私たちがラボでプロトコルを使用して起動するときに我々は、寒天包埋網膜スライス標本の彼の種類の説明については、博士フレッドリーケに感謝。我々はまた、回路図の概要と博士の図については、ローリVaskalisに感謝。テキストとビデオでの有益なコ​​メントVeeramuthuバラクリシュナンとSoyounチョ。この作品は、NEI - NIH RO1の助成金によって支えられて、そしてまた、部分的に韓国政府の資金による韓国学術振興財団の助成金によって支えられている[KRF - 2008 - 357 - E00032]。

<ol>
	<li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levodopa+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncommunicable+Diseases+and+Mental+Health+Cluster,+Noncommunicable+Disease+Prevention+and+Health+Promotion+Department,+Ageing+and+Life+Course+.">Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course .</a> Active ageing: a policy framework. , (2002).</li><li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+disorders:+advances+in+cause+and+treatment.">Movement disorders: advances in cause and treatment.</a> Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).</li><li>Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+levodopa-induced+dyskinesias+in+Parkinson's+disease:+problems+with+the+current+model.">Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model.</a> Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).</li><li>Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-DOPA-induced+dyskinesia+in+the+rat+is+associated+with+striatal+overexpression+of+prodynorphin-+and+glutamic+acid+decarboxylase+mRNA.">L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).</li><li>Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+fosB+expression+is+causally+linked+with+l-DOPA-induced+abnormal+involuntary+movements+and+the+associated+upregulation+of+striatal+prodynorphin+mRNA+in+a+rat+model+of+Parkinson's+disease.">Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).</li><li>Hanrieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+striatal+neuropeptides+revealed+by+imaging+mass+spectrometry.">Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. , (2011).</li><li>Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li><li>Ljungdahl, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson's+Disease.">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).</li><li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+directly+from+tissue:+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry.">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides:+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li><li>Deininger, S. -. O., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).</li><li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis.">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li><li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics.">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li><li>Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).</li><li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response.">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li><li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P.">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides.">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry.">a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li></ol>

我々は、開示することは競合する利害関係はありません。

我々のプロトコルで重要かつ困難なステップは、寒天溶液（プロトコル3.4）への網膜の一部の移転です。それは慎重に網膜の部分から硝子体液と残留スライスの溶液を除去し、歪みや曲がりなく、それを転送する必要があります。これを達成するために、我々は先端が網膜の位置を斜めに先端の鉗子（11251〜35、ファイン科学のツール）、と一緒に、90 °の角度を形成するために?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>低ゲル化温度寒天</td><td>シグマ</td><td> A0701 </td><td>アガロース型VII - </td></tr><tr><td>パッチピペット</td><td>世界の精密機器</td><td> 1B150F - 4 </td><td>肉厚（1.5ミリメートル外径）ホウケイ酸ガラス</td></tr><tr><td>垂直プラー</td><td>ナリシゲ</td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td>歯科用ワックス</td><td> Cavex </td><td></td><td></td></tr><tr><td>春のはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15003〜08 </td><td></td></tr><tr><td> 45 °傾斜微細な先端の鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11251〜35 </td><td></td></tr><tr><td>かみそりの刃</td><td> Personna </td><td></td><td>両刃、70％エタノールとH 2 Oで洗浄</td></tr><tr><td>円筒管</td><td> Fisherbrand </td><td> 03から338 - 1B </td><td>ポリエチレンのサンプルバイアル2.5ミリリットル</td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>シグマ</td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td>ビブラトームスライサー</td><td>ライカ</td><td> VT1000SまたはVT1200S </td><td></td></tr><tr><td>正立顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> 60倍の水浸対物レンズ</td><td>オリンポス</td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0.90 </td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td>ソニー</td><td> XC - 75 </td><td></td></tr><tr><td>カメラコントローラ</td><td>浜松市</td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td>モニター&lt;/ TD&gt; <td>ソニー</td><td></td><td> 13&quot;白と黒のモニタ</td></tr><tr><td>シリンジフィルタ</td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0.2μmの</td></tr><tr><td>マニピュレーター</td><td>サッターインストゥルメント</td><td> MPC - 200 </td><td></td></tr><tr><td>ロックインアンプ</td><td> HEKA </td><td></td><td> EPC-9/10アンプは、ソフトウェアエミュレーションを持っている</td></tr><tr><td>回転するディスクのレーザー共焦点顕微鏡</td><td>横河電機</td><td> CSU - X1 </td><td>パッチクランプホールセル記録後に細胞イメージングを生きる</td></tr><tr><td> Slidebookソフトウェア</td><td>インテリジェントイメージングインスツルメンツ（3iの） </td><td></td><td>イメージングデータ収集と分析</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液</td><td> GIBCO </td><td> 70013 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrostスライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>スライドガラス</td></tr><tr><td>退色防止剤</td><td> Biomedaコープ。 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td> LSM 710 </td><td>固定組織のイメージング</td></tr><tr><td>へら</td><td> Fisherbrand </td><td> 21から401 - 25B </td><td></td></tr><tr><td>マヌエル垂直スライサー</td><td>ナリシゲ</td><td> ST - 20 </td><td></td></tr><tr><td>オレゴングリーン488 BAPTA - 1 </td><td>インビトロジェン</td><td> O - 6806 </td><td>のCa 2 +感受性蛍光色素</td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 555ヒドラジド</td><td>インビトロジェン</td><td> - 20501MP </td><td>蛍光染料</td></tr></tbody></table>

