Introdução MicroRNAs surgiram como importantes reguladores da expressão de genes que modulam a atividade de muitos processos biológicos importantes. Com mais de 700 miRNAs humanos identificados até agora 1, não é surpreendente que as mutações e regulação inadequada de miRNAs têm sido associados a uma variedade de desordens fisiológicas, tais como câncer e doenças cardíacas 2,3. Estudos recentes têm mostrado que a maioria dos miRNA reguladoras locais de ligação são encontrados em 3&#39;UTRs 4,5, e alguns pesquisadores estimam que há centenas de alvos por miRNA na célula 6. Dada a importância biológica dos miRNAs, o grande número de miRNAs que existem e do grande número de alvos para cada um deles, é fundamental que os pesquisadores são capazes de identificar com segurança as metas endógena de miRNAs, preferencialmente em plataformas passíveis de high-throughput estudos. Enquanto utiliza ferramentas computacionais como miRBase, TargetScan e PicTar 1,6,7 é uma maneira poderosa para gerar listas de alvos para qualquer mRNA putativo miRNA, as previsões ainda não são precisas o suficiente para ser invocada, por si só 8. Portanto, os pesquisadores também aproveitar uma série de abordagens experimentais para identificar alvos de novo ou para validar as metas previstas. Muitas equipes têm contado com alto rendimento medidas de níveis de steady-state mRNA ou da proteína para identificar genes de expressão que muda quando a atividade miRNA é perturbado 4,9,10. Tais mudanças são, sem dúvida, biologicamente significativos e representam um primeiro passo importante, no entanto medir mudanças na expressão geral não faz distinção entre os efeitos direto de um miRNA em uma transcrição e indiretos ou a jusante efeitos de sinalização. Outras ferramentas poderosas que fornecem evidência direta de miRNA-mRNA interações são cromatina-imunoprecipitação (CHIP) estratégias que as proteínas cross-link Argonaute (e, portanto, o complexo RISC) para miRNAs e mRNAs, apesar de identificar os parceiros interagindo não indicar imediatamente os efeitos funcionais de tal evento uma ligação 5,11. Assim, 3&#39;UTR repórter-ensaios que fornecer provas funcionais para efeito de miRNA sobre uma UTR particular, se tornaram um componente importante de um estudo minucioso miRNA. Esses dados baseados em células de ensaio em conjunto com as previsões alvo computacional ou expressão e de dados de proteômica fornece fortes evidências de que um 3&#39;UTR particular é regulada diretamente pelos miRNA de interesse. Em um ensaio 3&#39;UTR-repórter, a 3&#39;UTR de um gene de interesse é fundida ao final de um gene repórter luciferase. Se o 3&#39;UTR é um alvo de um miRNA, a estabilidade transcrição repórter e / ou a sua eficiência tradução vai mudar com a variação na concentração de miRNA funcional. Portanto, ao contrário transcrição somente ensaios com base, ensaios repórter ajudar a identificar os efeitos de ambos os mRNA estado estacionário e os níveis de proteína. Sistemas de repórter também pode ser usado para estudar os efeitos funcionais do mutagenizing um site putativo miRNA obrigatório em um 3&#39;UTR para confirmar que é realmente necessário para o interaction8. E, embora estudos de grande escala utilizando matrizes de expressão, técnicas de proteômica e ChIP Argonaute fornecer valiosas do genoma de dados para um pequeno número de condições experimentais, ensaios baseados em células repórter são os mais propícios para a ampliação para o estudo de miRNA-3 &#39; interações UTR em centenas ou milhares de condições que possam ser necessários para high-throughput screening de moléculas pequenas ou outra biblioteca baseada efetores. Muitos cientistas têm tecnologia aplicada ensaio repórter para o estudo de miRNA 3&#39;UTR interações. No entanto, com a idéia de que cada miRNAs muitas centenas alvo de transcrições diferentes, tem sido difícil para os pesquisadores a utilizar esta poderosa abordagem em uma escala de alto rendimento, porque a clonagem, validação, otimização e passos para a criação de milhares de diferentes 3&#39;UTR- vetores repórter são muitas vezes um custo proibitivo. Em um esforço para fazer de pequeno e grande escala 3&#39;UTR repórter estudos acessível a qualquer pesquisador, criamos uma coleção de todo o genoma de 3&#39;UTRs humana pré-clonados no altamente otimizado sistema de análise lightswitch luciferase. O sistema também inclui repórter vetores de controlo validados, um conjunto de mais de 700 construções sintéticas miRNA-alvo repórter para uso como controles positivos, e uma série de protocolos experimentais padronizados. Usando o protocolo a seguir, você pode perguntar se uma 3&#39;UTR humana particular é um alvo do seu miRNA de interesse. Os passos críticos neste fluxo de trabalho são de design experimental, transfecção de construções de repórter e imita miRNA, ensaios repórter luciferase, e análise de dados. Para o projeto experimental, é importante selecionar cuidadosamente uma linha celular transfectable, constrói repórter experimental e controle, e imita miRNA e não-alvo controla. Comuns altamente transfectable adhlinhagens de células erent como HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, e outros muitas vezes trabalham bem com esse protocolo. Notas importantes sobre