Esta investigación fue apoyada por R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) y los fondos de inicio de UT Southwestern (JPM).

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional del sudoeste UT, y se eligieron con el fin de minimizar el estrés, molestias, y dolor experimentado por los animales de experimentación. 1. Cámara Disección Una cámara de disección de encargo y pequeña, tablón plástico fino se requieren para obtener los mejores resultados (Figura 1). Construir o obtener una cámara de este tipo antes de intentar este protocolo. 2. Soluciones de disección <ol><li> Preparar 1 L de estándar de líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) para su uso en los pasos 3.22 a 5.4. Añadir NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO3 25 mM, NaH 2 PO 4 1,25 mM, mio-inositol 3 mM, piruvato de sodio 2 mM, ascorbato de sodio 0,4 mM, y glucosa 25 mM a 1 l de agua libre de pirógenos. </li><li> Prepare el LCRa disección inicial (200 ml) parautilizar en los pasos 3.3 a 3.22. Tomar 200 ml de Estándar LCRa y aumentar la concentración de MgCl 2 por 9 mM mediante la adición de 0.366 g de MgCl2 hexahidratado. </li><li> Preparar la solución estándar de Ringer para llevar a los estímulos a la VNO a través de la cánula para el uso en los pasos 04.11 a 05.04 que contiene NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 2 mM, NaHCO3 25 mM, HEPES 10 mM, glucosa 10 mM. </li><li> Burbuja el 0,8 L de LCRa estándar y 0,5 L de Ringer con 95% de O 2, 5% de CO 2 de gas en un baño de agua a 37 ° C durante un mínimo de 15 min hasta su uso. </li><li> Burbuja de los 200 ml de LCRa disección inicial con 95% de O2, 5% de CO 2 gas en hielo durante 15 a 20 min, hasta que llega a 4 ° C. </li></ol> 3. Disección primaria <ol><li> Prepare el área de disección. Coloque tres platos de 35 mm de Petri, oxigenada LCRa, tijeras de decapitación, curvas tijeras de disección, disección recta tijeras, fórceps Adson, un cuero cabelludo # 11el mango y la hoja y una hoja de afeitar en el hielo. </li><li> Después oxigenada LCRa se ha enfriado a 4 ° C, profundamente anestesiar al animal en una cámara de desecación con 2-5 ml Isothesia (99,9% isofluorano). Realizar pruebas de arrastre de la cola y los pies para asegurarse de que el animal está profundamente anestesiado. </li><li> Una vez que se confirmó la anestesia profunda, decapitar al animal e inmediatamente colocar la cabeza en una placa de Petri llena de la LCRa disección refrigerada. NOTA: Sumergir el tejido en la disección fría LCRa para mantenerlo fresco durante todo el procedimiento cuando no esté en uso. </li><li> Retire el aspecto inferior (ventral faringe, mandíbula inferior y la lengua) con unas tijeras curvas. </li><li> El uso de fórceps Adson deglove (cáscara) de la piel superficial y las inserciones musculares del cráneo. Pelar el cuero cabelludo de caudal a rostral hasta el único sitio de unión está en los dientes frontales. Cortar el tejido en el punto de unión utilizando unas tijeras curvas. Quitar los ojos, sujetándola con pinzas y tire de ella fuera de la preparación. Noído el final de la técnica de disección, evitar el exceso de fuerza en el cartílago nasal delicada utilizando las pinzas de Adson con inserciones musculares libres de los huesos de la mandíbula superior. NOTA: Desconecte el cuero cabelludo de la parte caudal del cráneo con tijeras rectas. </li><li> Con las tijeras rectas, cortadas por la línea media del cráneo de caudal a rostral hasta que las puntas de las tijeras son de unos pocos milímetros en los huesos frontales (justo antes del seno rinal). </li><li> Retirar los huesos parietal y frontal del cráneo usando fórceps Adson. NOTA: Las piezas del hueso frontal a menudo permanecer unidos a los huesos nasales caudal al seno rinal. Retire las piezas con cuidado de no tocar los bulbos olfatorios. </li><li> Utilice el bisturí para realizar un corte coronal a través del frontal mm caudal del lóbulo 2 a los senos y luego retire el caudal cerebro para el corte. Asegúrese de que la punta de los contactos de bisturí del contorno óseo del cráneo ventral para cortar por completo el tejido posterior. NOTA: Esto permiteeliminación de la mayoría del cerebro sin poner la tensión mecánica en las vías olfativas laterales o los bulbos olfatorios. </li><li> Retire los aspectos