Présentation Les microARN sont apparues comme d&#39;importants régulateurs de l&#39;expression génique qui modulent l&#39;activité de nombreux processus biologiques importants. Avec plus de 700 miARN humains identifiés jusqu&#39;à présent 1, il n&#39;est pas surprenant que les mutations et la régulation inappropriée de miARN ont été liés à une variété de désordres physiologiques tels que le cancer et les maladies cardiaques 2,3. Des études récentes ont montré que la majorité des miARN réglementaires des sites de liaison se trouvent dans 3&#39;UTRs 4,5, et certains chercheurs ont estimé qu&#39;il ya des centaines de cibles par miARN dans la cellule 6. Compte tenu de l&#39;importance biologique des miARN, le grand nombre de miARN qui existent et le grand nombre d&#39;objectifs pour chacun d&#39;eux, il est essentiel que les chercheurs sont en mesure d&#39;identifier de manière fiable les cibles endogènes des miARN, de préférence sur des plates-formes se prêtent à haut débit études. Tout en utilisant des outils informatiques tels que miRBase, TargetScan et PicTar 1,6,7 est un moyen puissant pour générer des listes de cibles ARNm putatifs pour toute miARN, les prédictions ne sont pas encore assez précises pour être fier seuls 8. Par conséquent, les chercheurs tirent également parti d&#39;un certain nombre d&#39;approches expérimentales pour identifier les cibles de novo ou de valider des cibles prévues. De nombreuses équipes se sont appuyés sur les mesures à haut débit des taux d&#39;ARNm ou de protéines état ​​stationnaire pour identifier les gènes dont les variations d&#39;expression lorsque l&#39;activité est perturbée miARN 4,9,10. Ces changements sont sans doute biologiquement significative et représentent une première étape importante, mais la mesure des changements dans l&#39;expression globale ne fait pas de distinction entre les effets directs d&#39;un miARN sur une transcription et indirects ou en aval des effets de signalisation. Autres outils puissants qui fournissent des preuves directes pour les miARN-ARNm interactions sont chromatine immunoprécipitation (ChIP) les stratégies que les protéines Argonaute cross-link (et donc le complexe RISC) pour miARN et ARNm, bien identifier les partenaires d&#39;interaction n&#39;a pas immédiatement indiquer les effets fonctionnels d&#39;un tel événement de liaison 5,11. Ainsi, 3&#39;UTR-reporter tests fonctionnels qui fournissent des preuves pour un effet un miRNA sur un particulier UTR sont devenus une composante importante d&#39;une étude approfondie miARN. Ces données d&#39;analyse basée sur des cellules prises ensemble avec les prédictions cibles de calcul ou d&#39;expression et des données de protéomique fournit des preuves solides qu&#39;un 3&#39;UTR particulier est directement réglementé par le miARN d&#39;intérêt. Dans un essai 3&#39;UTR-reporter, le 3&#39;UTR d&#39;un gène d&#39;intérêt est fusionnée à la fin d&#39;un gène rapporteur luciférase. Si le 3&#39;UTR est une cible d&#39;un miARN, la stabilité transcription journaliste et / ou son efficacité de traduction va changer avec variation de la concentration miARN fonctionnels. Donc, contrairement à la transcription seule base des dosages, les dosages journaliste aider à identifier les effets sur les deux ARNm état stable et des niveaux de protéines. Reporter systèmes peuvent également être utilisées pour étudier les effets fonctionnels de mutagenèse un site putatif de liaison miARN dans un 3&#39;UTR de confirmer qu&#39;il est effectivement nécessaire pour la interaction8. Et tandis études à grande échelle en utilisant des tableaux d&#39;expression, les techniques de protéomique, et ChIP Argonaute fournir de précieux échelle du génome de données pour un petit nombre de conditions expérimentales, des tests basés sur les cellules journaliste sont les mieux adaptés à l&#39;élargissement pour l&#39;étude des miARN-3 &#39; interactions UTR dans des centaines ou des milliers de conditions que peut devenir nécessaire pour criblage à haut débit de petites molécules ou d&#39;autres à base de bibliothèque effecteurs. De nombreux scientifiques ont appliqué la technologie de dosage de journaliste à l&#39;étude des miARN-3&#39;UTR interactions. Cependant, avec l&#39;idée que de nombreux miARN chaque cible de centaines transcriptions différentes, il a été difficile pour les chercheurs à utiliser cette approche puissante sur une échelle de haut débit, car les étapes du clonage, de validation et d&#39;optimisation pour créer des milliers de différentes 3&#39;UTR- vecteurs rapporteurs sont souvent des coûts prohibitifs. Dans un effort pour faire de petites et grandes 3&#39;UTR-reporter d&#39;études accessibles à tout chercheur, nous avons créé une collection échelle du génome des humains 3&#39;UTRs pré-cloné dans le système hautement optimisé LightSwitch Luciferase Assay. Le système rapporteur comprend également des vecteurs de contrôle validé, un ensemble de plus de 700 constructions de miARN synthétiques journaliste de cible pour l&#39;utiliser comme contrôles positifs, et une série de protocoles expérimentaux standardisés. En utilisant le protocole suivant, vous pouvez demander si une 3&#39;UTR humain particulier est une cible de votre miARN d&#39;intérêt. Les étapes essentielles de ce flux de travail sont la conception expérimentale, la transfection des constructions rapporteurs et imite miARN, des dosages rapporteur de la luciférase, et l&#39;analyse des données. Pour la conception expérimentale, il est important de sélectionner judicieusement une lignée cellulaire transfectables, constructions rapporteurs expérimentaux et de contrôle, et imite miARN et non-ciblage des contrôles. Commune très transfectables adhlignées cellulaires comme les érents HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, et