Introducción Los microARNs se han convertido en importantes reguladores de la expresión de genes que modulan la actividad de muchos procesos biológicos importantes. Con más de 700 miRNAs humanos identificados hasta la fecha 1, no es sorprendente que las mutaciones y la regulación inadecuada de los miRNAs se han relacionado con una variedad de desórdenes fisiológicos como el cáncer y las enfermedades del corazón 2,3. Estudios recientes han demostrado que la mayoría de los sitios de unión reguladores miRNA se encuentran en 3&#39;UTRs 4,5, y algunos investigadores han estimado que hay cientos de objetivos por miRNA en la de 6 celdas. Dada la importancia biológica de miRNAs, el gran número de miRNAs que existen y el gran número de objetivos para cada una de ellas, es fundamental que los investigadores son capaces de identificar de forma fiable los objetivos de miRNAs endógenos, de preferencia en plataformas susceptibles de alto rendimiento estudios. Mientras que la utilización de herramientas computacionales como miRBase, TargetScan y PicTar 1,6,7 es una forma poderosa para generar listas de mRNA objetivos putativo de cualquier miRNA, las predicciones no son lo suficientemente precisos para confiar en ella solo 8. Por lo tanto, los investigadores también aprovechar una serie de enfoques experimentales para identificar los objetivos de novo o para validar los objetivos previstos. Muchos equipos se han basado en medidas de alto rendimiento del estado de equilibrio los niveles de ARNm y proteínas para identificar los genes para que los cambios de expresión cuando la actividad miRNA es perturbada 4,9,10. Estos cambios son, sin duda, biológicamente significativas y representan un primer paso importante, sin embargo, la medición de cambios en la expresión general no distingue entre efectos directos de un miRNA en la transcripción y los efectos indirectos de señalización o aguas abajo. Otras herramientas de gran alcance que proporcionan evidencia directa de ARNm-miRNA interacciones son la cromatina immunoprecipitation (CHIP) estrategias que vinculen cruzada proteínas Argonauta (y por lo tanto el complejo RISC) para miRNAs y ARNm, aunque la identificación de los socios que interactúan no indican de inmediato los efectos funcionales de un evento tan vinculante 5,11. Por lo tanto, el reportero 3&#39;UTR-ensayos que proporcionan pruebas funcionales para el efecto un miRNA en un determinado UTR se han convertido en un componente importante de un estudio a fondo miRNA. Tales células de datos basado en ensayo en conjunto con las predicciones de destino de cálculo o expresión y datos de la proteómica proporciona una fuerte evidencia de que un 3&#39;UTR particular es directamente regulada por el miARN de interés. En un ensayo de 3&#39;UTR-reportero, la 3&#39;UTR de un gen de interés se fusiona con el fin de un gen reportero de luciferasa. Si el 3&#39;UTR es un objetivo de un miRNA, la estabilidad transcripción reportero y / o la eficiencia de traducción va a cambiar con la variación en la concentración de miRNA funcional. Así que a diferencia de la transcripción de sólo basadas en ensayos, los ensayos de reportero ayudar a identificar problemas en ambos ARNm de estado estable y los niveles de proteína. Sistemas reportero también puede ser usado para estudiar los efectos funcionales de un sitio de mutagénesis miARN putativo de unión en una 3&#39;UTR para confirmar que sí es necesario para la interaction8. Y si bien estudios a gran escala utilizando arrays de expresión, las técnicas de proteómica y chip Argonaute proporcionar valiosos datos en todo el genoma de un pequeño número de condiciones experimentales, ensayos basados ​​en células periodista son los más susceptibles de ampliación para el estudio de miRNA-3 &#39; interacciones UTR en cientos o miles de condiciones que puedan resultar necesarias para la selección de alto rendimiento de pequeñas moléculas u otros efectores basados ​​en la biblioteca. Muchos científicos han aplicado la tecnología reportero de ensayo para el estudio de las interacciones 3&#39;UTR miRNA. Sin embargo, con la idea de que muchos miRNAs cada cientos de destino de las transcripciones diferentes, ha sido difícil para los investigadores que utilizan este método de gran alcance en una escala de alto rendimiento debido a los pasos de la clonación, la validación y la optimización para la creación de miles de diferentes 3&#39;UTR- vectores reportero son a menudo un coste prohibitivo. En un esfuerzo para que la pequeña y gran escala reportero 3&#39;UTR estudios al alcance de cualquier investigador, hemos creado una colección de todo el genoma de los humanos 3&#39;UTRs pre-clonado en el sistema altamente optimizado LightSwitch ensayo de luciferasa. El sistema también incluye reportero validado vectores de control, un conjunto de más de 700 construcciones de miRNA sintéticos reportero objetivo para su uso como controles positivos, y una serie de protocolos experimentales estandarizados. Utilizando el siguiente protocolo, se puede preguntar si un 3&#39;UTR humano en particular es un objetivo de miRNA de interés. Los pasos críticos en el flujo de trabajo son el diseño experimental, la transfección de reportero construye y reproduce miRNA, ensayos de luciferasa reportero, y análisis de datos. Para el diseño experimental, es importante seleccionar cuidadosamente una línea celular transfectable, reportero construcciones experimentales y de control, e imita miRNA y los controles no objetivo. Comunes altamente transfectable adhlíneas celulares como erent HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, y otros a menudo funcionan bien