caudales expuestas de cráneo ventral con tijeras rectas. Deje los senos y el tejido nervioso restante. </li><li> Retire el arco cigomático y los músculos faciales en el lado derecho anatómico del cráneo con unas tijeras rectas </li><li> Gire el hocico largo (lado ventral hacia arriba) para exponer el techo de la boca. </li><li> Corte y retire el paladar inmediatamente caudal a los incisivos. Para ello, la inserción de la punta de la hoja de bisturí bajo el paladar paralelo al techo de la boca y luego mover la pala hacia los incisivos. </li><li> Sujete el liberado (rostral) borde del paladar con fórceps Adson y quitar tirando en sentido caudal. </li><li> En el lado izquierdo anatómica del cráneo, utilizar la hoja de bisturí para extender los agujero palatino caudalmente, a partir de las pequeñas agujero cerca de los molares. Lograr esto mediante la inserción de la punta del bisturí blades en el vacío cerca de los molares y la rotación de la muñeca. NOTA: Tenga mucho cuidado de utilizar sólo la punta de la hoja - un corte profundo puede dañar el tejido septal. </li><li> Con la punta de la hoja de bisturí, cortado de los agujero palatino a través de los incisivos, a partir rostral a la anatómica órgano vomeronasal izquierda. Utilice varios cortes de puntuación. No dañe el tejido septal y los nervios vomeronasal insertando la hoja demasiado profundo. </li><li> Girar el tejido de modo que el cráneo dorsal está orientada hacia arriba y luego orientar la cuchilla de la maquinilla de afeitar recta vertical (paralelo a la línea media) en el extremo caudal de la preparación. </li><li> En el borde ventral del tejido, toque el filo de la cuchilla de afeitar inmediatamente a la izquierda de la línea media. Agite suavemente la hoja y moverse a lo largo del foramen palatino (izquierdo cortado región introducida en el paso 3.14). </li><li> En el borde dorsal del tejido, coloque el borde de corte de la maquinilla de afeitar inmediatamente a la izquierda de la línea media (menos de 1 mm). </li><li> Custodiala cuchilla paralela a la línea media, a oscilar la cuchilla de afeitar lentamente con la presión hacia la parte anterior del tejido. Observe la resistencia en la lámina cribosa. Pare inmediatamente después de romper esta resistencia. NOTA: En este punto, el hemisferio derecho se afloja desde el hemisferio izquierdo. La conexión sólo queda es entre los hemisferios a lo largo de la dorsal del hocico por delante de la lámina cribosa. </li><li> Separe los hemisferios agarrando ellos cerca de los lados caudales con los dedos enguantados y suavemente girando lateralmente y anteriormente. NOTA: Este paso es una fuente de variabilidad experimental, especialmente en ratones con hocicos desviados o frágiles (por ejemplo, los ratones de más edad). Además, al intentar hacer girar los hemisferios de distancia el uno del otro, si se encuentra una fuerte resistencia puntuación de la hocico dorsal (anterior a la lámina cribosa) para debilitar los tejidos conectivos. Al hacerlo, tenga mucho cuidado de no introducir el bisturí profundamente, lo cual puede dañar el ti septalncidencia y nervios vomeronasal. </li><li> Aplique una pequeña cantidad (50 a 100 l) de goma de tejido a la tabla y colocar suavemente el borde lateral del hemisferio derecho en la cola utilizando fórceps Adson. Retire el exceso de humedad de la cara lateral de la preparación con una toalla de papel para evitar la polimerización prematura de pegamento y la adherencia suelta a la plancha. NOTA: Aplicar unas pocas gotas de la LCRa disección refrigerados en la muestra para acelerar la polimerización de pegamento después de tejido se coloca en la cola. Esto asegura que el tejido se mantiene firmemente retenida a la plancha. </li><li> Colocar una pequeña cantidad (3-5 mm de diámetro, 2 mm de profundidad) de grasa de vacío en el medio de la cámara de disección secundaria y colocar el lado de la plancha opuesto el tejido firmemente contra la grasa. Llenar inmediatamente la cubeta de disección con LCRa disección fría, traslado a la zona de disección fina y comenzar la perfusión con LCRa estándar oxigenada. Oriente el tablón para que el bulbo olfativo está directamente en elcorriente de LCRa estándar oxigenada. </li></ol> 4. Disección Secundaria <ol><li> Retire cualquier contralateral (izquierda) bulbo