design experimental O Sistema lightswitch ensaio de luciferase é um sistema totalmente otimizado repórter que inclui construções GoClone utilizando o gene RenSP luciferase e Reagentes Assay lightswitch luciferase. Use todos os componentes do Sistema lightswitch como recomendado para obter os resultados do ensaio ótimo repórter. Co-transfecção de qualquer oligos / plasmídeos com construções repórter Painéis GoClone reduz geral sinais luciferase de forma não-específicas. Portanto, é importante realizar as combinações de transfecção seguinte: único repórter repórter, + não-alvo miRNA controle, e repórter + miRNA específico. Nosso vetor empty_3UTR (promotor forte, não UTR) fornece um nível muito alto de sinal luciferase e serve como um controle positivo para a eficiência de transfecção e um sintético miRNA vector repórter alvo pode servir como um controle positivo para imitar a atividade. Além disso, recomendamos o uso do GoClone controles limpeza 3&#39;UTR e controles aleatórios para separar com precisão seqüência específica contra efeitos não-específicos. Estudar o seu protocolo e sempre que possível tornar mestre mistura para diminuir a variabilidade em seus dados devido a erro de pipetagem ou evaporação. Este protocolo utiliza reagentes de transfecção DharmaFect Duo (Dharmacon). 1 dia DICA IMPORTANTE: Escolha a sua linha de celulares com sabedoria. Para melhores resultados, use uma linha de células que é conhecido por ser transfectable. Temos também descobriu que a resposta mensurável de um repórter UTR 3 &#39;a um miRNA imitar é atenuada em linhagens de células com altos níveis endógenos de que miRNA particular. Se você não sabe o quanto miRNA sua linha de celulares expressa, tente alvo SGG do microRNA sintético que mede indiretamente a abundância de um miRNA em particular em uma célula, bem como informá-lo quanto à faixa dinâmica de seu ensaio. 1. Células de semente para produzir confluência ≥ 80% no momento da transfecção. <ol><li> Células de semente em uma placa de 96 poços TC branco no volume total 100μl. </li><li> Nas sementes, em paralelo o número adequado de células em um prato claro de 96 poços para avaliar a confluência. </li></ol> DICA IMPORTANTE 1: Confluence é fundamental para atingir bons resultados em um experimento de imitar. Para knockdown ideal, as células devem ser 100% confluente no momento da transfecção. DICA IMPORTANTE 2: Usar células passagem baixo para melhores resultados. Células que foram várias passagens muitas vezes tendem a produzir dados transfecção ruidosos. Dia 2 Prepare constrói GoClonereporter miRNAs e, em seguida, transfecção nas células confluentes. 2. Prepare Constrói <ol><li> Descongelar constrói GoClone (DNA plasmídeo) em temperatura ambiente. Misture bem. </li><li> Centrífuga para remover a condensação da tampa. </li></ol> 3. Prepare RNAs Micro <ol><li> MicroRNAs Thaw (imita específicas e não-alvo controles) em temperatura ambiente e centrifugar para remover a condensação das tampas. </li><li> Diluída para uma concentração de trabalho de 2 M em água livre de RNase. </li></ol> Além de um miRNA experimental imitar sempre incluir um controle de miRNA não-alvo. Co-transfecting um plasmídeo e um pequeno RNA oligo leva a um menor sinal de que o plasmídeo transfecting sozinho. Incluir um ou mais controlos positivos. Considere usar uma das centenas de vetores sintéticos miRNA-alvo repórter no catálogo da SGG. Incluir um ou mais controles negativos ou não-específicas. SGG tem uma gama de controles, incluindo UTRs 3 &#39;de genes housekeeping, fragmentos aleatórios e / ou o controle (sem inserir UTR) vazio. O uso de um ou mais desses controles ao lado de uma construção experimental permitirá que você normalize para todos os efeitos não-específicos atribuíveis à superexpressão de sua miRNA específico ou o controle não-alvo. 4. Prepare Transfections <ol><li> Para cada transfecção combinar os seguintes reagentes para um único ensaio: </li></ol> Mistura 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Repórter GoClone individuais: </td><td> 3,33 mL </td></tr><tr><td> microRNA: </td><td> Varia * </td></tr><tr><td> Sem soro de mídia: </td><td> a 10 mL </td></tr></tbody></table> * Concentração efetiva miRNA pode variar de 10 nM-100 nM. Consulte o fabricante miRNA para a concentração adequada. DICA IMPORTANTE: Não adicione muito imitar. Uma gama razoável para imitar concentrações é 10-50 nM na reação final 100uL. Realizar pelo menos três réplicastransfections te para cada tratamento / combinação UTR e incluem volume adicional para permitir a pipetagem erro. Por exemplo, multiplicar o volume de reação única de 3,5 para obter mix transfecção suficiente para três poços transfecção replicar incluindo extra para pipetagem de erro ou a evaporação. Para cada repórter, configurar repetições para o seguinte: o repórter só repórter, + não-direcionamento e controle de miRNA repórter + miRNA específico. Configurar transfections para o microRNA visando ao mesmo tempo, como os de um controle não-alvo. <ol start="2"><li> Compõem o DUO DharmaFECT mistura (Dharmacon) como segue para cada transfecção: </li></ol> Mistura de 2 <table border="1"><tbody><tr><td> DharmaFect Duo: </td><td> 0,15 mL </td></tr><tr><td> Soro de mídia livre: </td><td> 9,85 mL </td></tr></tbody></table> A quantidade de DharmaFECT Duo a ser adicionada pode ser linha celular dependente. Os montantes acima indicados são apropriados para HT1080 células. Consulte a documentação do fabricante para determinar a quantidade adequada para a sua linha de celular. Dica: Faça uma mistura de transfecção grandes multiplicando os volumes acima pelo número de repórteres, o número de repetições e do número de miRNAs a ser testado. Ao calcular a quantidade de mistura de transfecção de preparar, não se esqueça de incluir uma pequena quantidade extra para contabilizar os erros de pipetagem e evaporação. <ol start="3"><li> Deixe a mistura Duo DharmaFECT para incubar em temperatura ambiente por 5 minutos. </li><li> Após 5 minutos, adicionar 10μL da mistura Duo DharmaFECT (Mistura 2) a cada tubo preparada de 10uL plasmídeo e / ou miRNA (Mistura 1). Cada tubo deve então conter um volume de 20μL por transfecção replicar. </li><li> Incubar cada mistura por 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após 20 minutos, adicionar 80 mL do pré-aquecido (37 ° C), livre de antibióticos, a mídia completa por repetição a cada tubo para um total de 100μL por transfecção replicar. Um bloco de poços profundos pode ser usado para a preparação de muitas repetições e amostras simultaneamente. Misturar a solução pipetando cima e para baixo. </li><li> Remova a placa semeada da incubadora. Verificar que as células são pelo menos 80% confluentes. </li><li> Cuidadosamente pipeta fora da mídia de cada poço. </li><li> Adicionar 100μL da mistura de transfecção (20uL DNA / reagente mix + 80uL media) a cada poço. </li><li> Colocar a placa na incubadora durante a noite. </li></ol> Não excesso de incubar. Mais imita irá produzir resultados significativos em bona fide alvos dentro de 24 horas. O nível de repressão mensuráveis ​​em 48 horas pode ser maior, mas assim que o bem a variabilidade bem. Mimic experimentos são mais fáceis do que as experiências inibidor. Enquanto a maioria imita significativamente reprimir os verdadeiros alvos dentro de 24 horas, significativas de repressão atribuíveis ao inibidor pode demorar 48 horas para ser mensuráveis ​​e será quase sempre menos pronunciada do que o efeito da mímica. Dia 3 Nota: ensaios de luciferase podem ser realizados imediatamente, ou as placas podem ser congeladas a -80 ° C (congelamento geralmente aumenta a lise celular e sinal luciferase). Congelar e descongelar as suas células antes assaying para melhores resultados. LEMBRE-SE para deixar descongelar células congeladas à temperatura ambiente antes de adicionar lightswitch Reagente de Ensaio. 5. Atividade medida luciferase com lightswitch AssayReagents <ol><li> Retire a placa da incubadora e trazer à temperatura ambiente. </li><li> Prepare os reagentes do ensaio lightswitch (para kit LS010, protocolos de tamanhos kit outras podem ser encontradas on-line): <ol><li> Substrato reconstituir 100X adicionando 100μL de substrato de solvente para tubo de ensaio de substrato liofilizado. Proteger da luz e minimizar o tempo em temperatura ambiente. Substrato 100X podem ser armazenadas a-20C por 2-3 semanas. Para melhores resultados, use substrato acaba de ser reconstituído. </li><li> Preparar a solução de Ensaio pelo descongelamento frasco 10ml de Tampão de Ensaio em sala de banho de água de temperatura e adicionar 100μL de substrato 100X reconstituído antes da utilização. Misture bem. </li></ol></li><li> Use uma pipeta multi-canal para adicionar 100μL da solução de Ensaio lightswitch (buffer + substrato) diretamente para cada poço de amostra (contendo 100uL células + media) em uma placa branca de 96 poços. Se as células foram cultivadas em outra placa ou formato de frasco, as amostras de transferência para uma placa branca de 96 poços em volume total 100μL (mídia ou PBS). </li><li> Placa de cobertura, proteger da luz, e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Assaying Se mais de uma chapa, cambaleiam adição da solução de ensaio, para que cada placa incuba por 30 minutos antes da leitura. </li><li> Leia cada poço por 2 segundos em uma placa luminometer (SpectraMax L ou equivalente). </li><li> Calcular o knockdown, calculando relação sinal luciferase para cada construção de miRNA específicas sobre o controle não-alvo (luminescência = miRNA específico / não-alvo de controle). Use os dados do serviço de limpeza, aleatório, e constrói vazia para controlar para não-UTR efeitos do tratamento específico. </li></ol> Resultados representante 3&#39;UTR alvos na presença de um miRNA visando mostrar knockdown luciferase. O knockdown da 3&#39;UTR-luciferase atividade repórter por deixá-7a foi medida em células HT1080 por co-transfecting 100ng de cada repórter construir com 20nm controle imitam ou não de metas de let-7, incubando durante 24 horas, depois de ler o repórter luminescentes sinal usando os reagentes do ensaio lightswitch luciferase. <img src="/files/ftp_upload/3343/3343fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Punção e ARID3B 3&#39;UTRs humanos são alvos do microRNA let-7. Sinais dos repórteres 3&#39;UTR humanos para a punção e genes ARID3B são significativamente derrubado na presença do microRNA let-7 imitar enquanto os sinais de limpeza e seqüência aleatória UTRs não são.