con este protocolo. Notas importantes en el diseño experimental El sistema de ensayo Luciferase LightSwitch es un sistema reportero totalmente optimizado que incluye construcciones GoClone utilizando el gen de la luciferasa RenSP y reactivos LightSwitch luciferasa de ensayo. Utilizar todos los componentes del Sistema de LightSwitch como se recomienda para obtener óptimos resultados reportero de ensayo. Co-transfección de los oligos / plásmidos con construcciones de conmutación reportero GoClone reduce en general las señales de la luciferasa de una manera no específica. Por lo tanto, es importante llevar a cabo la transfección combinaciones siguientes: único periodista, el reportero + no de metas de miRNA de control, y el reportero + miRNA específico. Nuestro vector empty_3UTR (promotor fuerte, no UTR) proporciona un alto nivel de la señal de luciferasa y sirve como un control positivo de la eficiencia de transfección, y un objetivo sintético miRNA vector reportero puede servir como un control positivo para imitar la actividad. Además, se recomienda utilizar los controles GoClone 3&#39;UTR de limpieza y controles aleatorios para separar con precisión la secuencia específica frente a los efectos no específicos. Estudio de su protocolo, y siempre que sea posible hacer mezclas maestras para disminuir la variabilidad en los datos debido a un error de pipeteo o evaporación. Este protocolo utiliza DharmaFect reactivo de transfección Duo (Dharmacon). Día 1 CONSEJO IMPORTANTE: Elige tu línea celular inteligente. Para obtener los mejores resultados, utilice una línea celular que se sabe que es transfectable. También hemos encontrado que la respuesta medible de un reportero de 3 &#39;UTR de un miRNA mímica se atenúa en las líneas de células con altos niveles endógenos de que miRNA particular. Si usted no sabe la cantidad de miRNA su línea celular expresa, intente objetivo microARN sintéticos SGG, que mide indirectamente la abundancia de un miRNA particular en una célula, así como para informarle sobre el rango dinámico de su ensayo. 1. Las células para producir semillas de ≥ 80% de confluencia en el momento de la transfección. <ol><li> Las células de las semillas en un 96-así placa blanca TC en el volumen total de 100μl. </li><li> En la semilla en paralelo, el número adecuado de células en una placa transparente de 96 pozos de evaluación de confluencia. </li></ol> CONSEJO IMPORTANTE 1: Confluencia es clave para lograr buenos resultados en un experimento de imitar. De caída óptima, las células deben ser 100% confluentes en el momento de la transfección. CONSEJO IMPORTANTE 2: Utilice las células bajo el paso para obtener mejores resultados. Células que han sido pases muchas veces tienden a dar los datos ruidosos transfección. Día 2 Prepare las construcciones GoClonereporter y miRNAs, entonces transfectar a las células confluentes. 2. Prepare Construye <ol><li> Constructos deshielo GoClone (ADN plásmido) a temperatura ambiente. Mezclar bien. </li><li> Centrífuga para eliminar la condensación de la tapa. </li></ol> 3. Prepare micro RNAs <ol><li> Descongele los microRNAs (imita y controles específicos no objetivo) a temperatura ambiente y centrifugar para eliminar la condensación de las tapas. </li><li> Diluir a una concentración de trabajo de 2 M en agua libre de RNasa. </li></ol> Además de un miARN experimental imitar siempre incluyen un control de miRNA no objetivo. Co-transfección de un plásmido y un pequeño ARN oligo conduce a la disminución de la señal de la transfección del plásmido solo. Incluir uno o más controles positivos. Considere el uso de uno de los cientos de vectores sintéticos miRNA reportero objetivo en el catálogo de la SGG. Incluir uno o más controles negativos o no específicas. SGG tiene una serie de controles de los cuales 3 &#39;UTRs de los genes de limpieza, los fragmentos al azar y / o el control de vacío (sin inserto UTR). El uso de uno o más de estos controles junto a una construcción experimental le permitirá normalizar los efectos no específicos atribuibles a la sobre-expresión de su miRNA específico o la falta de control de orientación. 4. Prepare transfecciones <ol><li> Para cada transfección se combinan los siguientes reactivos de un único ensayo: </li></ol> Mezcla 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Individuales reportero GoClone: </td><td> 3,33 l </td></tr><tr><td> microRNA: </td><td> Varía * </td></tr><tr><td> Medio libre de suero: </td><td> a 10 l </td></tr></tbody></table> * La concentración efectiva de los miRNA puede variar de 10 nm-100 nm. Consulte al fabricante miRNA para la concentración apropiada. CONSEJO IMPORTANTE: No agregue demasiado imitar. Un rango razonable para imitar las concentraciones es 10-50 nm en la reacción 100uL final. Realizar al menos tres réplicastransfecciones te para cada tratamiento / UTR combinación e incluyen un volumen adicional para permitir la pipeta de error. Por ejemplo, multiplicar los volúmenes de reacción solo un 3,5 para obtener la mezcla de transfección para 3 pozos de transfección replicar incluyendo adicionales que permitan tomar error o evaporación. Por cada reportero, creado réplicas de los siguientes: único periodista, el reportero + no de metas de control y miRNA reportero + miRNA específico. Establecer transfecciones para el microRNA objetivo al mismo tiempo que para un control sin orientación. <ol start="2"><li> Conforman el DharmaFECT DUO (Dharmacon) mezcla de la siguiente manera para cada uno de transfección: </li></ol> Mezcla 2 <table border="1"><tbody><tr><td> DharmaFect Duo: </td><td> 0,15 l </td></tr><tr><td> Medio libre de suero: </td><td> 