autres ont souvent bien travailler avec ce protocole. Notes importantes sur la conception expérimentale Le système LightSwitch Luciferase Assay est un système rapporteur entièrement optimisé qui comprend des constructions GoClone utilisant le gène de la luciférase et RenSP Réactifs LightSwitch Luciferase Assay. Utilisez toutes les composantes du système LightSwitch tel que recommandé pour obtenir des résultats optimaux de dosage journaliste. La co-transfection des oligos / plasmides avec des constructions de commutation journaliste GoClone réduit l&#39;ensemble des signaux luciférase de manière non-spécifique. Par conséquent, il est important d&#39;effectuer les combinaisons de transfection suivantes: seul reporter, journaliste + miARN de contrôle non-ciblage, et le journaliste + miARN spécifiques. Notre vecteur empty_3UTR (promoteur fort, aucun UTR) offre un très haut niveau de signal de la luciférase et sert de contrôle positif pour l&#39;efficacité de transfection, et un vecteur miARN synthétiques cibles journaliste peut servir de contrôle positif pour simuler l&#39;activité. En outre, nous recommandons d&#39;utiliser les contrôles GoClone ménage 3&#39;UTR et de contrôles aléatoires pour séparer précisément séquence-spécifique vs des effets non spécifiques. Étude de votre protocole et si possible faire des master mix pour diminuer la variabilité dans vos données dues aux erreurs de pipetage ou l&#39;évaporation. Ce protocole utilise réactifs de transfection DharmaFect Duo (Dharmacon). Jour 1 Conseil important: Choisissez votre lignée cellulaire à bon escient. Pour de meilleurs résultats, utilisez une lignée cellulaire qui est connu pour être transfectables. Nous avons également constaté que la réponse mesurable d&#39;un journaliste 3 &#39;UTR d&#39;un miRNA synoptique est atténué dans des lignées cellulaires avec des niveaux élevés endogènes de ce miARN particulier. Si vous ne savez pas combien miARN votre ligne cellulaire exprime, essayez cibles SGG microARN synthétique qui mesure indirectement l&#39;abondance d&#39;un miARN particulier dans une cellule ainsi que vous informer que la plage dynamique de votre test. 1. Cellules pour produire des semences confluent ≥ 80% au moment de la transfection. <ol><li> Cellules des graines dans un 96-TC et plaque blanche au volume total 100 pi. </li><li> En parallèle, les graines, le nombre approprié de cellules dans une plaque de 96 puits claires pour évaluer la confluence. </li></ol> ASTUCE IMPORTANTE 1: Confluence est la clé pour obtenir de bons résultats dans une expérience imiter. Pour knockdown optimale, les cellules doivent être à 100% confluentes au moment de la transfection. ASTUCE IMPORTANT 2: Utilisation des cellules passage bas pour obtenir les meilleurs résultats. Les cellules qui ont été repiquées trop de fois ont tendance à produire des données de transfection bruyant. Jour 2 Préparer des constructions et des miARN GoClonereporter, puis transfecter dans les cellules confluentes. 2. Préparer Construit <ol><li> Construit GoClone Thaw (ADN plasmidique) à température ambiante. Mélangez bien. </li><li> Centrifugeuse pour enlever la condensation de la PAC. </li></ol> 3. Préparer ARN Micro <ol><li> MicroARN Thaw (imite spécifiques et non-ciblage des contrôles) à température ambiante et centrifuger pour enlever la condensation des chapeaux. </li><li> Diluer à une concentration de travail de 2 uM dans l&#39;eau sans RNase. </li></ol> En plus d&#39;un miARN expérimentale imitent toujours inclure un contrôle de miARN non-ciblage. Co-transfection d&#39;un plasmide et un petit ARN oligo entraîne une baisse du signal que la transfection du plasmide seul. Inclure un ou plusieurs contrôles positifs. Pensez à utiliser l&#39;une des centaines de vecteurs synthétiques miARN journaliste de cible dans le catalogue de SGG. Inclure un ou plusieurs contrôles négatifs ou non spécifiques. SGG a une série de contrôles dont UTR 3 &#39;de gènes de ménage, des fragments aléatoires et / ou le vide (pas d&#39;insérer UTR) de contrôle. L&#39;utilisation d&#39;un ou plusieurs de ces contrôles aux côtés d&#39;une construction expérimentale vous permettra de normaliser les effets non spécifiques liés à la surexpression de votre miRNA spécifique ou le contrôle non-ciblage. 4. Préparer transfections <ol><li> Pour chaque transfection combiner les réactifs suivants pour un dosage unique: </li></ol> Mélange 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Individuels journaliste GoClone: </td><td> 3,33 uL </td></tr><tr><td> microARN: </td><td> Variable * </td></tr><tr><td> Milieux exempts de sérum: </td><td> à 10 uL </td></tr></tbody></table> * Concentration efficace des miARN peut varier de 10 nM-100 nM. Consulter le fabricant pour les miARN concentration appropriée. Conseil important: Ne pas ajouter trop d&#39;imiter. Une fourchette raisonnable pour imiter les concentrations est de 10 à 50 nM dans la réaction finale 100ul. Effectuer au moins trois répliquestransfections TE pour chaque traitement / combinaison UTR et comprennent un volume supplémentaire pour permettre de pipetage erreur. Par exemple, multiplier les volumes seule réaction par 3,5 pour obtenir mélange de transfection assez pour trois puits de transfection de reproduire, y compris un supplément pour le pipetage d&#39;erreur ou d&#39;évaporation. Pour chaque journaliste, mis en place se réplique dans les cas suivants: seul reporter, journaliste + miARN de contrôle non-cible et reporter + miARN spécifiques. Mettre en place des transfections pour les microARN ciblant à la fois identiques à celles d&#39;un contrôle non-ciblage. <ol start="2"><li> Faire remonter la DharmaFECT DUO (Dharmacon) du mélange comme suit pour chaque transfection: </li></ol> Mélange 2 <table border="1"><tbody><tr><td> DharmaFect Duo: </td><td> 0,15 uL </td></tr><tr><td> Milieux exempts de sérum: </td><td> 9,85 uL </td></tr></tbody></table> Le montant de DharmaFECT Duo à ajouter peut être une lignée cellulaire dépendante. Les montants indiqués ci-dessus sont appropriés pour des cellules HT1080. Consultez la documentation du fabricant pour déterminer le montant approprié pour votre lignée cellulaire. Astuce: Faites un mélange de transfection grands en multipliant les volumes ci-dessus par le nombre de journalistes, le nombre de répétitions et le nombre de miARN d&#39;être testé. Lors du calcul de la quantité de mélange de transfection à préparer, être sûr d&#39;inclure une petite quantité supplémentaire pour tenir compte des erreurs de pipetage et l&#39;évaporation. <ol start="3"><li> Laisser le mélange Duo DharmaFECT à incuber à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Après 5 minutes, ajouter 10 ul du mélange Duo DharmaFECT (mélange 2) à chaque tube préparé des 10uL plasmide et / ou miARN (mélange 1). Chaque tube devrait alors contenir un volume de 20 pi par transfection répliquer. </li><li> Incuber chaque mélange pendant 20 minutes à température ambiante. </li><li> Après 20 minutes, ajouter 80 ul de pré-chauffée (37 ° C), sans antibiotique, milieu complet par répétition dans chaque tube pour un total de 100 ul par transfection répliquer. Un bloc de puits profonds peuvent être utilisés pour la préparation de beaucoup de répétitions et d&#39;échantillons simultanément. Mélanger la solution par aspiration et refoulement. </li><li> Retirer la plaque de tête de série de l&#39;incubateur. Vérifiez que les cellules sont au moins 80% de confluence. </li><li> Soigneusement pipette hors les médias de chaque puits. </li><li> Ajouter 100 ul du mélange de transfection (20ul ADN / réactif mix + 80uL médias) à chaque puits. </li><li> Placez la plaque dans l&#39;incubateur pendant la nuit. </li></ol> Ne pas trop incuber. La plupart imite va produire des résultats significatifs sur bona fide des cibles dans les 24 heures. Le niveau de répression mesurable à 48 heures peut être plus grande, mais ce sera bien à la variabilité du bien. Mimic expériences sont plus faciles que les expériences inhibiteur. Alors que la plupart imite de manière significative réprimer les véritables cibles dans les 24 heures, d&#39;importantes dé-répression attribuable à l&#39;inhibiteur peut prendre 48 heures pour être mesurables et sera presque toujours moins prononcé que l&#39;effet de l&#39;imiter. Jour 3 Remarque: des tests luciférase peut être effectuée immédiatement ou les plaques peuvent être congelés à -80 ° C (congélation augmente généralement la lyse des cellules et le signal de la luciférase). Gel et dégel de vos cellules, avant doser pour obtenir les meilleurs résultats. N&#39;oubliez pas de laisser décongeler les cellules gelées à la température ambiante avant d&#39;ajouter réactif de dosage LightSwitch. 5. Mesurer l&#39;activité luciférase avec AssayReagents LightSwitch <ol><li> Retirer la plaque de l&#39;incubateur et amener à température ambiante. </li><li> Préparer des réactifs de dosage LightSwitch (pour le kit LS010, les protocoles de tailles kit d&#39;autres peuvent être trouvés en ligne): <ol><li> Substrat Reconstituer 100X en ajoutant 100 pi de substrat solvant au tube de substrat Assay lyophilisée. Protéger de la lumière et de minimiser le temps à température ambiante. Substrat 100X peuvent être conservés à-20C pour le 2-3 semaines. Pour de meilleurs résultats, utilisez substrat fraîchement reconstitué. </li><li> Préparer la solution de dosage par la fonte bouteille de 10ml de tampon de dosage dans le bain d&#39;eau à température ambiante et ajouter 100 ul de substrat 100X reconstitué avant utilisation. Mélangez bien. </li></ol></li><li> Utiliser une pipette multi-canaux à ajouter 100 ul de solution de dosage LightSwitch (tampon + substrat) directement à chaque échantillon (contenant 100 ul cellules + média) dans une assiette blanche de 96 puits. Si les cellules ont été cultivées dans un autre format de plaque ou flacon, le transfert des échantillons d&#39;une plaque blanche de 96 puits dans le volume total 100 pi (médias ou PBS). </li><li> Recouvrir la plaque, protéger de la lumière, et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Si titrant plus d&#39;une plaque, étaler addition d&#39;une solution de dosage afin que chaque assiette incube pendant 30 minutes avant la lecture. </li><li> Lisez chaque puits pendant 2 secondes dans une plaque de Luminometer (SpectraMax L ou équivalent). </li><li> Calculer le knockdown en calculant rapport signal luciférase pour chaque construction de miARN spécifiques pour le contrôle non-ciblage (= la luminescence miRNA spécifique / non-cible de contrôle). Utilisez les données de l&#39;entretien ménager, au hasard, et les constructions vides à contrôler pour les non-UTR effets des traitements spécifiques. </li></ol> Les résultats représentatifs Cibles 3&#39;UTR de la présence d&#39;un miARN ciblant montrent knockdown luciférase. Le knockdown de l&#39;activité du rapporteur 3&#39;UTR-luciférase par let-7a a été mesurée dans des cellules HT1080 par co-transfection 100 ng de chaque journaliste de construire avec 20nm laissez-7a de contrôle imiter ou non-ciblage, 24 heures d&#39;incubation, puis en lisant le journaliste luminescents signal de l&#39;aide de réactifs LightSwitch Luciferase Assay. <img src="/files/ftp_upload/3343/3343fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. 3&#39;UTRs ponctua et ARID3B humains sont des cibles de l&#39;microARN let-7a. Signaux de journalistes 3&#39;UTR humaines pour la ponctua et les gènes sont significativement ARID3B renversé dans la présence du microARN let-7a imitent alors que les signaux d&#39;entretien ménager et séquence aléatoire UTR sont pas.

