Los autores están muy agradecidos a RJ Sommer y Wang X para obtener ayuda con microinyección, así como de las perspicaces observaciones de los revisores anónimos. Este trabajo es apoyado por el NIH subvención SC2GM089602.

1. Transgénesis: la preparación de ADN <ol><li> Dominante co-inyección marcador: pRL3 [PPA-prl-1 (tu92)] El pRL3 plásmido es un dominante co-inyección marcador para identificar visualmente los eventos exitosos de transformación. Este plásmido codifica para un alelo mutante dominante (tu92) del gen de la PPA-prl-1 estrechamente relacionado con el SQT-1 gen del colágeno en el C. elegans y transforma la locomoción sinusoidal de tipo salvaje en las agujas del reloj movimientos de torsión a lo largo del cuerpo del gusano del eje 1,5. El animal se transforma muy similar a la del marcador de selección populares rol dominante-6 (su1006) que se utiliza en C. elegans en los últimos 20 años. </li><li> Objetivo reportero transgén: PPA-EGL-4p:: GFP Un gen de interés se pueden vincular transcripción o traslación a una secuencia de codificación de las buenas prácticas agrarias 9. En este estudio, la PPA-EGL-4promoter:: GFP (EGL-4, proteína quinasa dependiente de cGMP) was utilizado para determinar si un fragmento de 2 kb corriente arriba del inicio de la traducción puede conferir la expresión de GFP en P. pacificus PS312. Este vector GFP contiene una región de codificación de las buenas prácticas agrarias con la modificación intrones y el polivalente PPA-RPL-23 3 &#39;UTR Terminator 5 amablemente proporcionados por Xiaoyue Wang y Ralf J. Sommer (Instituto Max-Planck, Tuebingen, Alemania, UE). </li><li> ADN genómico: PS312 La adición de tipo salvaje P. pacificus ADN genómico PS312 es necesario para obtener la herencia del transgén estable, sobre todo a partir de transgénicos animales F 1 a su progenie F 2 5. No se sabe con certeza si el ADN genómico de las formas complejas matrices de cromosomas extra con los dos transgenes (el marcador de la co-inyección de PRL-3 y el Pap-4p-EGL:: reportero gfp) similares a los observados en el establo de F 2 en las líneas transgénicas C. elegans 3. Sin embargo, el requisito de tener el ADN genómico y transgenes a compartir identicavoladizos l coherente sugiere la formación de complejos arreglos extra-cromosómicos de las células huésped puede reconocer en la transmisión adecuada del ADN (ADNg preparado con Sigma G1N10 kit). </li><li> Digestión del ADN Las enzimas de restricción se utilizan para alinear la PPA-EGL-4p:: GFP vector de ADN y producir voladizos pegajosa compatible con el marcador pRL3 co-inyección y ADNg PS312. Homogeneizar golpeando, no agitación. Incubar durante una hora a 37 ° C. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> pRL3 </td><td> 4 mg </td></tr><tr><td> 10xbuffer </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> PstI (10 U / l) </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 L </td></tr><tr><td> Ppa-EGL-4p:: GFP </td><td> 4 mg </td></tr><tr><td> Buffer 10x </td&gt; <td> 10 l </td></tr><tr><td> SalI (10 U / l) </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> ADNg PS312 </td><td> 10 mg </td></tr><tr><td> Buffer 10x </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> Pst I y Sal I (10 U / l) </td><td> L 8 </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 l </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Mezcla de enzimas de restricción implícita. <ol start="5"><li> ADN precipitación y la preparación <ol><li> Añadir acetato de sodio 01:10 (3 M NaCOOCH 3 pH 5,2) y 2,5 veces el volumen de etanol al 100% para el producto digerido, añadir 20 ng / l de glucógeno para ver pellet más fácil. </li><li> Centrifugar a14.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C. </li><li> Se decanta el sobrenadante inclinando lentamente el tubo de centrífuga al revés y luego golpeándolo en un pañuelo de papel, asegurándose de que la pastilla es segura en la parte inferior del tubo y libre de etanol. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 75%. </li><li> Inmediatamente girar a 14.000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Decantar el sobrenadante por lentamente inclinando el tubo de centrífuga al revés y luego golpeándolo en un pañuelo de papel asegurando que la pastilla que seguro en la parte inferior del tubo y libre de etanol. </li><li> Seco en pelets en centrífuga de vacío a 14.000 rpm durante 5 minutos a 25-30 ° C, hasta que se seque y completamente libre de etanol. </li><li> Añadir 30 l de TE o estéril dH 2 O y dejar toda la noche a 4 ° C antes de mezclar brevemente con un vórtice. </li><li> La Tabla 2 describe cómo crear la mezcla de inyección de cada ADN purificado para inyección. </li><li> Almacenar a -20 ° C. Después de descongelar la mezcla en elinyección, girar por el tubo a 14.000 rpm durante 5 minutos para eliminar partículas de desechos que pueden obstruir la aguja de la inyección. