Los autores agradecen al MSCRF TEDCO (2009-MSCRFE-0098-00) y NIH R21CA152473 de apoyo.

1. Siembra Celular <ol><li> No permitir que las células crezcan a overconfluency. Usar células tempranas de paso cuando la transfección de células primarias. </li><li> Veinticuatro horas antes de la transfección, Tripsinizar las células, se cuentan las células usando un hemocitómetro, y se diluye la suspensión celular con los medios para conseguir la densidad celular deseada (células / volumen). Se siembran las células en el tejido claro cultivo tratado con fondo plano de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal y depósito. La densidad seleccionada debe dar 70-80% de confluencia en el día de la transfección. Por ejemplo, como se muestra en la Tabla 1, las células se diluyeron a 25 a 50 células / l durante los datos de transfección muestran aquí. </li></ol> 2. La transfección celular <ol><li> La dilución del polímero y las poblaciones de ADN. Descongelar polímero y soluciones de ADN de stock a temperatura ambiente (RT). Dilución de la solución stock de polímero y la solución madre de ADN, por separado en claros placas de 96 pocillos utilizando una pipeta de doce canales, Con el disolvente apropiado a las concentraciones requeridas para obtener el peso de polímero deseado para relaciones en peso de ADN (peso / peso). En este caso, el disolvente elegido es 25 mM de tampón de acetato de sodio (pH = 5,2). <ol><li> ADN de dilución. Típicamente, el ADN se almacenó a 1 mg / ml se diluye en tampón de acetato sódico a una concentración de 0,03 a 0,06 mg / ml en una clara no-cultivo de tejido tratado con placa de 96 pocillos (un pocillo para una sola formulación). Tabla 2 muestra el ADN típico protocolo de dilución para una única formulación se utiliza para transfectar cuatro pocillos replicados en una placa de 96 pocillos sembradas con células procedentes de la Etapa 1. </li><li> Polímero de dilución. El 100 mg / ml de polímero / DMSO solución se diluye en tampón de acetato sódico de acuerdo con la concentración requerida para obtener el polímero deseado en el ADN en peso / peso de relación. El rango de peso / peso de proporciones utilizadas típicamente para la administración de genes con poli (beta-amino-éster) s (PBAEs) es de 20 a 100. Polímeros PBAE se diluye primero a 10 mg / ml, seguido por la dilución protocolo como se muestra en la Tabla 3. Las diluciones de polímero se puede realizar en un claro no de cultivo de tejido tratado con placa de 96 pocillos que coincida con la orientación de la muestra de la placa de dilución de ADN. </li></ol></li><li> Formación de nanopartículas. Añadir la solución PBAE a un volumen igual de la solución de ADN plasmídico utilizando una pipeta de doce canales y mezclar vigorosamente. Deje incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la auto-ensamblaje. </li><li> Nanopartículas de transfección. Después de auto-ensamblaje, 20 nanopartículas mu l por pocillo se añaden gota a gota a medio de cultivo utilizando la pipeta de doce canales. Pocillos replicados se deja sin tratamiento o se transfectan con reactivos disponibles comercialmente como controles. Las células transfectadas se incubaron a 37 ° C durante dos a cuatro horas y luego los pozos se remplazó con medio fresco (100 l / pocillo). La elección del tiempo de incubación dependerá de la línea de células, condiciones de cultivo, y sistema de transfección. La diferencia en la transfeccióneficacia y toxicidad de la célula como resultado de la variación de período de incubación se cuantificó mediante el protocolo de análisis descrito en la Etapa 3. </li></ol> 3. Análisis de la eficiencia de transfección y toxicidad celular Eficiencia de la transfección se analizó visualmente con un microscopio de fluorescencia y se cuantificó usando un citómetro de flujo cuarenta y ocho horas después de la transfección. Toxicidad celular se analiza visualmente con un microscopio de fluorescencia y se cuantificó usando el CellTiter 96 Aqueous One ensayo de veinticuatro horas después de la transfección. <ol><li> Microscopía de fluorescencia. Visualmente analizar los pocillos para la expresión del gen reportero transfectadas (por ejemplo, EGFP o DsRed) usando el canal de fluorescencia adecuado. Adquisición de imágenes para cada pocillo, la elección de los campos de visión que representan adecuadamente la eficacia de transfección de las formulaciones particulares (Figura 1). Tome nota de cualquier toxicidad celular observado visualmente. </li><li> Citometría de Flujo. <ol><li> Usar pipetas multicanal para preparar la placa de 96 pocillos para la citometría de flujo. Lavar con PBS, Tripsinizar con 