우리가 실험실에서 프로토콜을 사용하여 시작할 때 우리는 한천 - 임베디드 망막 슬라이스 준비 그의 종류 설명 박사 프레드 Rieke 감사합니다. 우리는 또한 도식 개요 및 Drs의 그림에 대한 로리 Vaskalis 주셔서 감사합니다. 텍스트 및 비디오에 도움이 덧글에 대한 Veeramuthu Balakrishnan과 Soyoun 조. 이 작품은 네이 - NIH RO1 교부금에 의해 지원되었고, 또한 부분적으로 한국 정부에 의해 자금을 한국 학술 진흥 재단 그랜트에 의해 지원되었다 [KRF - 2008-357 - E00032].

<ol>
	<li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levodopa+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncommunicable+Diseases+and+Mental+Health+Cluster,+Noncommunicable+Disease+Prevention+and+Health+Promotion+Department,+Ageing+and+Life+Course+.">Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course .</a> Active ageing: a policy framework. , (2002).</li><li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+disorders:+advances+in+cause+and+treatment.">Movement disorders: advances in cause and treatment.</a> Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).</li><li>Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+levodopa-induced+dyskinesias+in+Parkinson's+disease:+problems+with+the+current+model.">Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model.</a> Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).</li><li>Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-DOPA-induced+dyskinesia+in+the+rat+is+associated+with+striatal+overexpression+of+prodynorphin-+and+glutamic+acid+decarboxylase+mRNA.">L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).</li><li>Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+fosB+expression+is+causally+linked+with+l-DOPA-induced+abnormal+involuntary+movements+and+the+associated+upregulation+of+striatal+prodynorphin+mRNA+in+a+rat+model+of+Parkinson's+disease.">Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).</li><li>Hanrieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+striatal+neuropeptides+revealed+by+imaging+mass+spectrometry.">Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. , (2011).</li><li>Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li><li>Ljungdahl, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson's+Disease.">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).</li><li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+directly+from+tissue:+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry.">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides:+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li><li>Deininger, S. -. O., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).</li><li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis.">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li><li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics.">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li><li>Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).</li><li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response.">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li><li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P.">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides.">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry.">a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li></ol>

우리는 공개 경쟁 관심이 없습니다.

우리의 프로토콜에서 중요하고 어려운 단계는 한천 용액 (3.4 프로토콜)에 망막의 작품의 전송이다. 그것은 조심스럽게 망막 조각에서 유리체 유머와 잔여 슬라이스 솔루션을 제거하고 왜곡이나 굴곡없이 전송하는 것이 필요합니다. 이것을 달성하기 위해, 우리는 제보가 망막을 위치에 직각 팁 포셉 (11251-35, 파인 과학 도구)와 함께, 90 ° 각도를 형성하기 위해 구부리고 작은 주걱을 (2...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 낮은 겔화 온도 한천 </td><td> 시그마 </td><td> A0701 </td><td> 아가로 오스 유형 VII - A </td></tr><tr><td> 패치 피펫 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 1B150F - 4 </td><td> 두꺼운 벽으로 둘러싸인 (1.5 mm 외경) borosilicate 유리 </td></tr><tr><td> 수직 풀러 </td><td> Narishige </td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td> 치과 왁스 </td><td> Cavex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 봄 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td> 45 ° 직각 좋은 팁 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> 면도날 </td><td> Personna </td><td></td><td> 양날, 70 % 에탄올과 H 2 O로 세척 </td></tr><tr><td> 원통형 튜브 </td><td> Fisherbrand </td><td> 03-338 - 1B </td><td> 폴리에틸렌 샘플 튜브 2.5 ML </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> 시그마 </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome 슬라이 </td><td> Leica </td><td> VT1000S 또는 VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> 직립 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> 60x 물 침지 목표 </td><td> 올림포스 산 </td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0.90 </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> 소니 </td><td> XC - 75 </td><td></td></tr><tr><td> 카메라 컨트롤러 </td><td> 하마 마츠 </td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td> 모니터 &lt;/ TD&gt; <td> 소니 </td><td></td><td> 13 &quot;흑백 모니터 </td></tr><tr><td> 주사기 필터 </td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0.2 μm의 </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> 셔터 악기 </td><td> MPC - 200 </td><td></td></tr><tr><td> 잠금 기능 증폭기 </td><td> HEKA </td><td></td><td> EPC-9/10 증폭기는 소프트웨어 에뮬레이션을 가지고 </td></tr><tr><td> 회전 디스크 레이저 공촛점 현미경 </td><td> Yokogawa </td><td> CSU - X1 </td><td> 패치 후 라이브 세포 이미징은 전체 휴대폰 녹음 클램프 </td></tr><tr><td> Slidebook 소프트웨어 </td><td> 지능형 이미징 인 스트 루먼트 (3i) </td><td></td><td> 이미징 데이터 수집 및 분석 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 시그마 </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 버퍼 용액 </td><td> 노병BCO </td><td> 70,013 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td></td><td> 슬라이드 유리 </td></tr><tr><td> 안티 페이딩 대리인 </td><td> Biomeda 법인. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 </td><td> 칼 자이스 혈구 </td><td> LSM 710 </td><td> 고정 조직의 영상 </td></tr><tr><td> 주걱 </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-401 - 25B </td><td></td></tr><tr><td> 마누엘 수직 슬라 이서 </td><td> Narishige </td><td> ST - 20 </td><td></td></tr><tr><td> 오레곤 그린 488 BAPTA - 1 </td><td> Invitrogen </td><td> O - 6806 </td><td> 칼슘 2 + 민감한 형광 염료 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 555 히드라 지드 </td><td> Invitrogen </td><td> A - 20501MP </td><td> 형광 염료 </td></tr></tbody></table>