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Material genético </td><td> Concentración </td></tr><tr><td> Ppa-EGL-4p:: GFP (SalI) </td><td> &gt; 5 ng / l (0.1-10ng/μl) </td></tr><tr><td> pRL3 (PstI) </td><td> &gt; 1 ng / l </td></tr><tr><td> ADNg PS312 (PstI + SalI) </td><td> &gt; 60 ng / l </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 30 l </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Mezcla de Pap-prl-1 de la inyección 2. La interferencia de ARN: In vitro la síntesis de ARN de doble cadena <ol><li> El uso de PCR para amplificar el gen de interés. RHL091 5&#39;-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 &#39;(BamHI) y 5&#39;-RHL092 tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3 &#39;(sitio PstI) se utilizaron para amplificar un fragmento de 464 pb genómica (la posición de 3 a 466) a partir del vector pRL3 que contiene el PPA-prl-1 (tu92) alelo. </li><li> Digerir el producto de PCR con BamHI y PstI. </li><li> Ligar el fragmento BamHI / PstI digerido pL4440 RNAi alimentación vector 2. </li><li> Transformar el vector insertado en células competentes y hacerlos crecer en LB ampicilina placas de los medios de comunicación (50 mg / ml). </li><li> Seleccione el vector ha entrado con éxito por PCR utilizando los primers T7. </li><li> Utilice la T7 flanqueado producto de PCR que contiene el gen PRL-1 para hacer ARN de doble cadena dsRNA) usando el bloque-IT RNAi síntesis kit (Invitrogen). </li><li> La concentración de dsRNA es mejor si&gt; 200 ng / l, hasta 1 mg / l para la inyección. </li><li> Almacenar a -20 ° C. Después de descongelar la mezcla de la inyección, girar por el tubo a 14.000 rpm durante 5 minutos para deshacerse de las partículas de los desechos que puedan obstruir los injection de la aguja. </li></ol> 3. Microinyección: Protocolo para la inyección de los transgenes y / o dsRNA <ol><li> Agujas de inyección <ol><li> Ajuste la aguja Narishige extractor (modelo #: PC-10) la temperatura: <ol><li> Girar el botón de abajo para &quot;Calentador N º 2&quot;. </li><li> A su vez la &quot;Adj N º 2 del calentador.&quot; panel de mando hasta que se lee 55.0-60.0 ° C durante punta de la aguja cónica de diferentes longitudes. </li></ol></li><li> Gire el botón de abajo de nuevo a &quot;Paso 1&quot; (Saca la aguja en un solo paso). </li><li> Carga de agujas en la cámara y asegúrese de que esté seguro. </li><li> Pulse el botón &quot;Inicio&quot; (botón rojo) y permitir que la aguja se retiró con todos los pesos (esto debe hacer dos agujas iguales en direcciones opuestas). </li><li> Retire la aguja de la cámara y guardar en una placa de cultivo de plástico asegurado en su lugar de Play-Doh para evitar que el polvo se acumule en las agujas. </li></ol></li><li> Almohadillas de montaje <ol><li> En un tubo centrífugo de 1,5 ml, hacer una soluci 2% de agar Noblen mediante la adición de 0,02 g de agar Noble a 1 ml de H 2 O. El agar se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de un año. </li><li> Mezclar bien y se funden en un bloque de agar de calor establecido en&gt; 88 ° C. </li><li> Usando una micropipeta de 1 ml, colocar una gota de líquido Agar Noble 2% a la media de la lámina de vidrio (Fisher, 12-544-F). </li><li> Aplanar mediante la colocación de otra placa de vidrio en la parte superior de la gota. </li><li> &quot;Paso Drop&quot; hasta que haya una capa de cinco diapositivas de cristal. </li><li> Retire cada lámina de vidrio con deslizar el portaobjetos de vidrio de unos a otros. </li><li> Seco aplanar pad agar en placas de vidrio en un horno de vacío a 70 ° C durante 4 horas a un día (o noche a temperatura ambiente). </li><li> Hacer pastillas de inyección múltiple y almacenar para uso futuro. </li></ol></li><li> Microinyección en las gónadas hermafroditas </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig1.jpg" /> Figura 1. Un dibujo esquemático de la P. pacificus anatnomía. Las células nucleadas claro son las células germinales femeninas (ovocitos) y la parte en gris es el intestino. Sólo una gónada anterior distal se muestra, pero el anuncio dos gónadas distal se cruzan entre sí dorsalmente cerca de medio cuerpo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig2.jpg" /> Figura 2. Imágenes de la microinyección. (A) La punta de la aguja de inyección está en el foco con la línea de la extrema derecha de la pieza tira capilar. Tocando ligeramente la punta de la aguja para que el borde, la punta de la aguja se rompe al tiempo que conserva una punta aguda. (B) Las inserciones de la aguja en la parte superior justo por encima de las gónadas de la curvatura del intestino para la primera inyección. (C) La aguja se inserta en la parte inferior de gónadas justo debajo de la curvatura del intestino para la segunda inyección. <ol start="3"><li><ol><li> Asegúrese de que el contraste y ajuste de corte DIC es ideal para ver las gónadas hermafroditas. </li><li> Carga 1.0-2.0 l de mezcla de la inyección en la tiracapilar aguja. </li><li> Colocar la aguja en el manipulador de la microinyección, los indicadores de presión del tanque de nitrógeno se debe establecer en las condiciones ideales (10-20 psi para 0,5-1 seg). </li><li> Romper la punta de la aguja al tocar ligeramente el borde de un tubo fino capilar sacó coloca en un portaobjetos (figura 2A). <ol><li> Aguja de diapositivas automático: la parte más delgada de un capilar sacó coloca en un portaobjetos de cristal en una gota de aceite </li></ol></li><li> Una vez que la aguja se rompe se puede colocar en una posición de reposo, mientras que usted escoja su gusano a la plataforma (P. pacificus tiene una ventana de 5 minutos para la inyección antes de que se seca y mueren). </li><li> El uso de un plato lleno de gusanos adultos J4-young, vierta el aceite de parafina suficiente (pesado) para sólo cubrir todos los gusanos en el OP50 césped bacteriano. </li><li> Elige un gusano y lo coloca en la plataforma de inyección. </li><li> Colocar la placa de vidrio con el gusano en el microscopio, la posición gónadas del gusano en la dirección de la aguja y la vulva lejos de la necesidadle (Figura 2B, 2C). </li><li> Baje la aguja a la posición de la