Este trabajo es patrocinado por el Instituto de Investigación de Lupus (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 y NIH UL1-TR00165. Agradecemos al Dr. Robert P. Kimberly por su continuo apoyo.

Todos los donantes reclutados para este estudio dieron su consentimiento informado por escrito y el estudio fue aprobado por la Universidad de Alabama en Birmingham Junta de Revisión Institucional. 1. HUVEC Cultura Inicial y Subcultura <ol><li> Cultura vena células endoteliales umbilicales humanas (HUVEC) in vitro en medio de crecimiento completo que se compone de medio basal de células endoteliales (ver Lista de Materiales) suplementado con factores de crecimiento de células endoteliales. Nota: Los factores de crecimiento utilizados en este estudio incluyen: 5 ng / ml de factor recombinante de crecimiento epidérmico humano (hEGF), 1,0 mg / ml de hidrocortisona, 50 mg / ml de gentamicina y 50 ng / ml de anfotericina-B (GA-1000), 2 % de suero fetal bovino (FBS), / ml de factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF),, Factor de 0,5 ng 10 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos humano-básico con heparina (hFGF-B) 20 ng / ml humana recombinante de crecimiento tipo insulina ( R3-IGF-1), 1 g de ácido ascórbico / ml, y 22,5 mg / ml de heparina. El medio completose prepara inicialmente a 37 ° C y a continuación se puede almacenar a 4 ° C para su uso dentro de 1 mes de preparación. </li><li> Para preparar un matraz de células, se añade medio de crecimiento completo a un matraz de cultivo de tejidos de 75 cm 2 (1 ml / 5 cm 2) y luego se deja que el matraz se equilibre a 37 ° C / 5% de CO 2 en un incubador humidificado para por lo menos 30 min. HUVEC humano se sembró directamente en este frasco de cultivo equilibrado a una densidad de 2.500-5.000 células / cm 2. </li><li> Mientras los medios de comunicación está equilibrando, descongelar rápidamente el vial de stock HUVEC en un baño de agua a 37 ° C. Dispersar las células en el vial de almacenamiento original por agitación y luego añadirlos directamente en el matraz de cultivo que contiene el medio de crecimiento completo HUVEC pre-equilibrada para lograr una densidad de 2.500-5.000 células / cm 2. Agite suavemente el frasco para distribuir uniformemente las células y luego devolver el frasco a la incubadora. Estas células representan ahora el paso 1 ª. </li> &lt;li&gt; Medio se debe cambiar cada dos días hasta que las células son del 70-80% confluente. </li><li> El HUVEC ahora se puede cosechar del matraz de cultivo con tripsina / EDTA. El medio de cultivo se aspiró de los frascos de cultivo, seguido de un enjuague con PBS para eliminar cualquier proteína residual y de calcio de las células. Se añade una solución de tripsina-EDTA 0,25% y el plazo de 2-6 min desprendimiento de las células debe ser evidente según lo evaluado por microscopía de luz. </li><li> Cuando el 90% de las células se redondean hasta fuera de la placa, detener la tripsinización mediante la adición de un volumen igual de inhibidor de tripsina de 2x. Para facilitar la recolección de las células, añadir otra cantidad igual de medio de cultivo completo. Transferir las células separadas a un tubo de centrífuga de 15 ml estéril. </li><li> Centrifugar las células desprendidas a 225 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante, y a continuación, volver a suspender las células en 2-3 ml de medio de crecimiento completo. Determinar la concentración celular y la viabilidad utilizando un hemocitómetro y azul de tripano. </li><li> Para utilizar ªe las células para su estudio, volver a sembrar otros 75 cm 2 frascos con las células a una densidad de 10.000 células / cm 2 cosechado y vaya al paso 2.2. Alternativamente, las células pueden ser congeladas en este punto para futuros estudios. Para la congelación de células, sedimentar las células por centrifugación a 225 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en FBS que contiene 10% de DMSO a una concentración de 1 x 10 6 células / ml. La suspensión de células se transfiere luego a crioviales y se almacenó a -80 ° C después de la congelación de las células en un recipiente de congelación de células. </li></ol> 2. Preparación de HUVEC Capa <ol><li> El uso de congelados HUVECs paso 2 ª: la reactivación y la cultura. Si el uso de células en crecimiento activo, vaya al paso 2.2. <ol><li> Descongele el vial que contiene 2 HUVECs paso nd del paso 1.8 rápidamente en un baño de agua a 37 ° C. Transferencia de células de la criovial a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml, y añadir 10 ml de