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	<li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+cancer+connection:+the+beginning+of+a+new+tale.">MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale.</a> Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).</li><li>Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+Dicer+in+the+heart+leads+to+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure.">Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).</li><li>Baek, D., Villen, J., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455, 64-71 (2008).</li><li>Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+mRNAs+recruited+to+argonaute+2+by+specific+microRNAs+and+corresponding+changes+in+transcript+abundance.">Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance.</a> PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li><li>Lall, S., Krek, A., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+conserved+microRNA+targets+in.">A genome-wide map of conserved microRNA targets in.</a> 16, 460-471 (2006).</li><li>Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-tiered+approach+identifies+a+network+of+cancer+and+liver+disease-related+genes+regulated+by+miR-122.">Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122.</a> J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433, 769-773 (2005).</li><li>Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+changes+in+protein+synthesis+induced+by+microRNAs.">Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs.</a> Nature. 455, 58-63 (2008).</li><li>Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+inhibition+of+small+RNA+function.">Sequence-specific inhibition of small RNA function.</a> PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).</li><li>Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+inhibition+of+microRNA-+and+siRNA-induced+RNA+silencing.">Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing.</a> RNA. 10, 544-5450 (2004).</li><li>Liao, J. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auto-regulatory+suppression+of+c-Myc+by+miR-185-3p.">Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p.</a> J. Biol. Chem. Epub. , (2011).</li></ol>