olfatorio visible o tejido cortical de la preparación utilizando unas pinzas finas. Apriete juntos los pinzas finas (formando una punta roma semi), y luego se coloca en la parte dorsal y caudal del tejido cerca de la línea media. Pase suavemente el fórceps pellizcados en la línea media, descamación del tejido lejos del hemisferio derecho lentamente en movimiento anterior. Quite todo el tejido contralateral, incluyendo el tejido bulbo olfatorio contralateral. Tenga mucho cuidado de no apuñalar a través del tejido, que puede causar daños en el AOB o el nervio vomeronasal. </li><li> Observe la duramadre blanco a lo largo de la superficie dorsal / medial del bulbo olfatorio. Tear este duramadre lo largo del borde dorsal / caudal del bulbo olfatorio agarrando en la parte blanca de la duramadre con dos pares de pinzas finas y tirar de ellos lejos de ese punto. La duramadre es fuertementeenvuelto alrededor de los bulbos olfativos, y puede fácilmente cortar en sí a través del tejido mientras está siendo retirado. Evitar daños en la superficie medial del bulbo olfatorio y la propia AOB. NOTA: Si la duramadre resiste desgarrar fácilmente en este punto, introducir un pequeño corte con tijeras de disección de punta fina de primavera para facilitar la separación. </li><li> Poco a poco y con cuidado retire la corteza frontal con unas pinzas finas, sin dañar los bulbos olfatorios subyacentes. Observar una colección de vasos sanguíneos que aparecen como una red semitransparente inmediatamente caudal a la AOB. Eliminar a esta red con unas pinzas finas para facilitar la penetración del electrodo en experimentos electrofisiológicos. Sujete la red con pinzas, ya que se separa de la AOB durante la retracción corteza frontal y retírela tirando en sentido caudal y medial, con cuidado de no tocar la AOB. Una vez que la corteza frontal se ha separado de los bulbos olfatorios, retírelo cortando con unas pinzas ventral y posterior a la AOB. NOTA: Tenga extreme cuidado con absorción neta, ya que si se hace demasiado áspero la capa glomerular puede resultar dañado. </li><li> En la cavidad nasal contralateral expuesta, eliminar cualquier tejido septal contralateral restante (hoja endeble amarillento que contiene vasos sanguíneos) usando las pinzas finas. Agarre el tejido en la región caudal / dorsal (cerca del hueso septal) y tire / levantar el tejido hacia el lado anterior. NOTA: El tejido septal contralateral se puede quitar de forma inadvertida durante el paso de hemisección (Paso 3,20). En tal caso, observar un blanco, el cartílago septal avascular y el hueso septal vascularizado ligeramente transparente. Si este es el caso, el paso 4.4 se puede omitir. </li><li> Retire con cuidado el contralateral VNO ejecutando un solo punto de las pinzas finas entre el cartílago septal y el &quot;ala&quot; VNO (una fina pieza de tejido óseo que se extiende a lo largo del borde dorsal de ambos VNOs. <ol><li> Tras el desprendimiento del ala del cartílago, mueva la punta del fórceps ventralmenteen el OVN contralateral cerca de la línea media. Repita este paso en varios lugares a lo largo del eje de caudal / rostral del contralateral VNO para aflojarla, lo que le permite ser retirado agarrando con una pinza y el levantamiento de distancia. </li></ol></li><li> Preparar para eliminar el cartílago septal haciendo un corte en el borde ventral / caudal (en el que se estrecha a una tira avascular blanco a lo largo del borde ventral del hueso septal) con unas pinzas finas. </li><li> Quitar el cartílago septal pellizcando juntos las pinzas finas para hacer una punta roma semi. Identificar el corte realizado en el paso 4.6, inserte el fórceps pellizcados detrás (lateral) a la corte, a continuación, levante lentamente el cartílago lejos del tejido septal y procediendo rostral. NOTA: No destruir el tejido septal subyacente. Como se levanta el cartílago, observe la hoja subyacente de estiramiento del tejido septal debido a adherencias laxas al cartílago. Un movimiento periódico, suave y estable de las pinzas finas pellizcados por este sitio de una flojadhesion puede facilitar en gran medida la separación exitosa de las dos estructuras. </li><li> Use un par de pinzas # 3 con una punta doblada para retirar el hueso septal. Enfoque el hueso septal en un ángulo casi paralelo al plano del hueso