Este estudio fue apoyado en parte por el Programa del Gobierno de Victoria OIS, la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia subvenciones de programas y proyectos (JPF Chin-Quitar el polvo) y becas de postgrado (D Michell).

1. Aislamiento de las arterias carótidas <ol><li> Euthanase10 semanas de edad ratas Sprague Dawley a través de CO 2 / O 2 asfixia. </li><li> Los impuestos especiales a la izquierda y la derecha arterias carótidas comunes con la aorta y el corazón de garantizar un mínimo de estiramiento de los vasos. </li><li> En el hielo frío buffer Krebs separar las arterias carótidas de la aorta y el corazón y llevar a cabo la disección de cerca. </li><li> Mantener los vasos aislados en Krebs en el hielo antes de su montaje. </li></ol> Aprox. tiempo = 45 minutos 2. Cebado de la cámara de buques <ol><li> En los conectores proximales y distales de la cámara de recipiente tampón Krebs ras mantiene a un pH fisiológico mediante la infusión de gas carbogen (95% O 2, 5% CO 2) a través del buffer a 37 ° C. </li><li> Asegúrese de que los tubos y cánulas se vacían por completo y están alineados. </li><li> Ras buffer Krebs a través de la P1 (proximal) y transductores P2 (distal). Cerrar los grifos para asegurar que no burbujas de aire en los transductores. </li><li> Conecte los transductores a los conectores correspondientes y una vez más al ras más tampón de Krebs asegurando que no haya burbujas de aire. Cerrar los grifos de la cámara. </li></ol> Aprox. tiempo = 15 minutos 3. Presurización de la cámara de buques <ol><li> A su vez sobre equipos a presión: la presión servo, control de la presión, la bomba peristáltica (Figura 1). </li><li> Con la bomba peristáltica en la presión y el motor de la presión en automático ejecutar buffer Krebs a través del tubo de 20 mm Hg (dial a 1), asegurando que no haya burbujas de aire. </li><li> Conecte el tubo del transductor P2 cerrado. La presión será estable. </li><li> Abra el grifo P2 a la cámara de recipiente para eliminar cualquier burbuja de entonces se cierra. </li><li> Llene la bañera con buffer Krebs (5-7 ml). </li></ol> Aprox. tiempo = 10 minutos 4. Montaje de la embarcación <ol><li> Bajo un microscopio de disección lazos lugar poliéster de color negro en cada cánula (Figura 2). </li><li> Mueva las cánulas y los titulares de la cánula aparte y montar vaso ¼ (aórtica final del arco) en la cánula P1. Asegúrese de no romper el barco. </li><li> Utilizando una jeringa llena de Krebs buffer lave cuidadosamente el exceso de sangre fuera de los vasos a través de transductor P1. Cerca de P1 a la cámara. </li><li> Recipiente seguro a la cánula P1 con la corbata de poliéster. </li><li> Mueva cánulas / los titulares de la cánula más para el montaje en la cánula P2. </li><li> Montaje final distal del vaso (~ ¼ de la longitud) en la cánula distal. Seguro con corbata de poliéster. </li></ol> Aprox. tiempo = 20 minutos 5. Presurización de la nave <ol><li> Ajustar los titulares de la cánula para asegurar que no doblarse o estirarse en el vaso. </li><li> Con P1 y P2 cerrada a la cámara de cambiar el servo de la presión de automático a manual. Compruebe la presión en el servo no hay una disminución continua de la presión dentro de los 10 segundos. Si hay una fuga que está ocurriendo y las conexiones y los transductores deben ser garantizados en su lugar. </li><li> Ajustar el servo de presión de nuevo a P2 automática a continuación, abra la cámara. Bajo el microscopio observe el buque se dilatan cuando el grifo está abierto a la cámara. </li><li> Cambiar el servo a la presión manual. Una vez más compruebe continua disminución de la presión dentro de los 10 segundos. Si hay una fuga, entonces el sistema no es a prueba de presión y no es probable que sea un agujero en el barco. </li><li> Volver a abrir P1 automático de la cámara. En la configuración manual de comprobar que la presión se mantiene estable. </li><li> Si no hay fuga, en el dial de ajuste manual de aumentar a 2 (40 mmHg). </li><li> Ajuste automático de la nave y observar bajo el microscopio. Si es necesario, ajustar el titular de la cánula para asegurar que no se doble en el que no haya fugas vessel.Check sobre la configuración manual. </li><li> Repita