Medi crecimientoum. </li><li> Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante para eliminar el DMSO residual. </li><li> Resuspender el sedimento celular con medio de crecimiento completo y transferir las células en un matraz de 75 cm 2. Añadir medio de crecimiento a un volumen total de cerca de 20-25 ml y se incuba a 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Examine visualmente el cultivo celular para la confluencia cada día con los cambios de los medios de comunicación cada dos días. Por lo general, el plazo de 2-4 días, las células llegarán a 80-90% de confluencia en el que el tiempo que estará listo para su uso en el ensayo de la cámara de flujo. </li><li> Para preparar la placa de cultivo que se utilizará en la cámara de flujo (véase la Sección 5), añadir 1 ml de 10 mg / ml de fibronectina y 0,05% (w / v) de gelatina a un 35 mm de placa de cultivo de tejido y la pipeta varias veces para asegurarse de que toda la superficie de la placa se recubre. Eliminar la solución de fibronectina y gelatina excesiva y el aire seco de la placa durante al menos 30 min para optimizar la formación de la matriz de proteínas. El fsolución ibronectin y gelatina se puede reutilizar hasta 10 veces. </li><li> Recoger las células HUVEC en el paso 2.2 utilizando tripsina-EDTA como se describe en los pasos 1.5 a 1.7. Seed 500.000 células en cada placa de cultivo de tejidos recubiertos. Añadir 2 ml de medio de crecimiento en cada plato y se incuba a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Permiten a las células a crecer hasta confluencia como en el paso 2.2. Las células deben ser inspeccionados visualmente a diario con cambios de medio cada dos días. Antes de la cámara de ensayo de flujo, el primer HUVEC con 20 ml de TNF-α ng / humano para 4-6 h para regular al alza y estimular la expresión de adhesión molecular. </li></ol> 3. Purificada ligando Revestimiento <ol><li> Dibuje un círculo de 0,5 cm de diámetro con un marcador o un bolígrafo en el centro de un 35 mm de placa de cultivo de tejido. </li><li> Placa 20 l de 20 mg / ml de proteína A en la zona marcada. Use la punta de la pipeta para difundir la proteína de una solución para cubrir toda el área dentro del círculo de diámetro 0,5 cm. Es importante no tocar o rayar la superficie de la dish. Incubar a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Lavar las proteína-A revestidos placa 3x con 1 ml de PBS (pH 8,0). </li><li> Placa de 50 l 1% de BSA en la zona marcada para bloquear la unión no específica en la placa. Se incuba durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar la placa 3x los bloqueados con 1 ml de PBS como en el paso 3.3. </li><li> Preparar las soluciones de proteínas quiméricas de ligando-receptor de Fc adherencia para el recubrimiento. En este experimento, se utilizó una solución ICAM-1/Fc quimera a 25 mg / ml y una quimera P-Selectin/Fc a 0,5 mg / ml en PBS (pH 8,0). </li><li> Cubra el área marcada con 50 l de sustrato. Incubar toda la noche a 4 ° C. El plato se debe utilizar dentro de dos días y el área recubierta no se debe permitir que se sequen. Añadir PBS si es necesario para mantener la solución 50 l en la placa. </li></ol> 4. Separación de neutrófilos (todos los pasos realizados a temperatura ambiente) <ol><li> Después de obtener el consentimiento informado, recoger la sangre de los participantes por la flebotomía en unn anticoagulante tubo de recogida de sangre o Vacutainer (EDTA o heparina). Después de la extracción de sangre, se diluye la sangre 1:01 con PBS antes de la separación. </li><li> Prepare una doble capa de Ficoll para la separación de PBMC y neutrófilos en 50 ml tubos de centrífuga. Primero se debe agregar 15 ml de Ficoll pesada (véase la lista de materiales, ρ = 1,118 a 1,120), y luego Capa cuidadosamente 10 ml de Ficoll luz (véase la lista de materiales, ρ = 1,077 a 1,080) en la parte superior de la pesada Ficoll. Debe haber un fuerte fronterizo entre el Ficoll luz y capas de Ficoll pesados. Por último, la capa con cuidado 25 ml de la muestra de sangre diluida en la parte superior de la Ficoll luz sin alterar la capa de Ficoll. </li><li> Centrifugar el tubo a 250 xg durante 30 min a temperatura ambiente. Nota: El freno de rotor de la centrifugadora debe estar apagado para estos giros para reducir al mínimo la interrupción potencial de la separación de células durante la desaceleración del rotor al final de la centrifugación. Después de la centrifugación, las siguientes capas (de arriba a abajo) están presentes: la capa superior es la siguien plasmaconducido por la capa de PBMC en la