9,85 l </td></tr></tbody></table> La cantidad de DharmaFECT Duo a añadir puede ser la línea celular dependiente. Las cantidades indicadas son apropiadas para las células HT1080. Consulte la documentación del fabricante para determinar la cantidad adecuada para su línea celular. Consejo: Haga una mezcla de transfección grandes multiplicando el volumen por encima de por el número de periodistas, el número de repeticiones y el número de miRNAs para ser probados. Al calcular el importe de la mezcla de transfección de preparar, asegúrese de incluir una pequeña cantidad adicional para tener en cuenta los errores de pipeteo y evaporación. <ol start="3"><li> Dejar que la mezcla Duo DharmaFECT a incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. </li><li> Después de 5 minutos, añadir 10μL de la mezcla Duo DharmaFECT (Mezcla 2) a cada tubo ya preparado de 10 ul plásmido y / o miRNA (Mezcla 1). Cada tubo debe contener un volumen de 20μL por transfección replicar. </li><li> Incubar cada mezcla durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de 20 minutos, añadir 80 l de pre-calentado (37 ° C), libre de antibióticos, los medios de comunicación completa por replicar a cada tubo para un total de 100μL por transfección replicar. Un bloque de pozo profundo puede ser utilizado para la preparación de muchas repeticiones y las muestras de forma simultánea. Mezclar la solución con la pipeta hacia arriba y abajo. </li><li> Retire la placa de cabeza de serie de la incubadora. Compruebe que los elementos son al menos el 80% confluente. </li><li> Cuidadosamente con pipeta de los medios de comunicación de cada pozo. </li><li> Añadir 100μL de la mezcla de transfección (20 ul de ADN / reactivo mezcla + 80uL los medios de comunicación) a cada pocillo. </li><li> Coloque la placa en la incubadora durante la noche. </li></ol> No se exceda en incubar. La mayoría imita producirán resultados significativos en bona fide objetivos dentro de las 24 horas. El nivel de represión medible en 48 horas puede ser mayor, pero también lo hará el bien a la variabilidad del bien. Imitar los experimentos son más fáciles que los experimentos inhibidor. Mientras que la mayoría imita significativamente reprimir verdaderos objetivos dentro de las 24 horas, importantes de la represión atribuibles al inhibidor puede tomar 48 horas para ser medibles y casi siempre será menos pronunciado que el efecto de la mímica. Día 3 Nota: Los ensayos de luciferasa puede llevarse a cabo inmediatamente o las placas pueden ser congelados a -80 ° C (congelación generalmente se incrementa la lisis celular y la señal de luciferasa). Congelar y descongelar las células antes de ensayar para obtener mejores resultados. Recuerde dejar descongelar las células congeladas a temperatura ambiente antes de añadir LightSwitch ensayo. 5. Medir la actividad luciferasa con AssayReagents LightSwitch <ol><li> Retire la placa de la incubadora y llevar a temperatura ambiente. </li><li> Preparar los reactivos LightSwitch ensayo (kit para LS010, los protocolos de los tamaños de otro kit se pueden encontrar en línea): <ol><li> Sustrato 100X reconstituir añadiendo 100μL de sustrato solvente a un tubo de ensayo del sustrato liofilizado. Proteger de la luz y minimizar el tiempo a temperatura ambiente. Sustrato 100X se pueden almacenar a-20C por 2-tres semanas. Para mejores resultados, el uso de sustrato, una vez reconstruido. </li><li> Prepare la solución de ensayo por el deshielo botella de 10 ml de tampón de ensayo en un baño de agua a temperatura ambiente y añadir 100μL de sustrato 100X reconstituido antes de su uso. Mezclar bien. </li></ol></li><li> Use una pipeta multicanal para añadir 100μL de solución de ensayo LightSwitch (buffer + sustrato) directamente a cada muestra (que contiene células 100uL + medios de comunicación) en un plato blanco de 96 pozos. Si las células se cultivaron en otra placa o en formato botella, la transferencia de muestras a un plato blanco de 96 pozos en el volumen total de 100μL (medios de comunicación o PBS). </li><li> Cubierta de la placa, protegerlo de la luz, y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Si ensayar más de una placa, escalonar Además de la solución de ensayo de modo que cada placa se incuba durante 30 minutos antes de la lectura. </li><li> Lea cada bien durante 2 segundos en una placa de luminariasnometer (SpectraMax L o equivalente). </li><li> Calcular la caída mediante el cálculo de la relación señal luciferasa para construir cada uno de miRNA específico sobre la falta de control de orientación (luminiscencia = miARN específicos / no de metas de control). Utilizar los datos de la limpieza, al azar, y las construcciones vacías para el control de no-UTR los efectos del tratamiento específico. </li></ol> Resultados representante Objetivos 3&#39;UTR en la presencia de un miARN objetivo mostrar caída luciferasa. La caída de la actividad de reportero 3&#39;UTR-luciferasa por el let-7a se midió en las células HT1080 por la co-transfección de 100 ng de cada reportero construir con 20nm que-7a control de imitar o no objetivo, período de incubación de 24 horas, luego de leer el reportero luminiscentes señal utilizando reactivos LightSwitch luciferasa de ensayo. <img src="/files/ftp_upload/3343/3343fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. 3&#39;UTRs punción y ARID3B humanos son los blancos de los micro ARN let-7a. Las señales de los periodistas 3&#39;UTR humanos para la punción y genes ARID3B son significativamente derribado en la presencia de los micro ARN let-7a imitar mientras que las señales para la limpieza y orden aleatorio UTRs no lo son.