Les auteurs sont des employés de la génomique commutation qui font des outils et des réactifs apparaissant dans cet article. La production de cet article a été parrainé par la génomique appareillage.

Nous avons créé une collection échelle du génome de la pré-humain cloné 3&#39;UTR-reporter construit pour permettre des études de miARN-3&#39;UTR interactions dans les cellules vivantes. Ici, nous avons montré une méthode reproductible et à haut débit pour les miARN imite co-transfection avec 3&#39;UTR-reporters en utilisant un système rapporteur de la luciférase. Cette méthode repose sur des chercheurs utilisant une lignée cellulaire hautement transfectables et perturber l&#39;activité miARN avec une technique surexpression. Les chercheurs qui utilisent des lignées de cellules mal-transfectables peut envisager d&#39;utiliser notre compagnon lentiviraux 3&#39;UTR-reporter collection créée en collaboration avec Sigma (Mission 3&#39;UTR GoClones Lenti). Traitant les cellules avec miARN imite les résultats dans une expérience surexpression de type, et avec une telle étude, les chercheurs doivent tenir compte du fait que cela peut ou peut ne pas représenter réelle des conditions physiologiques. Pour répondre aux préoccupations surexpression, les chercheurs peuvent utiliser des inhibiteurs de miARN dans plus de mimiques pour étudier l&#39;interaction avec les deux types de perturbation 12-14. Une fois les objectifs miARN chances sont identifiés, les chercheurs peuvent souhaiter mutagénéiser les sites miARN putatif de liaison afin de déterminer si les sites sont nécessaires pour l&#39;interaction fonctionnelle. Ils peuvent également souhaiter évoluer jusqu&#39;à des centaines de tests différents UTR cible potentielle (Boutz). En outre, si les chercheurs sont intéressés de savoir si les miARN affecte la stabilité transcription ou de traduction d&#39;efficacité, les données rapporteur de la luciférase peut être comparé à des mesures de niveaux de transcription état stable. Tout changement dans le signal luciférase qui n&#39;est pas associée à un changement proportionnel dans les niveaux de transcription sera point à un effet sur l&#39;efficacité de traduction. Enfin, les chercheurs peuvent utiliser des vecteurs rapporteurs créer une courbe dose-réponse pour comparer la sensibilité relative des différents UTR à des changements dans la concentration 14 miARN.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Vendeur </td><td> Nombre de catalogue </td></tr><tr><td> Blanc plaques de culture tissulaire (96 puits fond solide) </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td> Effacer plaques de culture tissulaire (96 puits) avec couvercle </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> Réactif LightSwitch Luciferase Assay </td><td> Appareillage </td><td> LS010 </td></tr><tr><td> Réactif de transfection DharmaFECT Duo (0,75 ml) </td><td> Dharmacon </td><td> T-2010-02 </td></tr><tr><td> Sealing Tape Foil Plate </td><td> E &amp; K scientifique </td><td> T592100 </td></tr><tr><td> Respirant Sealing Tape Plate </td><td> E &amp; K scientifique </td><td> T896100-S </td></tr><tr><td> Luminomètre Plate </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax L </td></tr></tbody></table>