parte superior de la capa de Ficoll luz, la capa de neutrófilos con pocos glóbulos rojos (RBC) se encuentra entre la luz y Ficoll pesado seguido por la capa de Ficoll pesado y glóbulos rojos en la parte inferior del tubo. </li><li> Cosecha y transferir la capa de neutrófilos en un nuevo tubo de 50 ml con una pipeta de transferencia, añadir PBS hasta un volumen final de 50 ml y centrifugar a 225 xg durante 10 min a temperatura ambiente. <ol><li> Después de la centrifugación, todavía puede haber glóbulos rojos mezclados con los neutrófilos. Aspirar el sobrenadante hasta la marca de 10 ml. Resuspender el sedimento de neutrófilos-RBC mediante agitación suave del tubo (o un breve vórtex baja velocidad) y lavar de nuevo con 50 ml de PBS. </li></ol></li><li> Después del segundo lavado, aspirar el sobrenadante. Para eliminar los hematíes contaminantes, resuspender las células sedimentadas en el PBS residual mediante agitación (o corto agitación), añadir 25 ml de H2O y suavemente vortex durante 10 segundos para la lisis de los glóbulos rojos. <ol><li> Añadir 25 ml de 1,8% de NaCl y mezclar inmediatamentede centrifugación a 225 xg durante 10 min a temperatura ambiente. El RBC contaminar ahora debe ser lisadas dejando un sedimento de células de neutrófilos blanco. </li></ol></li><li> Se lava el sedimento de células de neutrófilos con PBS. </li><li> Resuspender los neutrófilos aislados en medio RPMI con FBS al 10% y determinar la concentración de células bajo microscopio de luz con un hemocitómetro. </li><li> Ajustar la densidad celular a 500.000 células / ml con RPMI completo-10% de medio FBS. </li></ol> 5. Flujo Cámara de ensayo de adhesión <ol><li> Montar la cámara de flujo. Coloque el plato de 35 mm que contiene las HUVEC confluentes o ligandos del receptor de adhesión purificadas en la tabla de microscopio. Conecte la cámara de flujo de placas paralelas con bomba de jeringa, sistema de vacío y dejar una línea abierta para la entrada de neutrófilos. Inserte la cámara de flujo en la parte superior de la placa y fije el conjunto de la cámara de flujo 13. (Ver Figura 1) </li><li> Inicie el programa de grabación de vídeo en el ordenador conectado to el microscopio. Ajuste el campo y el enfoque del microscopio hasta el campo libre con células HUVEC están bien desarrollados o en un campo en la región de revestimiento ligando es visible. </li><li> Uso de la bomba de jeringa, enjuagar la cámara de flujo con medio RPMI. Asegúrese de que no haya burbujas de aire dentro de la cámara o de la línea de entrada de neutrófilos. </li><li> Si se desea, los neutrófilos pueden ser preparadas con la dosis baja (10 -8 M) fMLP durante 10 min. Esto permitirá una adaptación del nivel basal de activación de neutrófilos entre diferentes donantes 14. </li><li> Utilice la bomba de jeringa para inyectar los neutrófilos en la cámara de flujo a velocidades definidas (una velocidad de 350 l / min, lo que es igual a una tensión de cizalla de 1,5 dinas / cm 2 se utiliza en este estudio). Grabe el video. Debido a la adhesión de neutrófilos puede ocurrir rápidamente, un video con una longitud de 4-5 minutos es generalmente suficiente para cuantificar eventos de adhesión para el análisis. </li><li> Una de células adherentes se define como una célula que se mueve menos de un diámetro de céluladentro de 5 segundos en la superficie de HUVEC o ligando recubierto 15,16. Cuente el número total de células adherentes en el campo presente en el video grabado con esta regla. Mediante el registro de videos de larga duración similares con neutrófilos diferentes donantes, se puede calcular el adherente células / min para comparar las propiedades de adhesión entre los diferentes donantes. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo de guía a la separación y el aislamiento de los neutrófilos activados mínimamente para la cuantificación cuidadosa de la adhesión de neutrófilos bajo condiciones de estrés escarpados. La adhesión de neutrófilos es un proceso crítico en la inflamación. Debido a que las variantes genéticas en múltiples moléculas en este proceso se ha demostrado que predisponen al desarrollo de la enfermedad autoinmune 1,2, se requiere un sistema de ensayo capaz de evaluar cuantitativamente la adhesión firme de neutrófilos humanos. El método descrito en este protocolo permite la determinación cuantitativa de cuidado y el potencial adhesiva firme de los neutrófilos en un ambiente controlado in vitro bajo esfuerzo cortante. Así pues, este método permite la comparación directa de la adhesión de neutrófilos cuantitativa entre individuos con