We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.

<html> 1. Cultivo Celular (24-48 h antes de la transfección) <ol><li> 24-48 h antes de la transfección semilla una cantidad suficiente de células HEK293T basado en el número de placas de 96 pocillos se transfectaron. NOTA: Para las transfecciones consistentes, células de la placa a una densidad suficiente para favorecer la rápida división, sin embargo, no ser en más de 70-90% de confluencia en el momento de la transfección. </li><li> Cada placa de 96 pocillos requiere 9 x 10 6 células (75000 células por pocillo, y 120 pocillos por placa para tener en cuenta el uso de depósito y pipeta multicanal). Calcular el tiempo de duplicación de las células HEK293 (típicamente ~ 20 h), y la semilla el número adecuado de células para obtener al menos 9 x 10 6 células en el momento de la transfección. Una placa de cultivo de 145 mm circular es típicamente suficiente para 3 transfecciones 96 pocillos cuando se cultiva a ~ 90% de confluencia, con ~ 10% de las células restantes para sembrar de nuevo una nueva placa. </li></ol> 2. Preparación Antes de la transfección _content &quot;&gt; NOTA: La preparación de los tampones y ADN plásmido en el paso 2,0-2,2 debe realizarse en los días antes de la transfección desde la preparación de estos reactivos puede llevar mucho tiempo. <ol><li> 3&#39;UTR clones humanos que son compatibles con el ensayo 3&#39;LIFE están disponibles a través de un repositorio de plásmido público 30. Purificar el ADN del plásmido de forma manual o con los robots de manipulación de líquidos. Utilice un kit de mini-prep de 96 pocillos de grado transfección lisis alcalina y siga las instrucciones del fabricante. Resuspender los vectores purificados a ~ 100 ng / l por pocillo. NOTA: La señal de luciferasa insuficiente producirá si la concentración de plásmido cae por debajo de 40 ng / l. </li><li> Obtenga la pLIFE-miARN vectores 30 o clon usando el gasoducto en la figura 1B 24. Resuspender los vectores a una concentración de 500 ng / l para cada miARN y los plásmidos control en blanco. </li><li> Debido a la sensibilidad de las condiciones de tampón nucleofection, asegurar queel volumen total de materiales (incluyendo las células transfectadas y plásmidos) no supere el 10% del total de líquido en cada pocillo de la placa de la transfección de 96 pocillos. Para lograr esto, concentrar el plásmido de stock pLIFE-miARN a una concentración de por lo menos 500 ng / l. </li><li> Preparar reactivos tampón 10x luciferasa de luciérnaga (Tabla 1), y los reactivos tampón 1x Renilla luciferasa (Tabla 2), que se pueden almacenar durante un máximo de 6 meses. NOTA: La TDT en el tampón de luciferasa de luciérnaga debe a ser almacenado en solución a -20 ° C en alícuotas de un solo uso. </li></ol> 3. Preparar siguientes artículos Inmediatamente antes de la transfección <ol><li> Preparar tampón de transfección que contiene PBS, 1,5% HEPES, pH 7,0. Prepare esta fresca, aunque puede ser almacenado durante un máximo de 1 mes a 4 ° C sin disminuciones notables en la eficiencia de transfección. En la formulación de los volúmenes de tampón y de ADN plásmido, asumir 120 reacciones para cada placa de 96 pocillos para sufficiently cuenta de errores en la pipeta y el volumen perdido el uso de depósitos de líquido y pipetas multicanal. Alícuota 18 l por tampón de transfección bien (120 pozos / 96 pocillos de placas = 2,16 ml por placa) y dejar de lado. NOTA: El dispositivo celular electroporación es extremadamente sensible a las condiciones de tampón utilizados para transfectar células. Exactitud cuando se preparan tampones garantizar un rendimiento constante del equipo. Un cuidado especial debe ser tomado al realizar el ensayo para evitar la evaporación de los tampones, específicamente al minimizar el tiempo que búfer se deja al descubierto en tubos de microcentrífuga, placas de 96 pocillos, embalses y placas de electrodos. </li><li> Reserva cuatro pozos para los siguientes controles, sin pLIFE-3&#39;UTR (para medir el fondo de ensayo de luciferasa), pLIFE-SV40 3&#39;UTR (control de destino negativo), control positivo para miARN # 1, el control positivo para miARN # 2. NOTA: Estos vectores son a disposición del público 30. Alternativamente, cualquier objetivo previamente validadose puede utilizar como un control positivo. </li><li> Medios cálidos, tripsina (0,25%) a 37 ° C. </li><li> A cada pocillo