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Los autores son empleados de Genómica interruptores que hacen las herramientas y los reactivos que aparecen en este artículo. La producción de este artículo fue patrocinado por la Genómica del cuadro.

Hemos creado una colección de todo el genoma de la pre-humano clonado reportero 3&#39;UTR-construye para permitir que los estudios de las interacciones 3&#39;UTR miRNA en células vivas. Aquí hemos demostrado un método reproducible y de alto rendimiento para la imita miRNA co-transfección con 3&#39;UTR-periodistas con un sistema indicador de la luciferasa. Este método se basa en los investigadores que utilizan una línea de células altamente transfectable y perturbar la actividad miRNA con una técnica de sobre-expresión. Los investigadores que utilizan líneas celulares de mal transfectable puede considerar el uso de nuestro compañero reportero lentiviral 3&#39;UTR-colección creada en colaboración con Sigma (Misión 3&#39;UTR GoClones Lenti). Tratar las células con miRNA imita los resultados en un experimento sobre-expresión de tipo, y con dicho estudio, los investigadores deben tener en cuenta que esto puede o no representar las condiciones reales fisiológicas. Para abordar las preocupaciones sobre-expresión, los investigadores pueden utilizar los inhibidores de miRNA además imita a estudiar la interacción con dos tipos diferentes de perturbación 12-14. Una vez que los objetivos probablemente miRNA son identificados, los investigadores desean mutagenizar los sitios de unión miARN putativo para determinar si los sitios son necesarios para la interacción funcional. También se podría ampliar a las pruebas de cientos de diferentes UTRs objetivo potencial (Boutz). Además, si los investigadores están interesados ​​en cuanto a si el miRNA está afectando a la estabilidad de transcripción o traducción de eficiencia, los datos luciferase reportero se puede comparar con las medidas de los niveles de transcripción de estado estacionario. Cualquier cambio en la señal de luciferasa que no está asociado con un cambio proporcional en los niveles de transcripción se apuntan a un efecto sobre la eficiencia de la traducción. Finalmente, los investigadores pueden utilizar vectores reportero de crear una curva dosis-respuesta para comparar la sensibilidad relativa de UTRs diferente a los cambios en la concentración de miRNA 14.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Blanco placas de cultivo tisular (de 96 pozos de fondo sólido) </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td> Claro placas de cultivo tisular (96 pocillos) con tapa </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> LightSwitch reactivo de ensayo luciferasa </td><td> Interruptores </td><td> LS010 </td></tr><tr><td> DharmaFECT Duo Transfection Reagent (0.75mL) </td><td> Dharmacon </td><td> T-2010-02 </td></tr><tr><td> Placa de lámina de cinta aislante </td><td> E &amp; K Científico </td><td> T592100 </td></tr><tr><td> Placa transpirable precinto </td><td> E &amp; K Científico </td><td> T896100-S </td></tr><tr><td> Plate luminómetro </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax L </td></tr></tbody></table>