genotipo para determinar la importancia de la variación genética en las moléculas de adhesión 14. Varios pasos de este método merecen una cuidadosa consideración a achievresultados e altamente cuantitativos y reproducibles. En la preparación de HUVEC, que es crítica para alcanzar 100% de confluencia celular antes de usarlos en la cámara de flujo. Para el uso de superficies recubiertas con ligando purificado, el área de recubrimiento sustrato no se debe permitir que se seque para evitar la desnaturalización de la ligando. Además, la preparación de los neutrófilos humanos es crítico para el éxito del experimento. Aspectos críticos de aislamiento de neutrófilos de la sangre incluyen el manejo con cuidado al minimizar vórtex para evitar la activación, manteniendo las células a temperatura ambiente (es decir, la sangre no se debe almacenar en los escalones de hielo y centrifugación se debe realizar a temperatura ambiente) y completar el aislamiento y el experimento en la menor cantidad de tiempo posible. Hay métodos de aislamiento de neutrófilos adicionales que también pueden ser utilizados para preparar las células para estos ensayos 17,18. Desde un punto de vista prácticos ensayos, de adhesión utilizando neutrófilos humanos recién aislados<html> debe iniciarse dentro de 3-6 horas después de la flebotomía participante. Como los neutrófilos son extremadamente sensibles a la manipulación, tiempos prolongados entre la extracción de sangre y el uso podrían afectar los resultados de ensayo. Cuidadosa determinación de la concentración celular de neutrófilos antes de la cámara de ensayo de flujo también es necesario para alcanzar resultados exactos y reproducibles. Durante el ensayo de cámara de flujo, es importante para controlar la grabación de vídeo cuidadosamente para asegurar que la velocidad de flujo es constante y no hay ninguna turbulencia en toda la duración del experimento. Los cambios en las velocidades de flujo o la presencia de la turbulencia que precisen que se repitió el experimento. Después del experimento, también es importante para evaluar los neutrófilos restantes al microscopio para asegurarse de que los neutrófilos no se aglutinación. La formación de grumos en este punto indicaría que los neutrófilos se han convertido activado que podría alterar significativamente la densidad de neutrófilos durante el experimento. contenido &quot;&gt; La cámara de flujo crea una tensión homogénea cerca pura dentro de la cámara (τ = 6Qμ / (wh 2), donde Q = caudal, μ = viscosidad dinámica, y w = ancho de la cámara de flujo, h = altura de la 15 cámara de flujo). En nuestros estudios, hemos utilizado una velocidad de flujo de 350 l / min para la adhesión de neutrófilos, lo que crea una gran tensión de 1,5 dinas / cm 2 (W = 0,25 cm, h = 0,01 cm, la viscosidad del agua a 37 ° C (0.007 poises) se utilizó como una aproximación de la viscosidad de los medios de comunicación RPMI). Para una cámara de flujo específica, se puede cambiar la velocidad de flujo para conseguir diferentes niveles de esfuerzo cortante para imitar diferentes condiciones fisiológicas. tensión de cizallamiento fisiológica Típica en los vasos sanguíneos humanos pueden oscila entre 0,5 a 5,0 dinas / cm 13,16. Shear stress en otros vasos sanguíneos y otros animales fueron listados en la Tabla 1 113,16,19 20. Mientras que nuestro método se ha centrado en el estudio de la adhesión de neutrophi humanaLS, este método no se limita a los neutrófilos y se puede aplicar fácilmente a la adhesión o estudios de rodadura de demás tipos de células con modificaciones sencillas. Además, los sustratos en este método se pueden cambiar para diferentes propósitos. Aunque este protocolo es fácilmente adaptable a diferentes estudios, hay algunas limitaciones. El protocolo tal como se aplica aquí requiere gran número de células primarias para el análisis. Esto puede impedir el análisis de las células primarias de animales pequeños. Además, la necesidad de inmovilizar ligandos de adhesión purificadas en una conformación activa / disponible puede limitar la gama de ligandos. El uso de proteínas de fusión Fc aumenta enormemente las posibilidades de lograr la conformación ligando adecuado en la superficie de la placa. Sin embargo, nuestro método tiene una flexibilidad significativa para permitir el análisis cuantitativo de eventos de adhesión. Estos estudios mejorará en gran medida nuestra comprensión de pares de receptor-ligando de adhesión, y de la importancia potencial en función de las variantes genéticasen estas proteínas, en la patogénesis de las enfermedades humanas.