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Os autores são funcionários da Genomics Switchgear que fazem as ferramentas e os reagentes que aparecem neste artigo. Produção deste artigo foi patrocinado pela Genomics manobra.

Nós criamos uma coleção de todo o genoma de pré-humano clonado 3&#39;UTR-repórter constrói a permitir estudos de miRNA 3&#39;UTR interações em células vivas. Aqui nós temos mostrado um método reprodutível e de alto rendimento para mimetiza co-transfecting miRNA com 3&#39;UTR-repórteres usando um sistema de repórter luciferase. Este método baseia-se pesquisadores usando uma linhagem de células altamente transfectable e perturbando a atividade de miRNA com uma técnica super-expressão. Pesquisadores que usam linhagens de células mal-transfectable pode considerar o uso de nosso companheiro coleção 3&#39;UTR repórter-lentiviral criado em conjunto com Sigma (Missão 3&#39;UTR Lenti GoClones). Tratar as células com miRNA imita resultados em um experimento superexpressão do tipo, e com qualquer desses estudos, os pesquisadores devem ter em conta que este pode ou não representar reais condições fisiológicas. Para responder às preocupações superexpressão, os pesquisadores podem usar inibidores da miRNA além imita o estudo da interacção com dois tipos diferentes de perturbação 12-14. Uma vez que as metas miRNA prováveis ​​são identificados, os pesquisadores podem querer induz mutações os sites putativo miRNA vinculação para determinar se os sites são necessárias para a interação funcional. Eles podem também querer escalar até centenas de diferentes testes UTRs alvo potencial (Boutz). Além disso, se os pesquisadores estão interessados ​​se a miRNA está afetando a estabilidade transcrição ou tradução de eficiência, os dados repórter luciferase pode ser comparado às medidas de níveis de steady-state transcrição. Qualquer alteração no sinal de luciferase que não está associada a uma mudança proporcional nos níveis de transcrição irá apontar para um efeito sobre a eficiência da tradução. Finalmente, os pesquisadores podem usar vetores repórter criar uma curva dose-resposta para comparar a sensibilidade relativa de UTRs diferentes para mudanças na concentração de miRNA 14.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Placas de tecido branco Cultura (de 96 poços fundo sólido) </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td> Placas de tecido claro Cultura (96 poços) com tampa </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> Lightswitch Reagente ensaio de luciferase </td><td> Painéis </td><td> LS010 </td></tr><tr><td> DharmaFECT Reagente Transfection Duo (0.75mL) </td><td> Dharmacon </td><td> T-2010-02 </td></tr><tr><td> Folha de fita de vedação Placa </td><td> E &amp; K Scientific </td><td> T592100 </td></tr><tr><td> A fita de vedação respirável Placa </td><td> E &amp; K Scientific </td><td> T896100-S </td></tr><tr><td> Luminômetro placa </td><td> Os dispositivos moleculares </td><td> SpectraMax L </td></tr></tbody></table>