septal. Inserte el diente curvo entre el tejido y el hueso del tabique septal. Sujete el hueso con las pinzas y suavemente mover la columna vertebral y hacia atrás hasta que las grietas cerca de la lámina cribosa. NOTA: En algunos casos, el hueso septal resistirá rompiendo cerca de la lámina cribosa. En este caso, utilice unas pinzas finas para anotar suavemente el hueso septal lo largo de la / eje ventral dorsal justo anterior a la placa cribiforme, a continuación, repita el paso 4.8. </li><li> Quitar el cartílago rostral blanca justo al VNO apretando con un par de pinzas finas en la entrada y tirando rostral con otro par de pinzas finas. </li><li> Fije la cánula de poliimida a un dispositivo de perfusión rápida e iniciar el flujo de la solución de Ringer (0,1-0,3 ml / min) a través de la cánula de poliimida.NOTA: Caudal Medida con un, metro de flujo pequeño volumen en línea. El uso del dispositivo de conmutación de estímulo neumática controlada por ordenador reduce los cambios de caudal durante la estimulación. Compare las respuestas neuronales para poner a prueba los estímulos con respuestas a un estímulo maqueta (controlar la solución de Ringer) para asegurar que las respuestas son específicas de estímulo. </li><li> Oriente la cánula paralelo a la entrada VNO. Cuando la cánula está satisfactoriamente paralelo a la entrada VNO, ver como la presión de salida hace que el VNO a &quot;inflar&quot;, que conduce a la evacuación del vaso sanguíneo. Inmediatamente inserte la cánula en el OVN, manteniendo el ángulo de la constante de la cánula de manera que permanece paralelo a la abertura VNO. NOTA: Puede ser útil para mantener la cánula con un par de pinzas finas contra la plancha de plástico y usar otro par de pinzas finas para inclinar el extremo de la cánula ligeramente hacia arriba. Si uno coloca inadvertidamente la cánula detrás del VNO, el flujo de salida también puede provocar que el vaso sanguíneo VNOpara evacuar, lo que lleva a la impresión se llevó a cabo una canulación correcta. La ubicación apropiada se puede confirmar mediante la incorporación de un colorante en la solución de Ringer. Cuando la cánula se coloca correctamente, el colorante sólo debe salir por la entrada VNO. Además, se puede confirmar la colocación adecuada, garantizando que la cánula es fácilmente visible a través de la cara medial semi-transparente del OVN. </li><li> Mueva el tablón plástico lentamente hasta que el AOB está en el flujo directo de la norma LCRa, teniendo cuidado de no desplazar la cánula del VNO. La disección es completa y valoración de la función fisiológica puede comenzar de inmediato. Paso 5 describe brevemente un enfoque para hacer una evaluación de este tipo. </li></ol> 5. Evaluación <ol><li> Penetrar en la superficie de la AOB con un microelectrodo de vidrio de borosilicato 2-4 MΩ unido a un amplificador extracelular y el osciloscopio. </li><li> Avanzar lentamente el microelectrodo a una profundidad de 100-200 micras de lasuperficie a una velocidad de 50 m / min. NOTA: A esta profundidad del tejido, uno encontrará acción espontánea posibles formas de onda ocasionales ejemplificadas por breves desviaciones agudas, (~ 1-2 mseg) en la tensión de microelectrodos. </li><li> Al encontrarse con un potencial de la forma de onda de acción, detener el avance de la microelectrodos. </li><li> Observar y / o grabar la tasa potencial de acción, mientras que el cambio de la solución de entrega de estímulos de control de Ringer a un conocido activador de la actividad VSN (por ejemplo, solución de Ringer que contenía KCl 50 mM). Si la disección tuvo éxito, se puede observar un cambio de estímulo-dependiente en la acción tasa potencial o potencial de campo local. NOTA: No todas las neuronas AOB responderán a cada estímulo con un aumento en la tasa de disparo (incluyendo la solución de Ringer que contiene 50 mM de KCl). Una disminución de estímulo-dependiente en la tasa de disparo también indica la conectividad funcional y una disección de éxito. En el caso de que se encuentran dos o más neuronas queno responden a la estimulación del OVN, o si no se observan los potenciales de acción después de múltiples penetraciones de electrodos, esto sugiere una disección sin éxito. Si este es el caso, una nueva disección puede ser iniciado en el Paso 3. </li></ol>