identifying targets of human micrornas with the lightswitch luciferase assay system using 3'utr-reporter constructs and a microrna mimic in adherent cells

Los microARN (miRNA) son importantes reguladores de la expresión génica y de desempeñar un papel en muchos procesos biológicos. Más de 700 miRNAs humanos se han identificado hasta el momento con cada una hasta cientos de mRNAs objetivo único. Herramientas informáticas, ensayos de expresión y la proteómica, y las técnicas de inmunoprecipitación de la cromatina basada en proporcionar pistas importantes para la identificación de los ARNm que son blancos directos de un miRNA particular. Además, el reportero 3&#39;UTR-ensayos se han convertido en un componente importante de los estudios a fondo miARN porque proporcionan pruebas funcionales y cuantificar los efectos de determinados 3&#39;UTR miRNA interacciones en un sistema basado en células. Para permitir que más investigadores para aprovechar reportero 3&#39;UTR-ensayos y para apoyar la ampliación de estos ensayos a nivel de alto rendimiento, hemos creado una colección de todo el genoma de los periodistas 3&#39;UTR luciferasa humanos en la luciferasa altamente optimizada LightSwitch Ensayo del sistema. El sistema también incluye sintéticos miRNA reportero construcciones de destino para su uso como controles positivos, varias construcciones reportero endógeno 3&#39;UTR, y una serie de protocolos estandarizados experimental. Aquí se describe un método para la co-transfección de cada reportero 3&#39;UTR-construye junto con un miRNA mímica que sea eficiente, reproducible, y es susceptible de análisis de alto rendimiento.

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Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Los microARN (miRNA) son importantes reguladores de la expresión génica y se ha demostrado que juegan un papel importante en numerosos procesos biológicos. Para comprender mejor las interacciones entre UTR miRNA, hemos creado una colección de todo el genoma de tres periodistas UTR luciferasa se combina con un nuevo gen de luciferasa y reactivo de ensayo, el sistema de interruptor.

Objetivos la identificación de los microARN humanos con el sistema de ensayo con luciferasa LightSwitch reportero 3&#39;UTR-Construye y microRNA un imitador de las células adherentes

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

identifying-targets-human-micrornas-with-lightswitch-luciferase-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

36.0K vistas.  SwitchGear Genomics. Los microARN (miRNA) son importantes reguladores de la expresión génica y se ha demostrado que juegan un papel importante en numerosos procesos biológicos. Para comprender mejor las interacciones entre UTR miRNA, hemos creado una colección de todo el genoma de tres periodistas UTR luciferasa se combina con un nuevo gen de luciferasa y reactivo de ensayo, el sistema de interruptor.

Video: Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

El estudio de biogénesis de la membrana con un ensayo de luciferasa basado en genes

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Investigación

Biología

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

En Fraccionamiento subcelular situ de células mamíferas adherentes y no adherentes-

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Ensayo clonigénicas: las células adherentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

La reprogramación de células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando el vector retroviral con las buenas prácticas agrarias

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Un procedimiento de detección química de glucocorticoides Señalización con un sistema indicador de pez cebra Larva luciferasa

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Un ensayo funcional para Gap Junctional examen; La electroporación de células adherentes de indio-óxido de estaño

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

La detección de los genes miARN objetivos en de alto rendimiento utilizando el ensayo 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.