A pesar de que la edición genética se ha vuelto popular para estudiar la genética molecular de los organismos no modelo, el ARNi sigue siendo una poderosa herramienta sinérgica. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar a diferentes etapas de desarrollo. Además, se puede utilizar un derribo parcial para estudiar estos genes enteros.
El éxito del procedimiento se basa en la inyección de DSR y tener un daño mínimo. Esto requiere práctica, así que no se desanime si se necesitan algunos intentos para hacerlo bien. Para preparar embriones en etapa temprana para la micro inyección, primero vierta la ebullición del 20% de la agarosa en una pequeña placa de Petri y coloque tres tubos de plástico de uno a dos milímetros de ancho en la superficie del líquido agarosa antes de que se solidifique.
Una vez que la agarosa se ha solidificado utilizar un par de fórceps contundentes para quitar los tubos y cubrir las hendiduras resultantes con 500 microlitros de agua destilada autoclave. Cuando el recipiente de la colección esté listo, utilice un cepillo de pintura de pelo natural fino para transferir cinco ocho horas de edad embrión T.marmoratus de edad de los sitios de anidación de escarabajos en un plato de cavidad de vidrio lleno de agua destilada autoclave bajo un microscopio estereo. Usando el microscopio y los fórceps de disección fina agarran la tarea de cada embrión desde ambos lados y desgarran la tarea abierta permitiendo que el embrión se deslice suavemente fuera del tejido.
Después de eliminar ambas capas de coro de todos los embriones recogidos, utilice el pincel para transferir cuidadosamente los embriones de la placa de cavidad de vidrio a las ranuras de la placa de agarosa preparada. Para inyectar embriones en etapa temprana con ARN de doble cadena específico del gen, primero prepare agujas de microinyección en un pulverizador de aguja y utilice el microscopio estéreo y encuentre fórceps para romper cada punta a un borde afilado. Después de lanzar el ARN de doble cadena de doble cadena de material purificado de interés sobre el hielo, agregue un microlitro de tampón de inyección 10X a la solución resultante y utilice agua destilada doble para llevar el volumen de vinilo de la solución a 10 microlitros.
Utilice una pipeta P10 para rellenar una de las agujas de microinyección preparadas con la solución de ARN de doble cadena de trabajo y cargue la aguja en un soporte de microneedleta conectado a un sistema de microinyección que utilice tecnología de eyección de presión. Encienda el sistema de microinyección y el suministro de aire presurizado y utilice la microválvula del sistema de microinyección para ajustar la presión de inyección a 15 libras de presión por pulgada cuadrada y luego utilice la perilla de ajuste de tiempo para ajustar la duración de la inyección a segundos. Para calibrar la aguja de inyección evaluar el volumen de la burbuja de fluido que se forma en la punta de la aguja al inyectar en el aire para el embrión T.marmoratus utilizar un tamaño de burbuja óptimo de 100 a 200 micras.
La aguja de inyección es de buena calidad si se pueden lograr burbujas óptimas a 15 libras de presión por pulgada cuadrada con una duración de inyección de unos tres segundos. Cuando la aguja configurada esté lista, alinee la aguja en la placa de agarosa de embriones de manera que la aguja se acerque a los embriones en un ángulo de 45 a 60 grados. Utilice el micromantenedor para mover lentamente el microneedle hasta que la punta esté tocando la superficie del centro de un embrión y luego mueva cuidadosamente la aguja hacia adelante hasta que simplemente perfore la superficie del embrión.
Una vez que la aguja está dentro del embrión presione cuidadosamente el botón de inyección del microinyectores para entregar de uno a dos nanolitros de ARN de doble cadena en el embrión. Cuando todo el ARN se haya entregado lentamente, retraiga lentamente la aguja del embrión sin hacer que el embrión se rompa. Los embriones inyectados con éxito se pueden identificar por la presencia de un punto de color en el lugar de la inyección.
Cuando todos los embriones se hayan inyectado cuidadosamente coloque el plato en una cámara de humedad en una incubadora de 25 grados Celsius ajustada a un ciclo de 14 horas de luz de 10 horas oscuro durante cuatro a cinco días. Supervise el progreso del desarrollo embrionario diariamente bajo el microscopio estéreo para identificar fenotipos de derribo morfológicamente visibles. Uso de una cámara digital de alta resolución para documentar el proceso de desarrollo.
Retire los embriones muertos y reponga el agua de la placa de agarosa diariamente para evitar la desceración y la propagación de la contaminación microbiana a otros embriones supervivientes durante el período de incubación. Antes de recoger la larva primero añadir 60 a 70 grados Celsius 2%agarosa líquida a un pequeño plato petri. Cuando la agarosa se ha solidificado utilizar fórceps contundentes para hacer un grupo poco profundo por larva para ser inyectado en la agarosa y drenar suavemente el agua de las copas de cultivo de larvas.
Después de la anestesia utilice fórceps de extremo suave para colocar cuidadosamente la larva en la placa de inmovilización con los cuellos y cuerpos en las ranuras, pero la cola situada por encima de la superficie de la agarosa. Cuando se haya colocado toda la larva, cubra cada lava con una gruesa capa de agarosa que todavía es líquida pero no peligrosamente caliente y libre de cualquier cuento que se cubrió accidentalmente según sea necesario. para una microinyección de ARN de doble cadena, cargue un microneedle con la solución específica de trabajo de ARN de doble cadena específica de genes como se ha demostrado.
Enrojecer el émbolo de una jeringa de microinyección controlada manualmente y cargue la aguja en el sistema de microinyección. Coloque la larva inmovilizada bajo el microscopio estéreo de manera que el lugar de inyección esté alineado con la trayectoria de la aguja de microinyección en un ángulo relativamente plano. Utilice el micromantenidor para mover cuidadosamente la punta de la aguja en la larva y aplicar presión lenta y cuidadosamente a la jeringa, ajustando la presión de inyección de acuerdo con el movimiento del líquido de inyección de color en la aguja según sea necesario.
Cuando se haya inyectado todo el ARN, utilice fórceps blandos para liberar la larva de la agarosa y colocar la larva en un nuevo recipiente de agua a temperatura ambiente a 25 a 28 grados centígrados y un ciclo de 14 horas de luz de 10 horas de oscuridad. En este análisis representativo se derribaron tres genes diferentes en una variedad de diferentes etapas de desarrollo del escarabajo de buceo T.marmoratus. La interferencia del ARN se realiza como se demuestra mediante la inyección de ARN de doble cadena en una etapa muy temprana de la embrióngénesis.
Algunos de los embriones no sobreviven al proceso y se vuelven necróticos. En estas imágenes controlan individuos y un individuo con un color de ojos ligeramente más claro se puede observar. En este individuo, un derribo más severo en el que las mentiras más ventrales del cúmulo están completamente sin pigmentar, pero los aliados do todavía muestran algo de pigmentación se puede observar.
Aquí se muestra un ejemplo de otro individuo con pérdida de pigmento esencialmente completa en todos los ojos. Lac2 derribado en larvas resulta en una cutícula menos pigmentada, individuos adultos más ligeros con alas algo deformadas probablemente debido a la suavidad inusual del tejido también se obtuvieron. Asegúrese de mirar atentamente para observar de cerca sus animales inyectados sobre una base diaria y para eliminar inmediatamente cualquier individuo muerto.
El poder de esta técnica es que se puede aplicar a los genes de muchos organismos diferentes. Esta técnica también se ha aplicado ampliamente y con éxito a la biología del desarrollo evolutivo.
