Biz laboratuarımızda protokolü kullanarak başladığı agar gömülü retina dilim hazırlık yaptığı tür bir açıklama için teşekkür ederim Dr. Fred Rieke. Ayrıca resimde şematik bakış ve Dr Lori Vaskalis teşekkür ederim. Metin ve video hakkında faydalı yorumlar için Veeramuthu Balakrishnan ve Soyoun Cho. Bu çalışma bir NEI-NIH RO1 hibe ile desteklenen ve aynı zamanda kısmen Kore Hükümeti tarafından finanse edilen bir Kore Araştırma Vakfı Hibe Programı tarafından desteklenen [KRF-2008-357-E00032].

<ol>
	<li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levodopa+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncommunicable+Diseases+and+Mental+Health+Cluster,+Noncommunicable+Disease+Prevention+and+Health+Promotion+Department,+Ageing+and+Life+Course+.">Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course .</a> Active ageing: a policy framework. , (2002).</li><li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+disorders:+advances+in+cause+and+treatment.">Movement disorders: advances in cause and treatment.</a> Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).</li><li>Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+levodopa-induced+dyskinesias+in+Parkinson's+disease:+problems+with+the+current+model.">Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model.</a> Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).</li><li>Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-DOPA-induced+dyskinesia+in+the+rat+is+associated+with+striatal+overexpression+of+prodynorphin-+and+glutamic+acid+decarboxylase+mRNA.">L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).</li><li>Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+fosB+expression+is+causally+linked+with+l-DOPA-induced+abnormal+involuntary+movements+and+the+associated+upregulation+of+striatal+prodynorphin+mRNA+in+a+rat+model+of+Parkinson's+disease.">Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).</li><li>Hanrieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+striatal+neuropeptides+revealed+by+imaging+mass+spectrometry.">Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. , (2011).</li><li>Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li><li>Ljungdahl, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson's+Disease.">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).</li><li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+directly+from+tissue:+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry.">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides:+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li><li>Deininger, S. -. O., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).</li><li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis.">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li><li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics.">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li><li>Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).</li><li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response.">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li><li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P.">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides.">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry.">a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li></ol>

Biz hayır, ifşa etmek için yarışıyor.

Protokolünde kritik ve zor bir adım agar solüsyonu (protokol 3.4) retina parça transferi . Retina parça vitreus mizah ve artık dilim çözüm dikkatlice çıkarın ve bozulma veya bükmeden aktarmak için gereklidir. Bunu başarmak için, biz, bir ucu retina pozisyonu için açılı ucu forseps (11.251-35, Güzel Bilim Araçları) ile birlikte, 90 ° açı oluşturacak şekilde eğildi küçük bir spatula (21-401-25b, Fisherbrand) dilim çözüm transfer süreci boyunca parçası. Retina dilim ve...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Düşük sıcaklık jelleşme agar </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td> Agaroz tip VII-A </td></tr><tr><td> Patch pipet </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 1B150F-4 </td><td> Kalın duvarlı (1,5 mm dış çapı) borosilikat cam </td></tr><tr><td> Dikey çektirmesi </td><td> Narishige </td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td> Diş balmumu </td><td> Cavex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bahar makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td> 45 ° açılı ince uçlu forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> Jilet </td><td> Personna </td><td></td><td> Çift-kenarlı,% 70 etanol ve H 2 O ile temizlenmelidir </td></tr><tr><td> Silindirik tüp </td><td> Fisherbrand </td><td> 03-338-1B </td><td> Polietilen numune şişeleri 2.5 ml </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome dilimleme makinesi </td><td> Leica </td><td> VT1000S veya VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Dik mikroskop </td><td> Olympus </td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> 60x su daldırma hedefi </td><td> Olympus </td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0.90 </td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> Sony </td><td> XC-75 </td><td></td></tr><tr><td> Kamera denetleyicisi </td><td> Hamamatsu </td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td> Monitörü &lt;/ Td&gt; <td> Sony </td><td></td><td> 13 &quot;siyah ve beyaz monitör </td></tr><tr><td> Şırınga filtre </td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0.2 mikron </td></tr><tr><td> Mikromanipülatör </td><td> Sutter Enstrüman </td><td> MPC-200 </td><td></td></tr><tr><td> Lock-amplifikatör </td><td> Heka </td><td></td><td> EPC-9/10 amplifikatörler yazılım emülasyonu </td></tr><tr><td> Dönen disk lazer konfokal mikroskop </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-X1 </td><td> Yamadan sonra canlı hücre görüntüleme tam hücre kayıt kelepçe </td></tr><tr><td> Slidebook yazılımı </td><td> Akıllı Görüntüleme Cihazları (3i) </td><td></td><td> Görüntüleme veri toplama ve analiz </td></tr><tr><td> Paraformaldehit </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat tampon çözeltisi </td><td> GIKAM </td><td> 70013 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost slayt </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Slayt cam </td></tr><tr><td> Anti-solmaya ajanlar </td><td> Biomeda corp. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Konfokal lazer tarama mikroskobu </td><td> Carl Zeiss </td><td> EKK 710 </td><td> Sabit doku görüntülemesi </td></tr><tr><td> Spatula </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-401-25b </td><td></td></tr><tr><td> Manuel dikey dilimleme makinesi </td><td> Narishige </td><td> ST-20 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 BAPTA-1 </td><td> Invitrogen </td><td> O-6806 </td><td> Ca 2 + hassas floresan boya </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 Hydrazide </td><td> Invitrogen </td><td> A-20501MP </td><td> Floresan boya </td></tr></tbody></table>

patch-clamp capacitance measurements and ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices

Görsel uyaranlar, gözdeki uzman nöronların ışık yoğunluğu ve frekans değişimleri, geniş bir dinamik aralık üzerinden tespit edilir ve iletilir. Retina nöronlar, fotoreseptör ve bipolar hücreleri iki sınıf, uzun süreler boyunca sürekli ve yüksek verimli nörotransmitter sürümü sağlayan şerit tip aktif bölgeleri, kullanarak gerçekleştirmek. Goldfish retina ışık uyaranlara depolarize ve karma çubuk ve koni fotoreseptör giriş ON-tipi karma bipolar hücre (Mb) terminalleri, büyük boyutları nedeniyle her iki şerit tip sinaps (~ 10-12 çalışma için uygundur mikron çaplı) ve amacrine hücre dendritler ile çok sayıda yanal ve karşılıklı sinaptik bağlantıları. Goldfish yama klemp tekniği ile retina dilim Mb bipolar hücre terminalleri doğrudan erişim presinaptik Ca 2 ölçümünü sağlar + akımları, membran kapasitans değişiklikleri ve GABA aracılı karşılıklı sinaptik geribildirimle engelleme &lt;alt&gt; A ve GABA C reseptörleri terminallerinde dile getirdi. Ekzositoz presinaptik membran kapasitans ölçümleri bir eksitatör nörotransmitter sürümü 14,15 kısa vadeli plastisite çalışma izin verir. Buna ek olarak, kısa vadeli ve uzun vadeli plastisite amacrine hücrelerinden inhibitör nörotransmitter salınımı Mb terminali 21 gelen karşılıklı geribildirimle engelleme kayıtları incelenmiştir. Amacrine hücreleri GABAerjik karşılıklı geribildirimle engelleme süresi (örneğin ~ 10 sn) kısa süre içinde, GABA vezikül havuzu tükenmesi 11 ile eşleştirilmiş nabız depresyon uğrar. Retinanın iç pleksiform tabakası retina mikrodevreler sinaptik dinamikleri dolayısıyla doğrudan incelenebilir. Beyin-dilim tekniği, 40 yılı aşkın önce tanıtıldı ama hala çok nöronların elektriksel özellikleri, hem tek hücreli soma, tek dendrit ve akson soruşturma için yararlı ve microcircuit sinaptik düzeyde 19. Doğrudan dilimleme odasının üzerine yapıştırılmış olması çok küçük dokular genellikle ilk agar gömülü (ya da bir filtre kağıdı yerleştirilir) ve sonra 20, 23, 18, ​​9 dilimlenmiş. Bu video, goldfish retina kullanarak ön gömme agar tekniği kullanmaktayız. Bazı goldfish retinanın dilim dev bipolar hücre terminalleri dilimleme işlemi sırasında axotomized (akson-cut). Bu axotomized terminallerinden kayıt soma-dendritik bölmesi sinyalleri hariç tutması nedeniyle, tek presinaptik sinir terminal girişleri izole etmek için izin verir. Alternatif olarak, bir de dilimleme işlemi sırasında kesilmiş aksonların bağlı terminallerinden kaydederek, sağlam Mb bipolar hücrelerin kaydedebilirsiniz. Genel olarak, bu deneysel protokol kullanımı sinaptik fizyolojisi, retina mikrodevreler fonksiyonel analiz, ve şerit sinaps sinaptik iletim çalışmaları yardımcı olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices at JoVE.com

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Burada elektrofizyoloji ve Ca2 + görüntüleme için uygun agar-gömülü retina dilim hazırlanması için bir protokol. Bu yöntem, tek presinaptik sinir uçları doğrudan patch-klemp kayıtları kullanarak retina mikrodevreler şerit-tip sinaps bir çalışma sağlar.

Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca 2 + Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

patch-clamp-capacitance-measurements-ca2-imaging-at-single-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

18.0K Görüntüleme.  Oregon Health and Science University. Burada elektrofizyoloji ve Ca2 + görüntüleme için uygun agar-gömülü retina dilim hazırlanması için bir protokol. Bu yöntem, tek presinaptik sinir uçları doğrudan patch-klemp kayıtları kullanarak retina mikrodevreler şerit-tip sinaps bir çalışma sağlar.