de placa de 96 pocillos de cultivo de células, añadir 200 l de DMEM suplementado con 10% FBS, 1% Pen / Strep, y se coloca en una incubadora a 37 ° para el uso después de la transfección. </li><li> Encienda todos los dispositivos de electroporación de células seguido por el software de soporte. Utilice el código de pulso FF120 para las células HEK293T y tampón PBS / HEPES. </li></ol> 4. Preparación del plásmido de ADN y mezcla de células NOTA: El siguiente protocolo asume la transfección de tres placas de 96 pocillos en un experimento para una pantalla con dos miRNAs (miRNA- # 1 y # 2 miRNA-). Cada placa se corresponderá con la misma placa de 96 pocillos de plásmidos pLIFE-3&#39;UTR, y ser tratado tres veces con pLIFE-miRNA-blanco, pLIFE-miRNA- # 1, o pLIFE-miRNA- # 2. <ol><li> Preparar 3 poblaciones de tampón de transfección pLIFE-miARN + para cada miARN. Esta acción debe representar el 50% (10 l) del volumen total de cadaasí, multiplicado por 120 pozos. Por lo tanto, cada acción debe contener 1,08 ml de tampón + 120 ADN plásmido l (pLIFE-miRNA). </li><li> Retire las células de placa de cultivo de 145 mm eluyendo medios de comunicación, lavar suavemente con PBS, y tratando con 5 ml ~ 0,25% de tripsina durante 5 min a 37 ° C. Neutralizar la tripsina con un volumen igual de medios de comunicación, y las células de pellets a 300 xg durante 5 min. </li><li> Retire tripsina / medios de comunicación, y pellet se resuspende en ~ 5-10 ml de medio (dependiendo de la densidad celular y el rango exacto de contador de células). </li><li> Contar las células utilizando un contador de células. Asegúrese de que las células son&gt; 95% viable y dentro del alcance preciso de la máquina. NOTA: Un recuento de células incorrecto puede ser resultado de las concentraciones de células extremadamente altos (&gt; 6.0x 10 6 / ml). La transfección de demasiadas células pueden reducir drásticamente la eficiencia de los genes miARN focalización mediante la reducción de plásmido: proporción de células y / o la disminución de la eficiencia de transfección. </li><li> Alícuotas tres tubos cada uno conteniendo 9 x 10 6 células, correspondiente a las células rEQUERIDO para la transfección de una placa de 96 pocillos. Girar las células a 300 xg durante 3 min. </li><li> Retire los medios de comunicación. Asegúrese de retirar la mayor cantidad de medios de comunicación como sea posible con el menor trastorno posible de la pastilla como el exceso de medios de comunicación pueden afectar la eficacia de transfección. </li><li> Resuspender las células en 1,2 ml de tampón de transfección / mezcla de plásmido miARN, y dejar de lado. </li><li> Los siguientes pasos detallan resuspensión del plásmido pLIFE-3&#39;UTR en tampón de transfección. Mientras esto ocurre en placas de 96 pocillos, tenga cuidado para evitar la evaporación de tampón cubriendo placas en todo momento. <ol><li> Usando una pipeta multicanal, mueva 32,4 l de tampón de transfección en cada pocillo de una placa de PCR 96 (9 l [por transfección] * 3 [placas] * 1,2 [para dar cuenta de error pipeta]). </li><li> Añadir 3,6 l (~ 100 ng / l) de pLIFE-3&#39;UTR plásmido mini-preparada a cada pocillo y mezclar bien. </li><li> Pipeta 10 l de esta mezcla en cada pocillo de la placa de la transfección de 96 pozos y la cubierta. </li></ol></li></ol><ol><li> Mueva 1,2 ml de la primera / tampón / mezcla de plásmido pLIFE-miARN celular en el depósito. Mezclar bien. </li><li> Añadir 10 l de esta mezcla en la primera placa de transfección de 96 pocillos ya que contiene 10 l de tampón de transfección / pLIFE-3&#39;UTR. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo varias veces. NOTA: Igual suspensión de células en el tampón se asegurará incluso a fondo y el paso de la corriente eléctrica a través de la cubeta y maximizar la eficiencia de la transfección. </li><li> Coloque la placa de 96 pocillos de transfección en el dispositivo de electroporación de células e iniciar la transfección. </li><li> Una vez se haya completado la transfección, añadir 100 l de los medios de comunicación pre-calentado de 96 pocillos placa de cultivo a cada pocillo de la placa de la transfección de 96 pocillos y mezclar bien. Mueva 100 l de cada pocillo en la placa de cultivo de 96 pocillos. </li><li> Mezclar las células en placa de cultivo con la pipeta en posición vertical en el centro del pozo, como las células tienden a agregarse