Las variantes genéticas en ambos β integrinas y 2 en ligandos ICAM son ahora reconocidos para ser asociado con el desarrollo de enfermedad autoinmune 1,2. La determinación de las consecuencias funcionales de estas variantes en células derivadas de los individuos con estas variantes es necesario para nuestra comprensión de cómo estas variantes contribuyen a la patogénesis de la enfermedad autoinmune. Tales estudios funcionales permiten para la determinación de los mecanismos por los que ocurren naturalmente variantes genéticas dan forma a la respuesta inmune tanto en la salud y la enfermedad. En el ejemplo específico de LES, ahora sabemos que las variantes en ITGAM (CD11b) y su ligando, ICAM-1, se asocian fuertemente con el desarrollo de la enfermedad 1,2. Debido a que los neutrófilos son críticos en la respuesta inflamatoria, el estudio cuantitativo de la adhesión de neutrófilos puede proporcionar ideas mecanicistas sobre cómo las variantes genéticas en ITGAM / ICAM alteran la inflamación. NeutrophIL adhesión firme a las células endoteliales (CE) es un proceso altamente regulado y juega un papel esencial en las respuestas inflamatorias 3,4. La firma de adhesión de neutrófilos sigue rodadura de neutrófilos inicial y captura en la CE y en última instancia, puede dar lugar a la transmigración in vivo. Estos procesos implican muchos tipos diferentes de moléculas de adhesión, incluyendo ICAM-1, ICAM-2, P-selectina, E-selectina en las células endoteliales y β 2 las integrinas en el neutrófilo 5-9. Por lo tanto, con cuidado de la cuantificación de la adhesión de neutrófilos a partir de donantes con diferentes variantes alélicas de las moléculas de adhesión será importante para entender las consecuencias funcionales y patológicas de estas variantes genéticas. El uso experimental de una cámara de flujo puede crear un entorno in vitro con tensión de cizallamiento de fluido similar a la observada en el medio ambiente de los vasos sanguíneos in vivo 10-12. De hecho, un ensayo de cámara de flujo acoplado con umbili humanaCal de células endoteliales de la vena (HUVEC) puede imitar el ambiente in vivo de un vaso sanguíneo. Usando este método, se puede estudiar las propiedades adhesivas celulares general hacia las células endoteliales. Además, el medio ambiente altamente controlado de la cámara de flujo también permite la evaluación de células de unión a ligandos de adhesión purificadas tales como ICAM-1 para facilitar el estudio de las interacciones receptor-ligando específicos. Se presenta aquí un método que utiliza un sistema de ensayo de adhesión cámara de flujo para estudiar las propiedades adhesivas de los neutrófilos de sangre periférica humanos a HUVEC y a sustratos ligando purificado. El uso de este método con células de donantes que expresan diferentes variantes alélicas molécula de adhesión nos permite evaluar cómo estas variantes genéticas pueden alterar la adhesión firme de los neutrófilos humanos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="677">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:677px;">Table of Reagents Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Name of reagent</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:268px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">25200-056</td>
			<td style="width:268px;">with Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">2X Trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">R-002-100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">35mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430165</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:192px;">75cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430641</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Dage-MTI</td>
			<td style="width:111px;">Model 300T-RC</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Cell freezing container&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Biocision</td>
			<td style="width:111px;">BCS-045</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-3156</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EGM-2 Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc</td>
			<td style="width:111px;">CC-4176</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth factors for basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">FBS</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">10082-147</td>
			<td style="width:268px;">Certified, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Gelatin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">G9391</td>
			<td style="width:268px;">from bovine skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:107px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:111px;">02-671-51B&#160;</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F2006</td>
			<td style="width:268px;">from human plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:107px;">Glyco Tech</td>
			<td style="width:111px;">31-001</td>