los pasos 5,6 a 5,7 el aumento de la línea de 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) y así sucesivamente hasta que la presión deseada. </li></ol> Aprox. tiempo = 15 - 30 minutos 6. La incubación de la embarcación a presión <ol><li> Conecte el conjunto de control de temperatura a 37 ° C. </li><li> Con una segunda bomba peristáltica perfusión Krebs buffer (1 ml / min) en el baño de la cámara de los buques. </li><li> Conecte la cámara de aspiración para asegurar que sólo la capa superior de la bañera se ha eliminado. </li><li> Incubar recipiente presurizado a 37 ° C durante 1 hora con la presión establecida en automático. </li><li> Compruebe la presión no tiene fugas (el cambio a manual) de forma periódica. </li><li> Los efectos de diversas intervenciones farmacológicas se puede observar mediante la simple adición del compuesto al baño durante la incubación. </li></ol> Aprox. = tiempo de 1 hora 7. Perfusión del recipiente a presión con sangre entera <ol><li> Durante la incubación obtener al menos 7,5 ml de sangre humana / buque recogidos en 40 U de heparina / ml de sangre. Incubar en un falcon de 50 ml a 37 ° C. </li><li> 10 minutos antes del final de tque la sangre de incubación etiqueta con VybrantDil (1:1000) durante 10 minutos a 37 ° C en la oscuridad. </li><li> Después de 10 minutos, recoger la sangre en una jeringa claro que las burbujas y colocar en una bomba de jeringa con una chaqueta de calor a 37 ° C. </li><li> Cierre transductor P1 a la cámara / buque y conectar la jeringa y tubo de drenaje. </li><li> Purga de sangre a 1000 l / min a través del tubo de drenaje para eliminar las burbujas. </li><li> Abrir P1 a la cámara. El servo de presión se ajustará automáticamente para mantener la presión deseada. </li><li> Perfusión de sangre a 100 l / min. </li><li> Utilizando un microscopio de fluorescencia acoplado a una cámara digital de registro de dos campos de la embarcación perfusión durante 15 segundos a 1, 3, 5, 7,5 y 10 minutos. </li><li> Integridad después de la perfusión y la función endotelial se puede evaluar a través de técnicas farmacológicas, como miografía y la expresión de moléculas de adhesión se puede determinar mediante técnicas de inmunohistoquímica para validar aún más la respuesta inflamatoria. </li></ol> Aprox. tiempo = 15 minutos 8. Los resultados representativos: Un diagrama esquemático de la configuración de la cámara de presión se muestra en la Figura 1. Con una cámara digital acoplada a un microscopio de fluorescencia resultados se pueden visualizar al instante a través de grabaciones de video en vivo. Representante imágenes de vídeo se ven en la figura 3, donde los leucocitos se consideran para ser adherente al endotelio si se mantuvo estacionario durante 10 segundos. Con grabaciones de vídeo en bucle continuo células adheridas se puede contar como un campo de media por habitante. Mientras tanto baja (Figura 3) y alto (Figura 3 B) presión provocará una cierta cantidad de adhesión de un aumento significativo en la adhesión de leucocitos a la mayor presión intraluminal se ve y esto también se demuestra cuantitativamente (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" /> Figura 1. Vivo a presión ex buque de la cámara de esquema. Un buque cánula conectada a una proximal (P1) y un transductor distal (P2) que permite a los transductores de presión de la sangre para ser manipulados dentro del recipiente. La perfusión es a través del transductor de presión P1 y se mantiene a través del transductor P2. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" /> Figura 2. Cannuala con lazos. Negro corbatas de poliéster están conectados unos con cánula. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" /> Figura 3. Representante imágenes de vídeo. Adhesión celular dinámico (flecha roja) en fluorescencia a 80 mmHg (A) y mmHg 120 (B) después de 10 minutos de la perfusión. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" /> Figura 4. Adhesión leucocitaria en las arterias carótidas Sprague Dawley después de 1 hora de incubación a baja (80 mmHg) y alta presión (120 mmHg). *** P &lt;0,001, según el análisis de medidas repetidas de 2 vías ANOVA utilizando el test post hoc de Bonferroni.