en los lados de la well menos mezclado correctamente. </li><li> Repita 5.1 a 5.5 para las dos placas restantes. </li><li> Limpieza de la placa de la transfección de 96 pocillos <ol><li> Las placas de transfección de 96 pocillos pueden ser reciclados por lavado con EtOH al 70% para asegurar que no se arrastren de los ácidos nucleicos entre los experimentos. Realice dos lavados de 70% EtOH utilizando una botella de spray para llenar completamente cada pocillo, seguido por limpiando el exceso de EtOH en las tiras de los electrodos (parte inferior) y permitiendo que las placas de transfección a completamente seca en la campana de cultivo. NOTA: Hemos probado para traspaso de la contaminación de ADN mediante la transfección de 12 pozos con 2 mg cada pmaxGFP plásmido en células HEK293T, seguido de un solo lavado con EtOH al 70%, y una segunda transfección sin ADN plásmido. Con esta concentración extremadamente alta plásmido, reportero extremadamente brillante, y un solo lavado, no hubo fluorescencia observable en cualquiera de las transfecciones 12 replicados. </li></ol></li><li> Células de cultivo durante 48-72 horas a 37 ° C, seguido por la doble lucifborrar ensayo. </li></ol> 6. Preparación de lisado de la célula para ensayo de luciferasa <ol><li> Diluir tampón de lisis con 4 partes de agua, 1 parte de 5x tampón de lisis pasiva en un depósito. Calcula 26 l / pocillo, añadiendo ~ 20 volúmenes adicionales para dar cuenta de la pérdida en el depósito. NOTA: Buffer se almacena a -20 ºC y puede ser extremadamente viscoso, por lo tanto antes de permitir que el tampón 5x para acercarse a temperatura ambiente mejorará la precisión de pipeteo. </li><li> Analizar cada pocillo para la eficiencia de la transfección mediante microscopía de fluorescencia. Nota cualquier inconsistencia en los pozos que no transfectan de manera eficiente (&gt; 90% de eficiencia de transfección), o se expresan bajos niveles de RFP indicativo de hacinamiento o medios agotamiento. Retire estos pozos del análisis. </li><li> Eliminar completamente los medios de comunicación de las células, teniendo cuidado de no eluir demasiado rápido lo que hará que las células que se desprenden. NOTA: Los medios restantes diluirán las fluctuaciones de lisado y causar en valores a través de EXPERIMEnts. </li><li> Añadir 26 l de tampón de lisis a cada pocillo, y colocar en un plato agitador basculante / a velocidad baja / moderada de ~ 20-30 min. Aproveche este tiempo para preparar buffers de luciferasa, lavar y preparar el luminómetro (s), y la transferencia de lisado de placas de medición opacos. </li></ol> 7. Dual Luciferase Assay NOTA: Si hay varias placas se están midiendo de forma secuencial en un luminómetro, crear mezclas de reacción de amortiguamiento con todo excepto ATP y sustratos, la adición de estos reactivos seguido de ajuste del pH inmediatamente antes de su uso con cada plato. ATP y sustratos pueden degradarse con el tiempo; coherencia en la cantidad de tiempo que estos reactivos están en el buffer mejorará la coherencia en varios platos. <ol><li> Preparar buffers de luciferasa 1x (Tabla 1): <ol><li> Envuelva dos tubos (típicamente 15/50 ml tubos de centrífuga) que contienen la luciérnaga y Renilla tampones con papel de aluminio, como sustratos pueden ser sensibles a la luz. </li><li>Prepare el buffer de la luciferasa de la luciérnaga 1x. Añadir 1 ml de cada uno de los cinco 10x reactivos de luciferasa de luciérnaga, la adición de EGTA pasado, a 5 ml H 2 0 a una concentración 1x final. <ol><li> Añadir 0,025 g ATP a 10 ml 1x tampón de luciérnaga. Mezclar invirtiendo varias veces. Mantenga ATP en hielo en todo momento. ATP se degrada, por lo que si la medición de más de una placa de forma secuencial, tampón debe ser hecho nuevo comienzo en este paso para cada placa adicional. </li><li> Añadir 100 l de 100 luciferina de escarabajo (sustrato) (Tabla 1) Buffer debe cambiar a color amarillento basado en el pH. </li></ol></li><li> 1x Renilla luciferasa búfer reconstitución: Per placa de 96 pocillos, alícuota de 10 ml de 1 &quot;Renilla tampón&quot;. <ol><li> Añadir 100 l de BSA (44 mg / ml de acciones). </li><li> Si el cribado más de un plato, mezcla maestra separada en 10 ml alícuotas. </li><li> Añadir 100 l de coelenterazina para amortiguar (previamente en alícuotas y se almacena a 100x conc.) </li></ol></li> &lt;li&gt; Ajustar el pH de 1x tampón de luciérnaga a 