vista del microscopio. </li><li> Posición de la gónada parte superior y la aguja en el mismo plano focal (Figura 2B). </li><li> Poke el gusano con cuidado y de la bomba en la mezcla de la inyección; ovocitos que separa hacia el extremo distal indican una inyección de éxito (para optimizar el transgén o entrega dsRNA, usted debe ver a la inyección de una ola de expansión en la gónada, que continúa hasta que se encuentra cerca de la parte distal punta). </li><li> Vuelva a colocar la aguja para inyectar a la gónada inferior y repetir la inyección, sin embargo desde esta gónada se encuentra en el intestino la difusión de los ovocitos no se verá por lo que es más difícil de lograr (Fig. 2C). </li><li> Gusano de aspecto normal indica una inyección de éxito después de la inyección, no debe haber ningún daño gónadas (que sobresale de la vulva o se extraen dentro de la cavidad del cuerpo). </li><li> Vuelva a colocar la aguja en posición de reposo. </li><li> Se preparan para rescatar a los gusanos. </li><li> Añadir uncaída (0,5 l) de tampón de M9 en la almohadilla donde se encuentra el gusano inyecta. </li><li> El uso de algunos OP50 bacterias en su selección, toque el gusano con el OP50, y debe pegarse. Nosotros no usamos pipetear con la boca. </li><li> Colocar el gusano en el plato de cabeza de serie con 50 puntos de l OP50, 2-4 gusanos pueden ser rescatados en las placas de tal. </li></ol></li><li> Después de la inyección de almacenamiento y cribado para la transgénesis <ol><li> Tienda inyecta gusanos (P 0) a 20 ° C durante ~ 4 días para poner sus huevos y crecen F 1. </li><li> Gusanos de pantalla en el cuarto día de fenotipo seleccionado (Para la detección de la transgénesis, búsqueda de animales rodar expresar la PPA-prl-1 marcador dominante). </li><li> Solo pico independientes F 1 &#39;s animales con el fenotipo observado a las nuevas placas sin semillas y guárdela a 25 ° C, esta temperatura favorece la formación de líneas estables de la F 1&#39; s. </li><li> F solo dos de las líneas independientes de F 1. Individuales F 2 </subLíneas&gt; tienen similares tasas de transmisión del transgén. A menudo obtener&gt; 15 F 2 líneas por transformar un F animal. </li><li> Tienda de las generaciones posteriores a 25 ° C. </li><li> La tasa de transmisión de los rodillos por lo general se mantiene constante después de la generación F 4, así que es necesario en este momento para determinar el nivel de expresión de los transgenes de destino (PPA-EGL-4p:: GFP) para cada línea individual. La expresión de GFP puede no correlacionarse con el grado de penetrancia del fenotipo dominante de rodillos. </li></ol></li><li> Después de la inyección de almacenamiento y detección de fenotipos RNAi <ol><li> Tienda inyecta gusanos (P 0) a 20 ° C durante ~ 4 días para descansar y crecer F 1. </li><li> Pantalla de F 1 gusanos en el cuarto día de fenotipo seleccionado (Para la detección de fenotipo RNAi desmontables, la búsqueda de fenotipos penetrantes que pueden estar asociados con la pérdida de la actividad del gen objetivo, en nuestro caso la pérdida de la PPA-prl-1 fenotipo). </li><li> En nuestra experiencia, el fenotipo caída sin rodillos se pierde en&gt; 97% de la F 2. </li></ol></li></ol> 4. Los resultados representativos: 1. Resultado de la transgénesis <table border="1"><tbody><tr><td> Sesión </td><td> Inyecta P 0 </td><td> F 1 Rodillos </td><td> F 2% transgénicos </td><td> % De transmisión promedio después de F 2 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 2 </td><td> (Línea 1) 0% (Línea 2) 13% </td><td> NA 13% ± 10 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 1 * </td><td> (Línea 3) 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Línea 4) 0% </td><td> NA </td&gt; </tr><tr><td> 5 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Línea 5) 26% </td><td> 22% ± 10 </td></tr></tbody></table> * Un rodillo de hombres que no pasó; NA: No aplica . Tabla 3 Resultados de la PS312 inyectados con Pap-EGL-4p:: GFP (Sal I digerido), pRL3 (rodillo) (Pst I digerido), y ADNg PS312 (PstI y SalI digerido). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig3.jpg" /> La figura 3 (A) de tipo salvaje (B, C) ​​La estabilidad F 4 pRL3; Pap-EGL-4P:.: GFP línea transgénica muestra la cabeza de la neurona la expresión de GFP. 2. Resultado de la interferencia de ARN <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig4.jpg" /> Figura 4. ARN inyectado prl-1 mutantesmostrar caída completa de &quot;rodar&quot; la locomoción. (A) prl-1 rodillo de ganancia de función de mutantes tu92. (B) &quot;derribado&quot; prl-1 mutante muestra una postura normal de tipo salvaje y la locomoción. (C) inyectado prl-1 (inferior) también tiene más cuerpo que el prl-1 mutante (arriba). (D) El cuerpo de inyección ya prl-1 (inferior) es más largo que el PS312 de tipo salvaje (arriba). El fenotipo de cuerpo por más tiempo también se observó en el rol-5 (SQT-1) caída de RNAi C. elegans N2 (datos no mostrados). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> rollo </td><td> no-roll </td></tr><tr><td> A prl-1 dsRNA (200 ng / l) </td><td> 13 </td><td> 21 </td></tr><tr><td> B-1 prl dsRNA (1000 ng / l) </td><td> 9 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> control </td><td> 20 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabla 4. </strong&gt; Resumen de la ALP-prl-1 inyecciones dsRNA. (A) [dsRNA] = 200 ng / l (B) [dsRNA] = 1000 ng / l. P = 0,0019 y 0,041 por la prueba exacta de Fisher de dos colas, de 200 y 1.000 inyecciones ng / l, respectivamente.