<ol>
	<li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors.">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li><li>Szczech, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+and+cardiovascular+outcomes+in+acute+severe+hypertension.">Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension.</a> Circulation. 121, 2183-2191 .</li><li>Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+elevated+blood+pressure+and+its+management+on+the+short-term+outcome+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke.</a> Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).</li><li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure.">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> JAMA. 275, 1557-1562 (1996).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Riou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+pressure+promotes+monocyte+adhesion+to+the+vascular+wall.">High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall.</a> Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).</li><li>Ley, K., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial,+not+hemodynamic,+differences+are+responsible+for+preferential+leukocyte+rolling+in+rat+mesenteric+venules.+Circ+Res.">Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res.</a> 69, 1034-1041 (1991).</li><li>Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment.">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13, 587-596 (2007).</li><li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation.">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).</li><li>Eberth, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+pulsatility+in+hypertensive+carotid+artery+growth+and+remodeling.">Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling.</a> J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).</li><li>Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+activates+an+endothelial+potassium+channel+to+release+an+endogenous+nitrovasodilator.">Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator.</a> J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).</li></ol>

El protocolo del estudio fue aprobado por la Investigación y Educación Médica Alfred Recinto Comité de Ética Animal y el Alfred Hospital del Comité de Ética.

Este es un método modificado para estudiar la adhesión de leucocitos con el endotelio de los vasos sanguíneos intactos aislados bajo condiciones de presión en tiempo real. La perfusión de la cámara de recipiente solo permite una rápida validación de pro-inflamatorias cepas de ratones grandes y los vasos de la rata. Permitiendo la manipulación de la presión permite interacciones dinámicas que se observan células de menor a mayor presión intraluminal muy altos, lo que mejor imitan-ción fisiológica y condiciones fisiopatológicas. Diámetro de los vasos también se puede medir con un número suficiente de células de imágenes del programa y por lo tanto, el flujo de corte y la velocidad puede ser determinada y por lo tanto, manipulado. Con sus capacidades de miografía, las intervenciones farmacológicas colocado en el baño de añadir otra dimensión a las condiciones de posibilidad de experimentación con este modelo para realizar estudios de las vías de mecánica y de señalización. Mientras que la preservación endotelial no se puede confirmar en la manipulación de la presión, las respuestas a ACh y PE puede llevarse a cabo después de la perfusión 9. Cabe señalar que esta configuración se muestran los efectos de la presión intraluminal en el no de célula a célula interacciones de los efectos del flujo sanguíneo pulsátil ni sistólica o diastólica. Por otra parte, mientras que los cambios agudos en la presión de adhesión de los leucocitos se observaron, esta configuración puede ser también utilizado para observar los efectos de la presión crónica (es decir, aumentar los tiempos de incubación y el uso de un modelo de presión de los animales crónicos). Sprague Dawley arterias carótidas comunes se muestran en esta configuración, pero otras cepas y especies se pueden utilizar con los ajustes apropiados al tamaño de la cánula. De hecho, es importante tener en cuenta que la edad y el peso de los animales afectan el tamaño del vaso y por lo tanto que la instalación tiene que ser individualizada para cada embarcación. La disección minuciosa y cuidadosa del tejido conectivo pueden mejorar la visualización de los leucocitos inmensamente.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo / equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td> SteREO Descubrimiento V.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 2000 Jeringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> Cámara digital y controlador </td><td> Hamamatsu ORCA-ER </td><td> C4742-95 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema de iluminación de fluorescencia </td><td> Lumen Dinámica </td><td> X-Cite 120 </td><td></td></tr><tr><td> Buque Cámara </td><td> Vida Instrumentación de Sistemas </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> Controlador de presión de Servo y bomba peristáltica </td><td> Vida Instrumentación de Sistemas </td><td> PS - 200 </td><td></td></tr><tr><td> Control de la Presión de Perfusión </td><td> Vida Instrumentación de Sistemas </td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 x transductor de presión </td><td> Vida Instrumentación de Sistemas </td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td> Controlador de temperatura </td><td> Vida Instrumentación de Sistemas </td><td> TC-01 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Instech Laboratories, Inc </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil células etiquetado solución </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> Use 1:1000 </td></tr></tbody></table>

imaging leukocyte adhesion to the vascular endothelium at high intraluminal pressure