8,0, seguido por el tampón 1x Renilla a 5,0 usando NaOH y HCl. NOTA: La actividad de cada tampón, y la capacidad de la memoria intermedia de Renilla para apagar la actividad de la luciferasa de la luciérnaga es altamente dependiente de pH. Para obtener resultados consistentes ser extremadamente precisa en este paso. </li><li> Llevar volumen de cada tampón (correspondiente a la placa 1 de 96 pocillos) a 10,5 ml para acomodar para el cebado luminómetro. </li></ol></li><li> Transferir el lisado a placas blancas opacas: En este punto las células deben estar en tampón de lisis durante ~ 20 min. Tomar 25 l de cada pocillo usando una pipeta multicanal, asegúrese de pipetear arriba y abajo a fondo para romper los grupos de células y homogeneizar el lisado. </li><li> Preparar el luminómetro. Encienda el luminómetro y seleccione el protocolo en la carpeta DLR, llamado &quot;DLR con dos inyecciones&quot;. Otros formatos no son compatibles con la tubería de análisis de datos (a continuación). <ol><li> Seleccione los pozos que tsado (todos los pozos es el valor predeterminado). </li><li> Extender el &#39;Retardo antes de la medición&#39; ajuste a 5 segundos, con un tiempo de medición de 10 segundos (ver 29 para la explicación). </li><li> Capilares pasos de lavado: 3x agua, EtOH 3x, 3x agua, 3x seco. Tampones Prime una vez en los residuos, y el entonces primer por segunda vez de nuevo en los tubos de protección para asegurar la mezcla. Inyectar el buffer luciérnaga primera y primordial en el capilar a la izquierda, seguido de Renilla en el capilar derecha. </li></ol></li><li> Iniciar el ensayo de luciferasa. Cada placa debe tener ~ 48 min de leer. Después de la terminación guardar el archivo, y luego repetir los pasos de lavado y cierre el luminómetro. NOTA: placas múltiples se pueden leer los datos almacenados en el mismo archivo de Excel, sin embargo los problemas se pueden encontrar con la placa de varias lecturas donde el programa luminómetro se estrellará. Asegúrese de guardar todos los datos entre las mediciones y realizar capturas de pantalla si programa se bloquea antes de guardar es posible. <ol><li> Vuelva a colocar tampones viejoscon el nuevo, asegurándose de primer al menos dos veces con nuevos amortiguadores antes de comenzar la nueva placa. </li></ol></li></ol> Análisis 8. Datos <ol><li> Utilizar tablas excel &quot;3&#39;LIFE - análisis de placa única&quot; y &quot;3&#39;LIFE - análisis multidisco&quot; disponible de <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> . Copie los datos en bruto de luciérnaga y Renilla luciferasa mediciones de archivo de salida luminómetro en lugares correspondientes a la condición negativa, miRNA # 1, # 2 y miRNA en el &quot;3&#39;LIFE - Análisis de placa única&quot; hoja de cálculo. </li><li> La hoja de cálculo calculará automáticamente luciérnaga / relación de Renilla y normalizar cada miARN al control negativo apropiado, y normalizar los valores de la represión a través de cada plato. NOTA: Esta hoja de cálculo identificará automáticamente pozos con baja señal luciferasa, resalte pozos significativamente reprimidos, y proporcionar medidas de repressien toda la placa. Ver 24 para una explicación detallada de los análisis estadísticos. <ol><li> Copie los valores en el cuadro de &quot;Normalizado Índice RI&quot;, en las células correspondientes en el - de hoja de cálculo &quot;3&#39;LIFE análisis multidisco&quot; en la posición correspondiente para replicar # 1 para cada miARN probado. Repita para todas las réplicas biológicas realizadas en días diferentes. </li></ol></li><li> Si lo desea, introduzca los nombres de genes y el estado de la predicción de destino en las columnas B y D, respectivamente. <ol><li> Deje que la hoja de cálculo para calcular automáticamente el promedio de toda la placa. Observe los datos en formato de 96 así como un mapa de calor (Figura 2). El archivo también organiza los datos en formato de lista (Figura 2). NOTA: El índice de la represión es la medida utilizada para identificar supuestos objetivos miARN. Diferentes parámetros de rigurosidad se pueden utilizar, en base a las preferencias individuales. En promedio se considera probables éxitos debajo índice represión de 0.8 y estadísticamente significativa por la prueba t (p-valor &lt;0,05). Como se muestra en la Figura 3 posibles objetivos basados ​​en estos criterios se destacan en rojo. </li></ol></li></ol>