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Los autores no tienen conflictos de intereses significativos a revelar.

La preparación VNO-AOB ex vivo se describe en este protocolo es una alternativa útil a anestesiada in vivo 5-7 y rebanada en vivo aguda 17 experimentos de la función AOB. A diferencia de los experimentos rebanada AOB agudas, que también exponen a los elementos del circuito de registros electrofisiológicos y ópticas, esta preparación se reserva todos los aferentes sensoriales y las conexiones intra-AOB. Aunque esto también puede decirse de anestesiado en los enfoqu...

El procesamiento sensorial en el cerebro de los mamíferos normalmente abarca múltiples circuitos neuronales conectadas recíprocamente-, cada uno de los cuales extrae los rasgos particulares de la información sensorial. En las vías sensoriales, procesamiento de la información temprana es vital para la percepción y el comportamiento normal. En el sistema olfativo accesorio (AOS), el bulbo olfativo accesorio (AOB) es el circuito de los nervios principales que une la periferia sensorial a las estructuras posteriores que determinan el equilibrio hormonal 1,2, la agresión 3, 4 y la excitación. Como tal, el procesamiento de la información dentro de este circuito está fuertemente ligada a los cambios en el comportamiento animal. El bulbo olfativo accesorio se encuentra en ratones y ratas en la cara dorsal / caudal / posterior del bulbo olfatorio principal (MOB) debajo de la densa, vascularizado sinusal rinal. La AOB recibe inervación aferente de los axones de las neuronas sensoriales vomeronasal periférica (VSNS) que residen en el órgano vomeronasal (OVN), un Small tubo y sin salida en el hocico anterior justo por encima del paladar blando. Estos axones atraviesan la delicada hoja de tejido septal en el límite medial de los pasajes nasales. Varios estudios han investigado AOB respuestas neuronales a las fuentes de olores adicionales opcionales (tales como la orina del ratón) in vivo utilizando ratones anestesiados 5-7 o animales libremente-Explorando 8. La heroica anestesiados estudios in vivo que participan (a) traqueotomía para asegurar una anestesia profunda y prevenir la aspiración del líquido estímulos 5-7, (b) la estimulación del ganglio simpático cervical 6 o canulación directa del órgano vomeronasal 5,7 introducir olores volátiles y (c) craneotomías con o sin ablaciones del lóbulo frontal para permitir el avance del electrodo en la AOB 6. Awake / comportándose estudios 8-10 implantación quirúrgica involucrados de microdrive. En suma, estos paradigmas experimentales son de gran alcance, pero extremadamente difícil y a menudo requieren anestesia. (ex vivo) con cierto éxito 11-15. Debido a que las conexiones entre el OVN y AOB permanecen ipsilateral, y porque el tejido septal línea media puede estar expuesto a superperfundido oxigenada en un solo hemisferio, Hemos tratado de desarrollar un enfoque de este tipo in vivo de un solo hemisferio ex para aislar estas estructuras y manteniendo su conectividad funcional. Recientemente hemos tenido éxito en el logro de este objetivo 16. Esta preparación mantiene tanto el OVN y AOB vivo y funcionalmente conectado por lo menos 4 - 6 de HR porque tanto los axones (a lo largo de la línea media tejido septal suave) y AOB son relativamente poco profundas &lt;600 micras características que son accesibles a superfused líquido cefalorraquídeo artificial oxigenada ( LCRa). Esta VNO-AOB ex vivo preparación permite la introducción de estímulos controlados en el VNO a través de una cánula delgada, yacceso visual directo a la pequeña AOB para la colocación de electrodos específica y / o microscopía de fluorescencia en vivo. Este método es ventajoso si se desea estudiar estos circuitos en ausencia de anestésicos. Debido a que este enfoque corta conexiones centrífugas, que no se adapta bien a las investigaciones sobre la modulación de la función centrífuga AOB. El VNO-AOB ex vivo preparación es difícil de aprender, pero una vez logrado produce una plataforma fiable sobre la que investigar la organización del circuito, procesamiento de información, y la plasticidad neural en este circuito sensorial de gran alcance.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Straight Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#3 Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Carbon Steel Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Chamber</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Fig. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning Silicon Vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Biologie Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.0045&#34; Polyimide Tubing</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>823400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45505-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two ton epoxy</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5E157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveBank Pressurized Perfusion Kit</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>09-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink digital/manual controller</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo preparations of the intact vomeronasal organ and accessory olfactory bulb