identifying targets of human micrornas with the lightswitch luciferase assay system using 3'utr-reporter constructs and a microrna mimic in adherent cells

MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica e desempenhar um papel em muitos processos biológicos. Mais de 700 miRNAs humanos foram identificados até o momento com cada um tendo até centenas de mRNAs alvo único. Ferramentas computacionais, ensaios de expressão e proteômica, e cromatina-imunoprecipitação técnicas baseadas em fornecer pistas importantes para a identificação de mRNAs que são alvos diretos de um miRNA particular. Além disso, 3&#39;UTR repórter-ensaios se tornaram um componente importante de estudos completa miRNA-alvo, pois fornecem evidências funcionais a favor e quantificar os efeitos de determinados miRNA 3&#39;UTR interações em um sistema baseado em células. Permitir aos investigadores mais para alavancar 3&#39;UTR repórter-ensaios e apoiar o scale-up desses ensaios para high-throughput níveis, criamos uma coleção de todo o genoma de repórteres 3&#39;UTR humana luciferase na luciferase lightswitch altamente otimizado Sistema de ensaio. O sistema também inclui sintéticos miRNA constrói alvo repórter para uso como controles positivos, várias construções repórter endógena 3&#39;UTR, e uma série de protocolos padronizados experimental. Aqui nós descrevemos um método para co-transfecção de cada 3&#39;UTR-repórter constrói junto com um miRNA imitar que seja eficiente, reprodutível e passível de análise de alto rendimento.

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Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica e foram mostrados a desempenhar um papel em inúmeros processos biológicos. Para entender melhor miRNA-UTR interações, criamos uma coleção de todo o genoma de três repórteres UTR luciferase emparelhado com um novo gene luciferase e reagentes de ensaio, o sistema de interruptor.

Metas de identificação de microRNAs humanos com o Sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3&#39;UTR repórter-Constrói e um microRNA em células aderentes Mimic

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

36.1K visualizações.  SwitchGear Genomics. MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica e foram mostrados a desempenhar um papel em inúmeros processos biológicos. Para entender melhor miRNA-UTR interações, criamos uma coleção de todo o genoma de três repórteres UTR luciferase emparelhado com um novo gene luciferase e reagentes de ensaio, o sistema de interruptor.

Vídeo: Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Estudando Biogenesis de membrana com um ensaio de luciferase Gene-Based Reporter

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Biologia

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

Fracionamento em Subcelulares situ de aderentes e não aderentes células de mamíferos

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogênica Ensaio: células aderentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

A Triagem procedimento químico para Glucocorticoid Sinalização com um Sistema Reporter Zebrafish Zergling luciferase

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Detecção de alvos miRNA em métodos de alta capacidade utilizando o ensaio 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.