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S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-to-I+editing+of+microRNAs+in+the+mammalian+brain+increases+during+development.">A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development.</a> Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m(6)A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screens+of+miRNA-mRNA+interactions+unveiled+that+the+3'UTR+of+a+gene+is+targeted+by+multiple+miRNAs.">Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs.</a> Plos One. 8 (7), e68204 (2013).</li><li>Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noncommercial+dual+luciferase+enzyme+assay+system+for+reporter+gene+analysis.">A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis.</a> Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).</li><li>Seiler, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+MicroRNAs+in+Conferring+Robustness+to+Biological+Processes.">Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes.</a> Cell. 149 (3), 515-524 (2012).</li><li>Pelaez, N., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+robustness+and+the+role+of+microRNAs:+a+network+perspective.">Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective.</a> Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).</li></ol>

This work is supported by funds from the College of Liberal Arts and Science and the Biodesign Institute at Arizona State University and NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.

El ensayo 3&#39;LIFE identifica los genes miARN objetivos funcionales en 3&#39;UTRs en alto rendimiento. Este ensayo es útil para los investigadores que desean identificar experimentalmente un gran número de supuestos objetivos para su miARN de interés. El ensayo 3&#39;LIFE es un enfoque poderoso para consultar para la regulación impulsado 3&#39;UTR, en que el ensayo proporciona una medida funcional de los genes miARN focalización, y la prueba binario de un solo reportero :: 3&#39;UTR contra un solo miARN puede abo...

