aprox. 2 semanas. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-Fluoro-2'-deoxyuridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F0503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S9625</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibraslicer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments Ltd.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassim Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D (+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8270</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0389</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobasal Media (NBM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invirtogen (Gibco)</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-Amino-5-phosphonopentanoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin Inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9253</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Hydroxide, 1N solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SS266-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Cysteine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7755</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>0140-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Papain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington </td>
<td>LS 03126</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile 0.2 &micro;m Syringe Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>DDA02025S0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Coverslips, No1, &#216;12mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bellco Glass Inc.</td>
<td>1943-00012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minimum Essential Media (MEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>11090-081</td>
<td>with Earle's salts
without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>15070-063</td>
<td>for non-neuronal culture</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>16140-071</td>
<td>needed for non-neuronal cultures</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-25</td>
<td>Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass bottom "Imaging dishes"</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-10-C</td>
<td>Glass bottomed, &#216;35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures

Este video lo guiará en el proceso de generación de cultivos de neuronas corticales de embrión tardío y temprano del cerebro del ratón postnatal. Estas culturas se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones, incluyendo la inmunocitoquímica, la bioquímica, la electrofisiología, imágenes de calcio y sodio, proteínas y / o aislamiento de ARN. Estas culturas también proporcionan una plataforma para estudiar el desarrollo neuronal de los animales transgénicos que portan una mutación letal del gen embrionario tardío y postnatal. El procedimiento es relativamente sencillo, requiere de cierta experiencia en la técnica de cultivo de tejidos y no debe tardar más de dos o tres horas si está debidamente preparado. Cuidadosa separación de la corteza cortical del tracto de fibras tálamo-corticales se reducirá el número de embarazos no deseados células no neuronales. Para aumentar la producción de las células neuronales triturar las piezas del tejido cortical suavemente después de la etapa de incubación enzimática. Esto es imprescindible, ya que evita daños innecesarios a las células y la muerte prematura de las células neuronales. Debido a que estos cultivos se mantienen en ausencia de células alimentadoras glía, sino que también ofrecen una ventaja adicional de cultivos en crecimiento enriquecido en las neuronas.

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Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Este video muestra un procedimiento para la generación de cultivos neuronales a partir de finales de embriones y la corteza temprana de ratón postnatal. Estos cultivos pueden ser utilizados para inmunocitoquímica, la bioquímica, la electrofisiología, calcio y sodio de imagen y proporcionar una plataforma para estudiar el desarrollo neuronal de los animales transgénicos que portan una mutación del gen letal después del parto.

Preparación de los cultivos disociados ratón neuronas corticales

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Video: Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

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Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Ratón epidérmico de la cresta neural de células madre (EPI-NCSC) Culturas

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primaria disociada Mesencéfalo culturas dopamina celulares de roedores recién nacidos

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Preparación de 2-dGuo cultivos tratados con órganos timo

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Preparación y mantenimiento de las neuronas dorsales ganglios de raíz en las culturas con compartimientos

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

Aislamiento y cultivo de Post-Natal células de ratón cerebelosa gránulo Progenitor neuronas y las neuronas

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Preparación de las Culturas Rata total del cerebro de las neuronas y la glía de Estudios para el Desarrollo

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

Preparación de Aplysia Sensorio-motor culturas de células neuronales

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.