El sistema olfativo accesorio ratón (AOS) es una vía sensorial especializado para detectar olores volátiles sociales, feromonas, y kairomones. El primer circuito de los nervios en la vía de AOS, llamado el bulbo olfativo accesorio (AOB), juega un papel importante en el establecimiento de comportamientos sexuales típicos como la agresión territorial y el apareamiento. Este (&lt;1 mm 3) Circuito pequeño posee la capacidad de distinguir los estados de comportamiento únicas, tales como el sexo, la tensión y el estrés a partir de pistas quimiosensoriales en las secreciones y excreciones de sus congéneres. Mientras que la organización compacta de este sistema presenta oportunidades únicas para el registro de grandes porciones del circuito a la vez, la investigación de procesamiento sensorial en el AOB sigue siendo un reto, en gran parte debido a su ubicación experimentalmente desventajosa en el cerebro. Este sentido, demuestran una disección de múltiples etapas que elimina la AOB intacta dentro de un solo hemisferio del cráneo del ratón anterior, dejando a conectariones a ambos los vomeronasal neuronas sensoriales periféricas (VSNS) y circuitos neuronales locales intactas. El procedimiento expone la superficie AOB para dirigir la inspección visual, facilitando electrofisiológico y grabaciones ópticas de elementos de circuito AOB en ausencia de anestésicos. Al insertar una cánula delgada en el órgano vomeronasal (OVN), que alberga los VSNs, se puede exponer directamente a la periferia a los olores y feromonas sociales durante la grabación de la actividad aguas abajo en el AOB. Este procedimiento permite a las investigaciones controladas en el procesamiento de información del AM, que puede arrojar luz sobre los mecanismos que vinculan la exposición de feromonas a cambios en el comportamiento.

Lograr el éxito con esta preparación requiere práctica extensa, y tiene varias fases en las que puede fallar. Hay que esperar a requerir múltiples intentos antes de tener éxito. Se requiere que la cámara de la disección de encargo para la realización exitosa de este protocolo, y se debe obtener antes de comenzar las etapas posteriores de la disección. El diseño de la cámara presenta en la Figura 1 es suficiente para este propósito, y puede estar hecho de plástico relativamente de bajo costo...

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Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

El bulbo olfativo accesorio ratón (AOB) ha sido difícil de estudiar en el contexto de la codificación sensorial. Este sentido, demuestran una disección que produce un vivo preparación ex en el que las neuronas AOB permanecen funcionalmente conectados a sus entradas de periferia, facilitando la investigación sobre el procesamiento de información de las feromonas del ratón y kairomones.

Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

10.7K vistas.  UT Southwestern Medical Center.  El bulbo olfativo accesorio ratón (AOB) ha sido difícil de estudiar en el contexto de la codificación sensorial. Este sentido, demuestran una disección que produce un vivo preparación ex en el que las neuronas AOB permanecen funcionalmente conectados a sus entradas de periferia, facilitando la investigación sobre el procesamiento de información de las feromonas del ratón y kairomones. 

Video: Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Grabaciones multielectrodo matriz del epitelio vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Investigación

Neurociencias

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Orientación neuronas del bulbo olfativo uso combinado En Vivo La electroporación y Gal4 basado reforzador líneas trampa de pez cebra

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Actividades de imagen de olores provocados en el bulbo olfatorio de ratón utilizando reflexión óptica y señales de autofluorescencia

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología<em&gt; En Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Observación del Movimiento ciliar de las células epiteliales del plexo coroideo<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Grabación de la actividad neuronal inducida por temperatura a través de la supervisión de cambios de calcio en el bulbo olfatorio de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Imunocoloración Cuádruple del Bulbo Olfativo para la Visualización de Códigos de Identidad Molecular del Axón Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...