30 l / pocillo de tripsina / EDTA, neutralizar con 170 l de tampón FACS (PBS + 2% de FBS), pipeta hacia arriba y abajo en cada pocillo, incluyendo alrededor de los bordes, y transferir la totalidad de 200 l de volumen de cada pocillo en los pocillos correspondientes de un fondo redondo o fondo V-96-así placa. </li><li> Centrifugar la placa a 130 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar los medios de comunicación 170 mu l de cada pocillo y las células pipeta para resuspender evitando burbujas. Para utilizar una viabilidad mancha como yoduro de propidio (PI), añadir 10 l de tampón FACS + PI (50:1 tampón FACS: PI dilución; concentración PI stock 1 mg / ml) a cada pocillo. Coloque inmediatamente en hielo y la cubierta de la luz. </li><li> Inicie el citómetro de flujo Accuri C6, el HyperCyt 96 y el apego, y el software HyperView. Utilice el diseño de HyperView y las fichas del Protocolo de elegir el adecuado ptipo de retraso, diseño de placa y otros ajustes tales como movimiento / sip / enjuague / shake tiempo. Para el protocolo anterior, los siguientes parámetros se utilizaron, un primer pre-placa durante un minuto, y un batido de pre-placa durante 30 segundos a 2.400 rpm. Tiempo Sip se fijó durante 15 segundos a 15 rpm, una sonda de enjuague cada pocillo durante 2 seg, y una inter-así agitar cada 12 pozos de 12 segundos a 2.400 rpm. El movimiento de la inter-así es importante para mantener las células dispersas en los medios de comunicación, así como para mejorar la capacidad para procesar los datos mediante la inclusión de pausas programadas entre grupos de pozos (en este caso 12 sec). </li><li> La pestaña HyperView identificación Bueno para procesar los datos y se separan en el pozo correspondiente (Figura 2). Con el fin de identificar los pocillos individuales, puede ayudar a utilizar el software de filtro de ruido, así como incluyendo una base de filtro, incluso bajo la configuración avanzada. </li><li> Cuantificar el porcentaje de células transfectadas positivamente en vivo por gating conveniente separar pop diferenteulations (Figura 3). Primero ver los datos de flujo de un diagrama de dispersión de FSC frente a SSC a fin de separar las células del desechos (Figura 3A). Si yoduro de propidio (PI) se utilizó, puerta la población de células individuales y la vista que los datos sobre una parcela de FSC frente a FL3 a fin de separar las células vivas de las células muertas y la puerta de las células vivas. Con el fin de cuantificar el número de células transfectadas, ver la población de células vivas en los canales apropiados, por ejemplo, GFP puede ser visto en FL1. Uso de la población no tratada, puerta de las células no tratadas con el fin de identificar la señal de fondo (Figura 3B). Las células transfectadas positivamente a continuación, se puede aislar utilizando esta puerta y mediante la visualización de las poblaciones transfectadas utilizando tanto la dispersión y gráficos de contorno (Figura 3C y 3D). Puede haber un continuo de células transfectadas positivamente, como diferentes células se transfectaron con diferentes grados de fluorescencia. </li></ol></li><html><li> CellTiter 96 Aqueous One ensayo <ol><li> Transfectar otra placa exactamente de la misma manera que para las mediciones de toxicidad celular. </li><li> Premezcla 1 ml de la solución acuosa CellTiter 96 Un ensayo con 10 ml de medio fresco. Retire el medio de las células y utilizar una pipeta multicanal para añadir 110 l de la solución premezclada + medios de comunicación por pocillo. </li><li> Medir la absorbancia a 490 nm cada intervalo de una hora de 1 a 4 horas hasta que la absorbancia del pozo con la condición sin tratamiento está en el intervalo lineal del ensayo. Incluye cuatro pozos de control con medios de sólo + Solución para una lectura de absorbancia de fondo. </li><li> Los valores promedio de la absorbancia de los cuatro pocillos por duplicado por condición y restar la absorbancia media de fondo de cada medio. Normalizar la media corregida para cada condición tratada con la media corregida de la condición no tratada para determinar la viabilidad celular por ciento. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 4. nanopartículas acerca de tallas con NTA y plásmido Cálculos partículas por <ol><li> Primer sistema de la fluídica de la NS500 NanoSight mediante la ejecución de la bomba de diluyente hacia adelante a aproximadamente 1/5o la velocidad máxima y la bomba de muestra hacia atrás a aproximadamente 1/10th la velocidad máxima. Continúe hasta que el sistema de fluidos se limpia con diluyente. </li><li> Preparar las nanopartículas para ser analizados. En el caso de PBAEs, separado diluir el ADN plásmido de archivo (1 mg / ml) y almacenadas PBAE (100 mg / ml) en tampón de acetato sódico (25 mM, pH 5) en tubos Eppendorf. </li><li> Diluir la concentración de ADN de plásmido a 0,06 mg / ml. La concentración de polímero puede variar dependiendo de la requerida peso-peso de polímero de ADN (por ejemplo, para 60 peso / peso de las partículas de polímero se diluye a 3,6 mg / ml). </li><li> Añadir la solución de polímero a un volumen igual de la solución de ADN plasmídico y mezclar vigorosamente. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la auto-ensamblaje. </li><li> Dilaúd la disolución de nanopartículas 100 veces en PBS para que la concentración de nanopartículas para estar en el rango apropiado para NTA y para obtener un volumen final de al menos 500 l. </li><li> Cargar la muestra en el NanoSight colocando el tubo de carga en la muestra de tubo de Eppendorf (Figura 4A). Asegúrese de no introducir burbujas de aire. </li><li> En el modo de captura, aumente el nivel de la cámara hasta que las partículas se pueden ver. Ajuste el enfoque de modo que las partículas de aspecto liso (Figura 4A y 4B). </li><li> Mientras que en el modo normal, ajustar el nivel de la cámara pasado el punto de que todas las partículas se pueden ver en pantalla. Entonces, disminuir el nivel de la cámara al nivel más bajo de tal manera que las partículas pueden todo todavía ser observado. Si el nivel de la cámara intermedia que se necesita, entre en el modo avanzado y modificar el obturador de la cámara y obtener los niveles adecuados. </li><li> Revise visualmente para asegurarse de que son entre 20 - 100 partículas en el screen el. Un número ideal para el seguimiento de las nanopartículas es de aproximadamente 50 partículas. Si hay demasiados o muy pocos, enjuague el NS500, ajustar la dilución en PBS, y volver a cargar la muestra. </li><li> Ajustar la duración de captura de acuerdo con el modo normal. Típicamente de 30 - 60 segundos es una longitud de captura adecuada (Figura 4B). </li><li> Para cargar la siguiente muestra, enjuague el sistema y vuelva a cargar la nueva muestra. </li><li> Una vez que se capturan vídeos, pase a la etapa de procesamiento mediante la apertura de un archivo de vídeo. </li><li> Hay una serie de parámetros que se pueden sintonizar con el fin de procesar mejor un vídeo (Figura 4C). El objetivo es seleccionar los parámetros que mejor captura de cada partícula en la pantalla, como se indica por una marca de cruz roja en la pantalla sobre cada partícula (Figura 5). </li><li> Aumentar la ganancia de la pantalla para ver mejor las partículas. En el modo estándar o avanzada, seleccione el ajuste automático de los parámetros pinchandog las casillas correspondientes. En el caso de que la configuración automática no seleccionar adecuadamente las partículas, desactive la casilla y establecer manualmente los parámetros (Figura 4C). </li><li> Una vez que todas las partículas son recogidas en pantalla, haga clic en el botón de proceso del software para procesar el archivo de vídeo (Figura 4C). Esto proporciona la distribución del tamaño de partícula, promedio del tamaño, así como la concentración de partículas. </li><li> Con el fin de asegurarse de que la concentración de partículas es preciso, cambiar la dilución PBS, tales como mediante el aumento de la dilución por 2x, y repetir el procedimiento anterior. Medición de múltiples diluciones de la misma muestra se recomienda para asegurar que la medición de la concentración de la muestra es correcta. Un intervalo aceptable para una medición es 10 7 -10 9 partículas / ml. </li><li> Verificar que todos los plásmidos se incorporan en nanopartículas mediante la ejecución de la electroforesis en gel de las nanopartículas y la evaluación de si cualquier ADN libre presente.Si no todos los plásmidos se encapsulan, usar técnicas estándar para medir la absorbancia de ADN con el fin de cuantificar el total plásmidos encapsulados. </li><li> Para calcular el número medio de plásmidos por partícula, dividir la concentración total de plásmido encapsulado por la concentración de partículas NTA medido. Con el fin de estimar el plásmido distribución de partículas por muestra, utilizar la primera partícula NTA histograma tamaño para calcular la fracción de volumen de cada bin 1-nm de partícula. Multiplicar esta distribución fracción de volumen por la cantidad de plásmido total para obtener el número de plásmidos en cada bin. Divida estos números por el número de partículas en cada intervalo para obtener el número de plásmidos-per-partículas para cada tamaño de partícula (Figura 6). </li></ol>