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	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Las poblaciones de P. pacificus se encuentran en estrecha relación con varias especies de escarabajo en todo el mundo y es un modelo intermedio entre los nematodos de vida libre y nematodos parásitos. La fuerza de la P. pacificus como un organismo modelo emergente radica en la integración de sus mapas genéticos y físicos que promuevan la asignación de posición de los mutantes aislados imparcial pantallas adelante genéticos (es decir, no sólo por los genes candidatos previamen...

<table border="1"><tbody><tr><th> Producto: </th><th> Catálogo #: </th><th> Proveedor: </th></tr><tr><td> DMI3000 inyección microscopio </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Microinyector manipulador (transmisión directa) </td><td> Narashige BC-3 de rótula </td><td> Tritech Investigación </td></tr><tr><td> Extractor de agujas </td><td> Narashige PC-10 </td><td> Tritech Investigación </td></tr><tr><td> Microinyector ™ Todo-Digital Multi-La presión del sistema </td><td> Narashige Minj-D </td><td> Tritech Investigación </td></tr><tr><td> GeneElute ™ mamíferos ADN genómico Miniprep Kit </td><td> G1N70 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> pJet Jet kit de clonación </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET plásmido kit Miniprep </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> ADN Clean &amp; Concentrador ™ </td><td> D4005 </td><td> Zymo Investigación </td></tr><tr><td> BLOCK-IT ™ RNAi TOPO ® kit de transcripción </td><td> K3500-01 y K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Agar Difco ™ Noble </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Fisher Scientifi </td></tr><tr><td> Microscopio cubierta de vidrio (1,5 - 0,16 a 0.19mm de espesor, tamaño: 50 x 45 mm) </td><td> 12-554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Capilares de vidrio (filamento) </td><td> 615000 </td><td> Los sistemas AM </td></tr><tr><td> Aceite de parafina (Heavy) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