El objetivo general de este método consiste en detectar y mapear precisamente microARN (miARN objetivos) en alto rendimiento. MiRNAs son endógenos ARN no codificantes ~ 22 nucleótidos de longitud. Después de la transcripción y el procesamiento, miRNAs maduros se incorporan en un complejo de proteína llamada el silenciamiento de ARN inducida complejo (RISC). Cada miRNA guía el RISC a elementos situados principalmente en las regiones 3 &#39;no traducida (3&#39;UTRs) de los ARN mensajeros (ARNm) diana, lo que resulta en cualquiera de traducción represión o mRNA división 1. Mirna reconocer sitios diana, según norma Watson-Crick y G: U wobble base de sincronización, y son degenerados en la naturaleza, que contiene varios pares de bases coincidentes y las regiones se hinchó. Muchos miRNAs son ampliamente conservadas de las plantas a los seres humanos 2,3, donde juegan una amplia gama de funciones biológicas. En metazoos miRNAs pueden influir múltiples procesos biológicos incluyendo las decisiones del destino celular 4, el calendario de desarrollo 5 </sup&gt;, Y con frecuencia exhiben patrones de expresión específicos de tejido 6,7. MIRNA misexpression también puede resultar en la regulación génica aberrante, que puede tener una influencia sustancial en el comportamiento celular basada únicamente en la función de los genes diana. Como tal, miRNAs están vinculados a una amplia gama de enfermedades, incluyendo neurodegeneración 8,9, diabetes y cáncer 10 11. Bioinformática y enfoques húmedo banco sugieren que cada miARN puede ser capaz de apuntar a cientos de miles de ARNm distintos 12-14, lo que indica que se requieren enfoques sectoriales de alto rendimiento o del genoma para investigar este gran número de interacciones potenciales. La identificación de genes diana es un componente crítico de la definición de la función mecánica miARN, y hacer lo que los investigadores deben ser capaces de revelar los objetivos a gran escala. Se han desarrollado varios enfoques para identificar los genes miARN objetivos, incluyendo los algoritmos de predicción bioinformáticas, secuenciación de alto rendimientodel objetivo ARNm, y el reportero ensayos basa. Cada uno de estos enfoques tiene fortalezas y debilidades inherentes. Dado que los genes miARN focalización es guiado por la especificidad de secuencia, más notablemente de los nucleótidos 2-6 de la miARN (denominada la región de la semilla), varios algoritmos se han desarrollado para predecir los genes miARN objetivos en todo el genoma de muchos organismos. Estos algoritmos son capacitados utilizando los observados motivos de apareamiento de bases de los genes miARN objetivos validados, y con frecuencia utilizan parámetros como la vinculación estricta de semillas, la conservación de sitios y / o estabilidad termodinámica 15. Si bien estos filtros refinan el gran número de supuestos objetivos con suficiente complementariedad con los objetivos de confianza solamente altas, pueden excluir especies sitios específicos y no canónicos miARN objetivo, que la evidencia reciente sugiere se han generalizado 16-24. Por otra parte, estas predicciones no tienen en cuenta los mecanismos de procesamiento de ARNm que excluyen a los sitios objetivo miARN, como alternativa polyadenylation25, 26 edición de ARN, el ARN metilación 27 y unión cooperativa. Como tal, las altas tasas de falsos negativos y falsos positivos han sido reportados para muchos algoritmos 22,24,28. Mientras que estos algoritmos son útiles para identificar candidatos miARN objetivos para la validación experimental posterior, estas altas tasas de error limitar la eficacia de los enfoques bioinformáticas para la detección sistemática miARN. Para investigar sistemáticamente la interacción entre un miARN dado y 3&#39;UTRs potencialmente dirigidas hemos desarrollado un ensayo de alto rendimiento llamado luminiscentes Identificación de elementos funcionales en 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) 24. Este ensayo mide las interacciones directas y la represión de traslación de la 3&#39;UTR de prueba por una consulta miARN usando un sistema indicador de luciferasa dual. En este sistema, el 3&#39;UTR de un gen de interés se clona aguas abajo de la luciferasa (Fluc) reportero marco de lectura luciérnaga. Los contras reporterotruct se cotransfecta con una consulta miRNA en células HEK293T. Mirna focalización se determina midiendo la variación relativa entre el Fluc prueba :: reportero 3&#39;UTR y un segundo reportero no específica luciferasa Renilla. Es importante destacar que los ensayos de luciferasa detectan interacciones funcionales miARN / mRNA que influyen en la salida de traslación de la periodista. Esta es una ventaja clave sobre los métodos tradicionales para detectar la regulación de los genes miARN, tales como RT-qPCR y transferencias de Western, en que esta pasa por diferencias en la degradación del ARNm y la represión de traducción, así como los cambios en la abundancia de proteína independiente de la regulación basada 3&#39;UTR. Los ensayos de luciferasa son ampliamente utilizados para validar blancos directos miARN debido a su sencillez y sensibilidad relativa, sin embargo, su uso en pantallas de alto rendimiento está limitado por los altos costos asociados con reactivos consumibles, la falta de bibliotecas 3&#39;UTR de fuentes públicas, y la ausencia de prot luciferasa normalizadaPROTOCOLOS, dando lugar a dificultades en la comparación de la represión funcional a través de múltiples conjuntos de datos. Para facilitar el uso del ensayo 3&#39;LIFE, hemos puesto énfasis en la simplificación del diseño experimental, la utilización de la transfección 24 y luciferasa reactivos no comerciales 29, la creación de una biblioteca 3&#39;UTR que se actualiza periódicamente y se expandió, y está disponible a través de un repositorio público plásmido 30. La escalabilidad del ensayo 3&#39;LIFE permite la detección de una gran biblioteca 3&#39;UTR para la orientación por un miARN dado sin sesgar la pantalla hacia genes bioinformatically identificados. Además de probar las interacciones canónicas y previstos, este enfoque sistemático permite la identificación de nuevas dianas impulsadas a través de interacciones no canónicos y / o específicos de las especies. Es importante destacar que el efecto de los genes miARN la orientación en la producción de proteína se entiende generalmente para dar lugar a la represión de traducción modesto 15,31 &lt;/ Sup&gt;, lo que sugiere que un papel primordial de la regulación miARN es para poner a punto la producción de proteínas, la protección contra los niveles aberrantes de expresión génica, y proporcionar robustez a la celda programas específicos 32,33. La sensibilidad del ensayo de luciferasa se combina con el inherentemente gran número de interacciones negativas miARN / mRNA en la pantalla 3&#39;LIFE permite la detección de los efectos sutiles de miARN focalización en un gran número de genes, y la identificación de múltiples componentes de las redes de genes que están regulados por un determinado miARN 24. Aquí se describe el protocolo 3&#39;LIFE, y demostrar que es de viabilidad mediante el cribado de dos miRNAs bien caracterizados, miR-10b y let-7c contra un panel de 275 3&#39;UTRs humanos (Figura 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycylglycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1127-25G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kx PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2222</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">FLAAS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4282</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luciferin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9504</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E0399</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K H2 P O4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1551139</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coelenterazine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS/HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5546</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pennicilin/Streptomicin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">T2600000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Consumables</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MaxiPrep Kit</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A2392</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well miniprep plate</td>
			<td style="width:71px;">Pall</td>
			<td>8032</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well shuttle plates</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">V4SP-2096</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5x Lysis Buffer</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td>E1941&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instruments</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well GloMax Plate Reader</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E9032</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biomech FX Liquid Handler Robot</td>
			<td style="width:71px;">Beckmann</td>
			<td style="width:119px;">A31842</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4D-Nucleofector Core Unit</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAF-1001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well Shuttle System</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAM-1001</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Counter Countess</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of mirna targets in high-throughput using the 3'life assay

