Agradecemos al Dr. Fred Rieke por su explicación del tipo de agar-integrado rebanada preparación retina cuando empezamos a usar el protocolo en nuestro laboratorio. También queremos agradecer a Lori Vaskalis de la ilustración esquemática de la visión y los Dres. Veeramuthu Balakrishnan y Cho Soyoun por sus valiosos comentarios sobre el texto y vídeo. Este trabajo fue apoyado por una beca de NEI-NIH RO1, y también fue parcialmente financiado por una beca de la Fundación de Investigación Corea financiado por el Gobierno de Corea [KRF-2008-357-E00032].

<ol>
	<li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levodopa+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncommunicable+Diseases+and+Mental+Health+Cluster,+Noncommunicable+Disease+Prevention+and+Health+Promotion+Department,+Ageing+and+Life+Course+.">Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course .</a> Active ageing: a policy framework. , (2002).</li><li>Schapira, A. 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L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li><li>Ljungdahl, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson's+Disease.">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).</li><li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+directly+from+tissue:+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry.">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides:+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li><li>Deininger, S. -. 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Nosotros no tenemos intereses opuestos a revelar.

Un paso crítico y difícil en nuestro protocolo es la transferencia de la pieza de la retina en la solución de agar (protocolo 3.4). Es necesario retirar cuidadosamente el humor vítreo y la solución de parte residual de la pieza de la retina y la transferencia sin la distorsión o curvatura. Para lograr esto, utilizamos una pequeña espátula (21-401-25B, Fisherbrand) con una punta doblada para formar un ángulo de 90 °, junto con unas pinzas punta angulada (11251-35, Herramientas de Ciencias Artes...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Baja la temperatura de gelificación-agar </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td> Agarosa Tipo VII-A </td></tr><tr><td> Parche pipeta </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 1B150F-4 </td><td> De paredes gruesas (1,5 mm de diámetro exterior) de vidrio de borosilicato </td></tr><tr><td> Extractor vertical </td><td> Narishige </td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td> Para improntas dentales </td><td> Cavex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Primavera tijeras </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td> Ángulo de 45 ° pinzas de punta fina </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> Hoja de afeitar </td><td> Personna </td><td></td><td> De doble filo, se limpiaron con etanol al 70% y H 2 O </td></tr><tr><td> Tubo cilíndrico </td><td> Fisherbrand </td><td> 03-338-1B </td><td> Frascos de polietileno de 2,5 ml de muestra </td></tr><tr><td> Hialuronidasa </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome cortadora </td><td> Leica </td><td> VT1000S o VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio vertical </td><td> Olimpo </td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> 60x de inmersión en agua objetiva </td><td> Olimpo </td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0.90 </td></tr><tr><td> CCD de la cámara </td><td> Sony </td><td> XC-75 </td><td></td></tr><tr><td> Cámara de control </td><td> Hamamatsu </td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor de &lt;/ Td&gt; <td> Sony </td><td></td><td> 13 &quot;monitor en blanco y negro </td></tr><tr><td> Filtro de jeringa </td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0,2 m </td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Sutter instrumento </td><td> MPC-200 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador lock-in </td><td> HEKA </td><td></td><td> EPC-9/10 amplificadores disponen de emulación de software </td></tr><tr><td> Disco giratorio microscopio láser confocal </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-X1 </td><td> Imágenes de células vivas después de la grabación de patch clamp de células enteras </td></tr><tr><td> Slidebook software </td><td> Inteligente de imágenes Instruments (3i) </td><td></td><td> Imágenes de adquisición de datos y análisis </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Solución tampón fosfato </td><td> GIBCO </td><td> 70013 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost diapositivas </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Portaobjetos de vidrio </td></tr><tr><td> Anti-fading agentes </td><td> Biomeda corp. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Láser confocal de barrido microscopio </td><td> Carl Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td> Imágenes de tejidos fijados </td></tr><tr><td> Espátula </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-401-25B </td><td></td></tr><tr><td> Manuel cortadora vertical, </td><td> Narishige </td><td> ST-20 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 BAPTA-1 </td><td> Invitrogen </td><td> O-6806 </td><td> Ca 2 + colorante fluorescente sensible </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 Hydrazide </td><td> Invitrogen </td><td> A 20501MP- </td><td> Colorante fluorescente </td></tr></tbody></table>

patch-clamp capacitance measurements and ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices

Los estímulos visuales se detectan y se transmite en un amplio rango dinámico de la intensidad de la luz y los cambios de frecuencia por las neuronas especializadas en la retina de los vertebrados. Dos clases de neuronas de la retina, los fotorreceptores y las células bipolares, lograr esto mediante el uso de cinta de las zonas de tipo activo, que permiten la liberación de neurotransmisores sostenido y de alto rendimiento durante largos periodos de tiempo. ON-tipo mixto de células bipolares (Mb) terminales de la retina peces de colores, que despolarizar a los estímulos luminosos y recibir caña mezclado y la entrada del cono fotorreceptores, son adecuados para el estudio de la cinta de tipo sinapsis debido a su gran tamaño (~ 10-12 m de diámetro) y de sus numerosas conexiones sinápticas lateral y recíproca con las dendritas de células amacrinas. Acceso directo a las terminales Mb células bipolares en la retina rebanadas de peces de colores con la técnica de patch-clamp permite la medición de la presináptica Ca 2 + corrientes, cambios de membrana de la capacitancia, y la inhibición recíproca retroalimentación sináptica mediada por GABA &lt;sub&gt; A y los receptores GABA C, expresada en los terminales. Presináptica mediciones de la capacitancia de la membrana de la exocitosis permitir un estudio de la plasticidad a corto plazo de la liberación de neurotransmisores excitatorios 14,15. Además, la plasticidad a corto plazo y largo plazo de la liberación de neurotransmisores inhibitorios de las células amacrinas también pueden ser investigados por las grabaciones de la inhibición por retroalimentación recíproca de llegar a la terminal Mb 21. En períodos cortos de tiempo (por ejemplo, ~ 10 s), la inhibición GABAérgica retroalimentación recíproca de las células amacrinas se somete a dos a dos pulsos a través de la depresión el agotamiento del pool de vesículas del GABA 11. La dinámica sináptica de microcircuitos de la retina en la capa plexiforme interna de la retina por lo tanto puede ser estudiado directamente. La técnica de corte cerebral se introdujo más de 40 años, pero sigue siendo muy útil para la investigación de las propiedades eléctricas de las neuronas, tanto en el soma celular único, dendrita o axón único, y microcircuit sináptica nivel 19. Los tejidos que son demasiado pequeños para ser pegado directamente en la cámara de corte son a menudo primero incrustado en agar (o coloca en un papel de filtro) y luego en rodajas 20, 23, 18, ​​9. En este video, que emplean la técnica de agar antes de la incorporación de la retina con peces de colores. Algunos de los terminales de células gigantes bipolar en nuestra retina rebanadas de peces de colores son axotomized (axón de corte) durante el procedimiento de corte. Esto nos permite aislar una sola entrada presináptica terminales nerviosas, porque la grabación de las terminales axotomized excluye las señales del compartimiento de la soma-dendríticas. Por otra parte, también se puede grabar desde intacta Mb células bipolares, mediante el registro de los terminales conectados a los axones que no se han reducido durante el procedimiento de corte. En general, el uso de este protocolo experimental que ayuda en los estudios de la fisiología de la retina sináptica, el análisis de microcircuitos funcionales, y la transmisión sináptica en las sinapsis de la cinta.

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Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

A continuación se describe un protocolo para la preparación de agar-incrustados trozos de retina que son adecuados para la electrofisiología y la Ca2 + imágenes. Este método permite estudiar la cinta del tipo de sinapsis en la retina utilizando microcircuitos directa patch-clamp grabaciones de una sola terminales nerviosas presinápticas.

Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca 2 + Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

patch-clamp-capacitance-measurements-ca2-imaging-at-single-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

18.0K vistas.  Oregon Health and Science University. A continuación se describe un protocolo para la preparación de agar-incrustados trozos de retina que son adecuados para la electrofisiología y la Ca2 + imágenes. Este método permite estudiar la cinta del tipo de sinapsis en la retina utilizando microcircuitos directa patch-clamp grabaciones de una sola terminales nerviosas presinápticas.