Hipertensión en todo el mundo, se informó que en aproximadamente una cuarta parte de la población y es el principal factor de riesgo biomédicos de mortalidad a nivel mundial. En la hipertensión vascular se asocia con la disfunción endotelial y el aumento de la inflamación que conduce a la aterosclerosis y la enfermedad de varios estados, tales como la enfermedad renal crónica 2, 3 accidente cerebrovascular y la insuficiencia cardiaca 4. Un paso inicial en la inflamación vascular que conduce a la aterogénesis es la cascada de la adhesión, que consiste en el balanceo, la inmovilización, la adhesión y la transmigración de leucocitos posterior a través del endotelio. La contratación y la acumulación de leucocitos con el endotelio está mediada por una regulación al alza de las moléculas de adhesión, tales como moléculas de adhesión celular vascular-1 (VCAM-1) molécula de adhesión celular intracelular-1 (ICAM-1) y E-selectina, así como el aumento de la liberación de citoquinas y quimioquinas y una regulación al alza de las especies reactivas de oxígeno 5. Los métodos in vitro tales como ensayos de adherencia estática ayudan a determinar los mecanismos implicados en la célula a célula de adhesión, así como el análisis de moléculas de adhesión celular. Los métodos empleados en anteriores estudios in vitro han demostrado que el aumento agudo de la presión sobre el endotelio puede conducir a la adhesión de los monocitos, una regulación al alza de las moléculas de adhesión y marcadores de inflamación 6 Sin embargo, al igual que muchos ensayos in vitro, estos hallazgos no se han realizado en tiempo real bajo condiciones de flujo fisiológico, ni con toda la sangre. Por lo tanto, los ensayos in vivo son cada vez más utilizado en los modelos animales para demostrar la inflamación vascular y desarrollo de la placa. Microscopia intravital es ahora ampliamente utilizado para evaluar la adhesión de los leucocitos, la migración de rodadura, y la transmigración 7-9. Cuando se combinan los efectos de la presión en los leucocitos de adhesión endotelial los estudios in vivo son menos extensas. Uno de estos estudios examina los efectos en tiempo real del flujo y de corte en el crecimiento arterial y marcadores de remodelado, pero inflamatoria sólo se evaluaron a través de inmunohistoquímica 10. Aquí se presenta un modelo para el registro de adhesión de los leucocitos en tiempo real en los vasos sanguíneos intactos a presión con la perfusión de sangre entera. La metodología es una modificación de una ex modelo in vivo barco perfusión cámara 9, que permite en tiempo real, análisis de las interacciones adhesivas de leucocitos del endotelio de los vasos intactos. Nuestra modificación permite la manipulación de la presión intraluminal de hasta 200 mmHg permiten estudiar no sólo bajo condiciones de flujo fisiológico, sino también las condiciones de presión. Mientras que los sistemas de presión miografía han demostrado previamente para observar la pared del vaso y la luz de diámetro 11, así como la contracción del recipiente esta es la primera vez que demuestra los leucocitos del endotelio interacción en tiempo real. Aquí se demuestra la técnica que utiliza las arterias carótidas cosecha de ratas y se canuló a una cámara de flujo a medida acoplado a un microscopio de fluorescencia. La cámara de buque está equipado con un cubreobjetos fondo grande que permite una lente objetivo de gran diámetro con una distancia corta de trabajo a la imagen de la nave. Por otra parte, el agonista seleccionados y / o antagonistas pueden ser utilizados para investigar más a fondo los mecanismos que controlan la adhesión celular. Las ventajas de este método sobre microscopía intravital no incluyen la participación de la cirugía invasiva y por lo tanto un mayor rendimiento se puede obtener. Este método también permite el uso de tratamiento con inhibidores localizados en la embarcación deseada, mientras que sólo permite intravital tratamiento con inhibidores sistémicos.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure at JoVE.com

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Este es un método para visualizar adhesión de los leucocitos con el endotelio en cosechados recipientes a presión. La técnica permite el estudio de adhesión vascular en el flujo de corte con diferentes presiones intraluminales hasta 200 mmHg por lo tanto imitan-ción de las condiciones fisiopatológicas de la hipertensión arterial.

Imágenes de la adhesión de leucocitos al endotelio vascular en la presión intraluminal de alta

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

imaging-leukocyte-adhesion-to-vascular-endothelium-at-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K vistas.  Monash University. Este es un método para visualizar adhesión de los leucocitos con el endotelio en cosechados recipientes a presión. La técnica permite el estudio de adhesión vascular en el flujo de corte con diferentes presiones intraluminales hasta 200 mmHg por lo tanto imitan-ción de las condiciones fisiopatológicas de la hipertensión arterial.

Video: Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Investigación

Inmunología e Infección

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Evaluación de la respuesta estomática de las células bacterianas en vivo utilizando imágenes de Hoja Entera

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Interacciones intravital microscopía de leucocitos endoteliales y plaquetas de leucocitos en mesenterial venas en ratones

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...