identifying targets of human micrornas with the lightswitch luciferase assay system using 3'utr-reporter constructs and a microrna mimic in adherent cells

Les microARN (miARN) sont des régulateurs importants de l&#39;expression génique et jouent un rôle dans de nombreux processus biologiques. Plus de 700 miARN humains ont été identifiés à ce jour ayant chacun jusqu&#39;à des centaines de ARNm cible unique. Outils de calcul, des essais d&#39;expression et de la protéomique, et la chromatine immunoprécipitation des techniques basées sur fournissent des indices importants pour identifier les ARNm qui sont des cibles directes d&#39;un miARN particulier. En outre, les 3&#39;UTR-reporter tests sont devenus une composante importante des études approfondies cibles miARN parce qu&#39;ils fournissent des preuves fonctionnelles et quantifier les effets des miARN spécifiques-3&#39;UTR interactions dans un système basé sur des cellules. Pour permettre à davantage de chercheurs de tirer parti de 3&#39;UTR-reporter dosages et de soutenir la montée en puissance de ces tests à haut débit les niveaux, nous avons créé une collection pangénomique de journalistes 3&#39;UTR humaine luciférase dans la luciférase hautement optimisé LightSwitch système de dosage. Le système comprend également des constructions synthétiques miARN cibles journaliste pour servir de témoins positifs, diverses constructions rapporteurs 3&#39;UTR endogènes, et une série de protocoles expérimentaux normalisés. Nous décrivons ici une méthode pour la co-transfection des différents 3&#39;UTR-reporter construit avec un miARN imitent qui est efficace, reproductible et susceptible d&#39;analyse à haut débit.

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Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Les microARN (miARN) sont des régulateurs importants de l&#39;expression génique et ont été montrés à jouer un rôle dans de nombreux processus biologiques. Afin de mieux comprendre les interactions miARN-UTR, nous avons créé une collection pangénomique de journalistes UTR 3 luciférase jumelé avec un nouveau gène de la luciférase et réactif de dosage, le système LightSwitch.

L&#39;identification des cibles de microARN humaine avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant 3&#39;UTR-reporter Construit et un microARN dans les cellules adhérentes Mimic

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

36.0K vues.  SwitchGear Genomics. Les microARN (miARN) sont des régulateurs importants de l'expression génique et ont été montrés à jouer un rôle dans de nombreux processus biologiques. Afin de mieux comprendre les interactions miARN-UTR, nous avons créé une collection pangénomique de journalistes UTR 3 luciférase jumelé avec un nouveau gène de la luciférase et réactif de dosage, le système LightSwitch.

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Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Etudier biogenèse des membranes avec un Luciferase Assay-Based gène rapporteur

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

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Biologie

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

En fractionnement subcellulaire situ des adhérentes et non-adhérents des cellules de mammifères

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Test clonogénique: cellules adhérentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Une procédure de dépistage chimique pour les glucocorticoïdes de signalisation avec un système de Reporter poisson zèbre Larve luciférase

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Une analyse fonctionnelle pour les jonctions lacunaires examen; Électroporation des cellules adhérentes sur Indium Tin Oxide-

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Détection de cibles miARN dans à haut débit utilisant le test de 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.