patch-clamp capacitance measurements and ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices

視覚刺激は、脊椎動物の網膜の専門ニューロンによる光の強度と周波数の変化の広いダイナミックレンジにわたって検出され、搬送される。網膜神経細胞、光受容体と双極細胞の2つのクラスは、長期間にわたって持続的かつ高スループットの神経伝達物質の放出を可能にするリボン型アクティブゾーンを、使用することによってこれを実現する。光刺激に対する脱分極との混合ロッドと錐体視の入力を受け取る金魚の網膜のON型の混合双極細胞（Mb）の端末は、サイズが大きいため、両方のリボン型シナプス（〜10-12の研究に適していますμmの直径）とアマクリン細胞の樹状突起との数多くの側面と相互シナプスの接続に。パッチクランプ法と金魚網膜スライスにおけるMbの双極細胞の端末へのダイレクトアクセスは、シナプス前のCa 2 +電流、膜容量の変化、およびGABAによって仲介相互シナプスフィードバック阻害の測定を可能にする&lt;サブ&gt; AおよびGABA C受容体は、端末上で表明した。エキソサイトーシスのシナプス前膜の容量測定は1つが興奮性神経伝達物質の放出14,15の短期可塑性を調べることができます。さらに、アマクリン細胞から抑制性神経伝達物質放出の短期的および長期的な可塑性はまた、Mbの端子21に到達する相互フィードバック阻害の記録によって調査することができます。時間の短い期間（例えば〜10秒）以上、アマクリン細胞からのGABA作動性相互フィードバック阻害は、GABA小胞プールの枯渇11を介してペアパルスうつ病を受ける。網膜の内網状層における網膜マイクロ回路のシナプスダイナミクスは、このように直接研究することができる。 脳スライスの技術は40年以上前に導入したが、神経細胞の電気的特性の調査のためにまだ非常に便利です、両方とも単一の細胞体、単一の樹状突起や軸索、およびmにしたicrocircuitシナプスのレベル19。スライスチャンバーに直接接着するには小さすぎる組織は、多くの場合、最初寒天に埋め込 ​​む（またはろ紙上に配置）し、20、23、18、9スライスされています。このビデオでは、我々は金魚の網膜を使用してプリ埋め込み寒天法を採用しています。金魚の網膜の私達のスライスに巨大な双極細胞の一部の端子は、スライス手順の間に（軸索カット）axotomizedされています。 axotomized端子から録音が相馬樹のコンパートメントからの信号を除外するため、これは、私たちは、単一のシナプス前神経終末の入力を分離することができます。別の方法として、また、スライス作業中に切断されていない軸索に接続された端末から記録することで、無傷のMbの双極細胞から記録することができます。全体的に、この実験的なプロトコルの使用は、網膜シナプス生理学、マイクロ回路機能解析、およびリボンシナプスにおけるシナプス伝達の研究に役立ちます。

Watch this Scientific Journal Video about Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices at JoVE.com

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

ここでは、電気生理学とCa2 +イメージングに適した寒天包埋網膜スライスを調製するためのプロトコルについて説明します。このメソッドは1つが、単一のシナプス前神経末端の直接パッチクランプ記録を用いて網膜マイクロ回路のリボン型シナプスを研究することができます。

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

patch-clamp-capacitance-measurements-ca2-imaging-at-single-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

18.0K ビュー.  Oregon Health and Science University. ここでは、電気生理学とCa2 +イメージングに適した寒天包埋網膜スライスを調製するためのプロトコルについて説明します。このメソッドは1つが、単一のシナプス前神経末端の直接パッチクランプ記録を用いて網膜マイクロ回路のリボン型シナプスを研究することができます。

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +イメージング

パッチクランプキャパシタンス測定とCa^{2 +イメージング}