A pesar de que es cada vez más asequibles para los organismos modelo emergente para obtener genomas secuenciados completamente, más a fondo la función de genes y análisis de expresión de ARN de interferencia y la transgénesis estable siguen siendo limitados en muchas especies debido a la anatomía particular y la biología molecular celular del organismo. Por ejemplo, en las afueras de la corona Caenorhabditis grupo que incluye Caenorhabditis elegans 3, de forma estable de transmisión en las líneas transgénicas no Caenorhabditis especies no han sido reportados en este phylum engañosa (Nematoda), con la excepción de Strongyloides stercoralis 4 y 5 Pristionchus pacificus. Para facilitar la ampliación del papel de P. pacificus en el estudio del desarrollo, la evolución y el comportamiento de 6-7, se describe aquí los métodos actuales para el uso de microinyección para la fabricación de animales transgénicos y knock por RNAi. Al igual que las gónadas de los <em&gt; C. elegans y la mayoría de otros nematodos, las gónadas de P. pacificus es sincitial y capaz de incorporar el ADN y ARN en los ovocitos cuando se entrega por microinyección directa. A diferencia de C. elegans Sin embargo, la herencia del transgén estable y la expresión somática en P. pacificus requiere la adición de ADN genómico digerido con endonucleasas auto complementario a los extremos de los transgenes blanco y marcadores coinyección 5. La adición de ADN genómico de transporte es similar a la necesidad de expresión del transgen en Strongyloides stercoralis 4 y en las células germinales de C. elegans. Sin embargo, no está claro si el requisito específico de ADN de los animales genómica propia se debe a P. pacificus soma es muy eficiente en el silenciamiento no complejos multi-copia genes o conjuntos de extracromosómico en P. pacificus requieren secuencias genómicas para el montaje adecuado cinetocoro durante la mitosis. La migración ventral de la (de dos brazosdidelphic) en las gónadas hermafroditas complica aún más la capacidad de inyectar ambas gónadas en los gusanos individual 8. También demostrar el uso de microinyección para derribar un mutante dominante (rodillo, tu92) mediante la inyección de ARN de doble cadena (dsRNA) en las gónadas para obtener información no rodar progenie F 1. A diferencia de C. elegans, pero como la mayoría de otros nematodos, P. pacificus PS312 no es receptiva a RNAi sistémico a través de la alimentación y el remojo y por lo tanto dsRNA debe ser administrado por microinyección en las gónadas sincitial. En este estudio, esperamos que para describir el proceso de microinyección necesarias para transformar un promotor PPA-EGL-4:: reportero GFP fusión y caída de un rodillo dominante prl-1 (tu92) mutante en un protocolo informativo visual.