			<td style="width:268px;">Circular flow chamber for 35mm dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">47729</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Histopaque-11191</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">11191</td>
			<td style="width:268px;">Heavy ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">HUVEC</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-2517A</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">ICAM-1</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">720-IC</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Lymphocyte separation medium</td>
			<td style="width:107px;">Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:111px;">25072CV</td>
			<td style="width:268px;">Light ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Microscope</td>
			<td style="width:107px;">Zeiss</td>
			<td style="width:111px;">Axiovert 100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875</td>
			<td style="width:268px;">with L-Glutamine and Phenol Red&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Protein A</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P6031</td>
			<td style="width:268px;">resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">P-Selectin</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">137-PS</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:107px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:111px;">KDS270</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">TNF-a</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">PHC3015</td>
			<td style="width:268px;">Recombinant Human Protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human neutrophil flow chamber adhesion assay

Firme adhesión de neutrófilos a las células endoteliales desempeña un papel crítico en la inflamación, tanto en la salud y la enfermedad. El proceso de adhesión de neutrófilos firma implica muchas diferentes moléculas de adhesión, incluyendo miembros de la familia de las integrinas β 2 y sus contra-receptores de la familia ICAM. Recientemente, variantes genéticas de origen natural en tanto β 2 integrinas y ICAM se informa, se asocia con la enfermedad autoinmune. Por lo tanto, la capacidad adhesiva cuantitativa de neutrófilos de los individuos con diferentes formas alélicas de estas moléculas de adhesión es importante para estudiar en relación con los mecanismos subyacentes desarrollo de autoinmunidad. Estudios de adhesión en los sistemas de cámara de flujo pueden crear un entorno con tensión de cizallamiento de fluido similar a la observada en el medio ambiente de los vasos sanguíneos in vivo. A continuación, presentamos un método que utiliza un sistema de ensayo cámara de flujo para estudiar las propiedades adhesivas cuantitativos de neutrófilos en la sangre periférica humanas a células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y a sustratos ligando purificado. Con este método, las capacidades adhesivas de neutrófilos procedentes de donantes con diferentes variantes alélicas en los receptores de adhesión pueden ser evaluados y comparados. Este método también puede ser modificado para evaluar la adhesión de otros tipos de células primarias o líneas celulares.

Ejemplos de la unión de neutrófilos a un ligando purificado (ICAM-1/P-Selectin) cámara de flujo recubierto (Figura 2) o de la unión a un ensayo de cámara de flujo recubierto de HUVEC (Figura 3) de neutrófilos se muestran. Como se muestra en las figuras, los neutrófilos continúan acumulándose / adherirse a la superficie recubierta o HUVEC en condiciones de flujo continuo. Bajo nuestras condiciones experimentales típicas, podemos observar 50-70 neutrófilos humanos firmemente adheridas a la superficie recubierta o HUVEC durante un período de registro de cuatro minutos. Sin embargo, las variantes alélicas de las moléculas de adhesión de neutrófilos, o variantes alélicas en el sustrato (ligando purificado o HUVEC), podrían alterar sustancialmente la adhesión de neutrófilos cuantitativa 14. También hemos evaluado la dependencia temporal de los eventos de adhesión de neutrófilos observados en nuestros estudios. Mientras que estamos manteniendo constantes las condiciones de flujo, es posible que las propiedades adhesivas de las células cambian con el tiempo. Hin embargo, en los cursos de tiempo relativamente cortos en nuestros estudios, no observamos ninguna diferencia consistente en la tasa de adherencia con el tiempo. Por ejemplo, la evaluación de la adherencia a los 1-2 puntos temporales minutos en comparación con la adhesión observada entre los 3-4 puntos temporales min no son consistentemente diferentes. Por supuesto, si las células están siendo estimulados durante el experimento de adhesión, entonces los cambios en las propiedades adhesivas con el tiempo se podía esperar. En nuestros estudios, hemos controlado para la activación de neutrófilos inducida por aislamiento de cebado intencionalmente las células con dosis bajas de fMLP (10 -8 M) durante 10 min antes del estudio. Las células endoteliales (HUVEC en nuestros estudios) también requieren activación antes de regular positivamente la expresión de la