<ol>
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Los autores reportan no tener ningún conflicto de interés.

Los protocolos anteriores describen métodos para evaluar la eficacia de la transfección de las formulaciones de nanopartículas, así como una forma de caracterizar el tamaño de partícula y carga de ADN de las nanopartículas. El número de plásmidos por partícula es un parámetro importante que puede ayudar a predecir la eficacia de la partícula y también se puede utilizar para la determinación de la dosis. Nanopartículas de análisis de seguimiento se puede realizar en una variedad de diferentes soluciones a...

La determinación del número de plásmidos acomplejados por nanopartículas es importante diseñar eficaces estrategias basadas en nanopartículas de suministro de genes, en particular para el cosuministro de los plásmidos múltiples a la misma célula objetivo, como se requiere a menudo en estudios de células madre reprogramación 12. Algunos enfoques para calcular el número de plásmidos asociados con una nanopartícula solo se han descrito, y cada enfoque tiene inconvenientes en las técnicas utilizadas para la estimación de 13-16. Puntos cuánticos (QD) etiquetado combinado con TEM se ha utilizado para estimar plásmidos por partícula en nanopartículas a base de quitosano. Estimación con esta técnica QD es complicado debido a la necesidad de etiquetar el ADN, que puede alterar sus propiedades de autoensamblaje, la posibilidad de que el ADN no marcado encapsulado no se detecta directamente; plásmidos potencialmente superpuestos y QDS en las imágenes de TEM 2D de partículas, y otros supuestos simplificadores 13. Un enfoque alternativo que es unpplicable cuando microdominios ordenados existen en las partículas ha sido utilizado para estudiar el ADN lipopoliamina complejos a través de la crio-microscopía electrónica de transmisión (crio-TEM), dispersión de rayos X, y dispersión de luz dinámica (DLS) 14,15. Desafortunadamente, los materiales tales como las nanopartículas poliméricas aquí investigados no son aplicables con este método. . En otro estudio, Collins et al usaron un flujo de partículas imagen técnica de análisis para estudiar (Lys) 16-que contiene péptido / ADN complejos, sin embargo, su método sólo se puede evaluar más grandes, partículas de tamaño micrométrico 16. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo ensayo y flexible para cuantificar el número de plásmidos por nanopartícula 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivo </td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2MV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón de acetato sódico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Diluir a 25 mM en agua desionizada </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP ADN </td><td> Elim biofarmacéuticos </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> ADN DsRed </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, ramificado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 Aqueous One </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiales </td></tr><tr><td> Borrar fondo plano de 96 pocillos, estériles </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Borrar fondo redondo de 96 pocillos, estériles </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12-canales Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 y 50-300 l </td></tr><tr><td> Microscopio de Fluorescencia </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Número de modelo: AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri citómetro de flujo </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt adjunto </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