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RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

En organismos modelo, la transgénesis pueden manipular las funciones de genes, mientras que el ARNi puede caída transcripciones de ARNm específico de 1-2. Este protocolo tiene como objetivo ilustrar las técnicas necesarias para introducir ADN transmitido de forma estable y transitoria de ARN de doble cadena en el nemátodo necromenic<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt; Para los estudios de la biología evolutiva, de desarrollo y comportamiento.

RNAi mediada por derribo de genes y transgénesis por microinyección en el nematodo Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

rnai-mediated-gene-knockdown-transgenesis-microinjection-necromenic

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Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

16.4K vistas.  California State University. En organismos modelo, la transgénesis pueden manipular las funciones de genes, mientras que el ARNi puede caída transcripciones de ARNm específico de 1-2. Este protocolo tiene como objetivo ilustrar las técnicas necesarias para introducir ADN transmitido de forma estable y transitoria de ARN de doble cadena en el nemátodo necromenic Pristionchus pacificus Para los estudios de la biología evolutiva, de desarrollo y comportamiento.

Video: RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to perturb gene expression patterns in selected segments of leech embryos, leaving the untreated segments as internal controls.
The pneumatic capillary gun can be used to reach internal layers of cells at early stages of development without opening the specimen. As a method for localized introduction of substances into living tissues, the biolistic delivery with the gun has several advantages: it is fast, contact-free and non-destructive. In addition, a single capillary gun can be used for independent delivery of different substances. The delivery region can have lateral dimensions of ~50-150 &#181;m and extends over ~15 &#181;m around the mean penetration depth, which is adjustable between 0 and 50 &#181;m. This delivery has the advantage of being able to target a limited number of cells in a selected location intermediate between single cell knock down by microinjection and systemic knockdown through extracellular injections or by means of genetic approaches.
For knocking down or knocking in the expression of the axon guidance molecule Netrin, which is naturally expressed by some central neurons and in the ventral body wall, but not the dorsal domain, we deliver molecules of dsRNA or plasmid-DNA into the body wall and central ganglia. This procedure includes the following steps: (i) preparation of the experimental setup for a specific assay (adjusting the accelerating pressure), (ii) coating the particles with molecules of dsRNA or DNA, (iii) loading the coated particles into the gun, up to two reagents in one assay, (iv) preparing the animals for the particle delivery, (v) delivery of coated particles into the target tissue (body wall or ganglia), and (vi) processing the embryos (immunostaining, immunohistochemistry and neuronal labeling) to visualize the results, usually 2 to 3 days after the delivery.
When the particles were coated with netrin dsRNA, they caused clearly visible knock-down of netrin expression that only occurred in cells containing particles (usually, 1-2 particles per cell). Particles coated with a plasmid encoding EGFP induced fluorescence in neuronal cells when they stopped in their nuclei.

In this video, we show a procedure for an accurate biolistic delivery of reagents into live tissue with a novel miniature gene gun. We are knocking down the expression of the axon guidance molecule Netrin in leech embryos by delivering molecules of dsRNA into the ventral body wall and ganglia of single segments.

Localizada RNAi y la expresión génica ectópico en la sanguijuela medicinal

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Investigación

Biología

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Entrega bacteriana de RNAi efectores: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

La activación de la apoptosis mediante microinyección citoplasmática del citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Mediada por Agrobacterium inducida por el virus Gene ensayo silenciamiento en algodón

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

RNAi mediada por Gene y Derribo<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo de diuresis en Mujeres Adultas<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Los mosquitos

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...