molécula de adhesión para una óptima adhesión firme de leucocitos. En ausencia de pre-tratamiento, las células endoteliales (HUVEC) apoyarán muy poco la adhesión de neutrófilos. En nuestros estudios, hemos utilizado 10 ng / ml de TNF para el tratamiento 4-6 horas antes de su uso. IL-1β (10 ng / ml) y se<html> LPS (0,5-1 g / ml) también se pueden utilizar para pre-activar las células endoteliales. Es importante destacar que, HUVEC no tratadas puede ser utilizado como control negativo para asegurar que la adhesión celular es causada por la específica de neutrófilos interacciones de células endoteliales (mediada por los receptores). Alternativamente, los anticuerpos anti-receptor se pueden utilizar para bloquear los receptores específicos para evaluar la especificidad de la adhesión. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> Figura 1. Configuración de la cámara de flujo en la platina del microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; Disparos Figura 2 Pantalla de una muestra de vídeo de los neutrófilos se adhieren a ICAM-1/P-Selectin superficie recubierta en diferentes puntos de tiempo (A:. 0 punto temporal, B: 1 punto temporal min, c: 2 min punto de tiempo, y D: punto de tiempo de 4 min.) La concentración de ICAM-1 es 25 g / ml y P-Selectina es 0,5 g / ml. Velocidad de flujo de neutrófilos es de 350 l / min con una densidad de neutrófilos a 500.000 células / ml. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> Disparos Figura 3 Pantalla de una muestra de vídeo de los neutrófilos se adhieren a la superficie de HUVEC revestido en diferentes puntos de tiempo (A: 0 punto del tiempo, B: 1 min punto de tiempo, C: 2 min punto de tiempo, y D: el punto de tiempo de 4 min)..Velocidad de flujo de neutrófilos es de 350 l / ml con una densidad de neutrófilos a 500.000 células / ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> Especies </td><td > Ubicación </td><td > Esfuerzo cortante (dinas / cm 2) </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Arteria caroid Común </td><td> 11.6 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Arteria branquial </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> La arteria femoral común </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Aorta suprarrenal </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Aorta supracelíaco </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Arteria fermoral Superficial </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Vénulas </td><td> 0,5-5,0 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Retina primera arteriolas </td><td> 40.2 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Segundo arteriolas retinianas </td><td> 0.001 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Retina primera vénulas </td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Segundo vénulas retinianas </td><td> 0.43 </td></tr><tr ><td> Perro </td><td> Arteria caroid Común </td><td> 15.8 </td></tr><tr ><td> Conejo </td><td> Arteria caroid Común </td><td> 23.3 </td></tr><tr ><td> Rata </td><td> Arteria caroid Común </td><td> 46.6 </td></tr><tr ><td> Ratón </td><td> Arteria caroid Común </td><td> 64.8 </td></tr><tr ><td> Perro </td><td> La arteria femoral común </td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td> Conejo </td><td> La arteria femoral común </td><td> 156,8 </td></tr><tr ><td> Rata </td><td> La arteria femoral común </td><td> 65.9 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Tensión de cizallamiento de la muestra en diferentes órganos y diferentes especies. * Resumen de las referencias 13, 16, 19, y 20.

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Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Se presenta un método de cuantificación de la adhesión de neutrófilos. Este método crea un ambiente de flujo dinámica similar al que se encuentra en un vaso sanguíneo. Se permite la investigación de la adhesión de neutrófilos a cualquiera de las moléculas de adhesión purificadas (ligando) o sustrato de células endoteliales (HUVEC) en un contexto similar al entorno in vivo con el estrés pura.

Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.7K vistas.  University of Alabama at Birmingham.  Se presenta un método de cuantificación de la adhesión de neutrófilos. Este método crea un ambiente de flujo dinámica similar al que se encuentra en un vaso sanguíneo. Se permite la investigación de la adhesión de neutrófilos a cualquiera de las moléculas de adhesión purificadas (ligando) o sustrato de células endoteliales (HUVEC) en un contexto similar al entorno in vivo con el estrés pura. 

Video: Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Investigación

Inmunología e Infección

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

Simplificado Humanos neutrófilos extracelular Trampas (TNE) Aislamiento y manipulación

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparación de la médula ósea entera para el análisis de citometría de masa de células de linaje neutrófilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...