Luminiscentes Identificación de elementos funcionales en 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) permite la rápida identificación de los objetivos de miRNAs específicos dentro de una matriz de cientos de 3&#39;UTRs consultados. La identificación del objetivo se basa en el ensayo de luciferasa dual, que detecta la unión a nivel de mRNA mediante la medición de la salida de la traducción, dando una lectura funcional de los genes miARN focalización. 3&#39;LIFE utiliza buffers no propietarios y reactivos, y bibliotecas reportero públicamente disponibles, por lo que las pantallas de todo el genoma viable y rentable. 3&#39;LIFE se puede realizar en un laboratorio estándar o ampliarse el uso de robots de manipulación de líquidos y otros instrumentos de alto rendimiento. Se ilustra el método utilizando un conjunto de datos de 3&#39;UTRs humanos clonados en placas de 96 pocillos, y dos miRNAs prueba, vamos-7c y miR-10b. Demostramos cómo realizar la preparación de ADN, transfección, cultivo celular y ensayos de luciferasa en formato de 96 pocillos, y proporcionar herramientas para datosanálisis. En conclusión 3&#39;LIFE es altamente reproducible, rápido, sistemático, e identifica objetivos de alta confianza.

El archivo de salida luminómetro contiene mediciones primas para ambas proteínas luciérnaga y Renilla luciferasa. Este formato RAW es compatible con el &quot;3&#39;LIFE - Análisis de placa única&quot; y &quot;3&#39;LIFE - Análisis multidisco&quot; hojas de cálculo disponible en la página web del laboratorio Mangone ( <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> ). El único análisis placa de hoja de cálculo calcula automáticamente luciérnaga / relación de Renilla, normaliza c...

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Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

La detección de los genes miARN objetivos en de alto rendimiento utilizando el ensayo 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

detection-of-mirna-targets-in-high-throughput-using-the-3-life-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

10.0K vistas.  Arizona State University. Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Video: Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Investigación

Biología

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genoma toda la pantalla de los genes miARN objetivos mediante el objetivo de la misión Carnet de identificación

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana Utilizando el Método lipídico Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

De alto rendimiento mapeo físico de cromosomas utilizando automatizado<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

ARN de predicción de estructura secundaria Utilizando SHAPE de alto rendimiento

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificación de los pares quinasa-sustrato Usando selección de alto rendimiento


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Ensayo gasto energético

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...