patch-clamp capacitance measurements and ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices

시각적 자극은 척추 망막 전문 뉴런에 의해 빛의 강도 및 주파수 변화 넓은 동적 범위에서 감지하고 전달하고 있습니다. 망막 뉴런, photoreceptors 및 바이폴라 전지의 두 클래스는 오랜 기간 동안 지속과 높은 처리량 신경 전달 물질 자료를 활성화 리본 타입의 활성 영역을 사용하여이 작업을 수행할. 빛의 자극에 depolarize 및 혼합로드 및 원뿔 photoreceptor 입력을받을 금붕어 망막에서 타입의 혼합 바이폴라 셀 (MB) 터미널, 그들의 큰 크기로 인해 모두 리본 타입의 시냅스 (~ 10-12의 연구에 적합 μm의 직경)와 amacrine 세포 dendrites 자신의 여러 측면과 상호 시냅스 연결합니다. 패치 - 클램프 기법과 금붕어 망막 조각에서 MB 바이폴라 전지 터미널에 직접 액세스 presynaptic 칼슘 2의 측정을 허용 + 전류, 멤브레인 용량 변경, GABA에 의해 중재 상호 시냅스 피드백 억제 &lt;서브&gt; A 및 GABA C 수용체가 터미널에 표시됩니다. exocytosis의 Presynaptic 막 커패시턴스 측정 하나는 흥분성의 신경 전달 물질 방출 14,15의 단기 소성을 공부하실 수 있습니다. 또한, amacrine 세포의 억제 신경 전달 물질 방출의 단기 및 장기 소성도 MB 터미널 21에 도착 상호 피드백 억제의 기록 조사 수 있습니다. 시간 (예 : ~ 10들)의 짧은 기간 동안 amacrine 세포에서 GABAergic 상호 피드백 억제는 GABA 소포 풀 고갈 11을 통해 이점 - 펄스 우울증을 겪습. 망막의 내부 plexiform 계층에서 망막 microcircuits의 시냅스 역학 따라서 직접적으로 공부하실 수 있습니다. 두뇌 - 슬라이스 기술은 40 년 이상 전에 발표했지만 여전히 매우 모두 하나의 세포 소마 단일 dendrite 또는 축삭에서 뉴런의 전기적 특성의 조사에 유용하고, m가되었습니다icrocircuit 시냅스 레벨 19. 깔끔히 챔버에 직접 접착 너무 작은 조직은 종종 첫번째 한천에 포함된 (또는 필터 종이에 위치) 그리고 20, 23, 18, ​​9 슬라이스하고 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 금붕어 망막을 사용하여 미리 포함 한천 기술을 사용합니다. 금붕어 망막 우리의 조각에있는 거대한 바이폴라 셀 단말기의 일부가 깔끔히 절차를 수행하는 동안 (축삭 절단) axotomized 있습니다. 이것은 axotomized 터미널에서 녹화가 소마 - 돌기 구획에서 신호를 배제하기 때문에 우리, 하나 presynaptic 신경 터미널 입력을 분리 할 수​​ 있습니다. 또한, 하나도 깔끔히 절차를 수행하는 동안 컷되지 않은 axons에 연결된 터미널에서 기록하여, 손상 MB 바이폴라 세포에서 녹화할 수 있습니다. 전반적으로,이 실험 프로토콜의 사용이 망막 신경 생리학, microcircuit 기능 분석 및 리본 시냅스에서 시냅스 전달 연구에 도움이됩니다.

Watch this Scientific Journal Video about Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices at JoVE.com

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

여기 우리는 전기 생리학 및 Ca2 + 이미징에 적합 한천 - 임베디드 망막 조각의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 하나 하나 presynaptic 신경 터미널 직접 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 망막 microcircuits의 리본 형태의 시냅스를 공부하실 수 있습니다.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

patch-clamp-capacitance-measurements-ca2-imaging-at-single-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

18.0K 조회수.  Oregon Health and Science University. 여기 우리는 전기 생리학 및 Ca2 + 이미징에 적합 한천 - 임베디드 망막 조각의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 하나 하나 presynaptic 신경 터미널 직접 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 망막 microcircuits의 리본 형태의 시냅스를 공부하실 수 있습니다.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 + 영상

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA^{2 + 영상}