No virales de suministro de genes usando nanopartículas poliméricas se ha convertido en un enfoque atractivo para la terapia génica para tratar enfermedades genéticas y 1 como una tecnología para la medicina regenerativa 2. A diferencia de los virus, que tienen problemas de seguridad importantes, las nanopartículas poliméricas se pueden diseñar para ser no tóxico, no inmunogénico, no mutagénico, más fáciles de sintetizar, químicamente versátiles, capaces de llevar a mayor carga de ácido nucleico y biodegradable y / o sensible ambientalmente. Los polímeros catiónicos se auto-ensamblan con ADN cargado negativamente a través de la interacción electrostática para formar complejos del orden de 100 nm que son comúnmente denominadas nanopartículas poliméricas. Ejemplos de biomateriales utilizados para formar nanoescala nanopartículas de suministro de genes policatiónicos incluyen polilisina, polifosfoésteres, poli (amidoaminas) s y polietilenimina (PEI), que es un no-degradable off-the-shelf polímero catiónico comúnmente usado para el suministro de ácido nucleico 1,3. Poli (beta-aminoéster) s (PBAEs) son una nueva clase de polímeros catiónicos 4 que son hidrolíticamente degradables 5,6 y se ha demostrado ser eficaz en la entrega de genes para tipos de células difíciles de transfectar tales como células de la retina humanas endoteliales (HRECs) 7, las células epiteliales mamarias de ratón 8, las células humanas de cáncer de cerebro 9 y macrovasculares (vena umbilical humana, HUVEC) células endoteliales 10. Un nuevo protocolo para caracterizar las nanopartículas poliméricas que utilizan nanopartículas de análisis de seguimiento (NTA) se describe. En este enfoque, tanto la distribución del tamaño de partícula y la distribución del número de plásmidos por partícula se obtienen 11. Además, una placa de ensayo de alto rendimiento de transfección de 96 pocillos para la detección rápida de la eficacia de la transfección de nanopartículas poliméricas se presenta. En este protocolo, poli (beta-amino-éster) s (PBAEs) se utilizan como polímeros de modelo y células humanas endoteliales retinianas (HRECs) se utilizan como moDel células humanas. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para evaluar cualquier nanopartícula polimérica y cualquier tipo de célula de interés en un formato de placa de múltiples pocillos.

La Figura 1 muestra una imagen de microscopía de fluorescencia de una muestra de una transfección con éxito de HRECs con el plásmido EGFP. La imagen de campo claro es útil para asegurar que las células mantienen su morfología habitual. Adicionalmente, ensayos de viabilidad celular, tales como MTS o ensayos similares, se puede utilizar para evaluar la toxicidad de las nanopartículas 7. La citometría de flujo, como se ha descrito, se puede utilizar para cuantificar la eficiencia de la ...

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Un protocolo para el análisis de nanopartículas de seguimiento (NTA) y de alto rendimiento de citometría de flujo para evaluar las nanopartículas poliméricas de suministro de genes se describe. NTA se utiliza para caracterizar la distribución del tamaño de partícula de nanopartículas y la distribución de partículas por plásmido. De alto rendimiento de la citometría de flujo permite una evaluación cuantitativa eficacia de la transfección de una biblioteca de biomateriales de suministro de genes.

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

evaluation-polymeric-gene-delivery-nanoparticles-nanoparticle

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.7K vistas.  Johns Hopkins University School of Medicine. Un protocolo para el análisis de nanopartículas de seguimiento (NTA) y de alto rendimiento de citometría de flujo para evaluar las nanopartículas poliméricas de suministro de genes se describe. NTA se utiliza para caracterizar la distribución del tamaño de partícula de nanopartículas y la distribución de partículas por plásmido. De alto rendimiento de la citometría de flujo permite una evaluación cuantitativa eficacia de la transfección de una biblioteca de...

Video: Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale (nanoparticles). Nanoparticles can be engineered in a precise fashion where their size, composition and surface chemistry can be carefully controlled. This enables unprecedented freedom to modify some of the fundamental properties of their cargo, such as solubility, diffusivity, biodistribution, release characteristics and immunogenicity. Since their inception, nanoparticles have been utilized in many areas of science and medicine, including drug delivery, imaging, and cell biology1-4. However, it has not been fully utilized outside of "nanotechnology laboratories" due to perceived technical barrier. In this article, we describe a simple method to synthesize a polymer based nanoparticle platform that has a wide range of potential applications. 
The first step is to synthesize a diblock co-polymer that has both a hydrophobic domain and hydrophilic domain. Using PLGA and PEG as model polymers, we described a conjugation reaction using EDC/NHS chemistry5 (Fig 1). We also discuss the polymer purification process. The synthesized diblock co-polymer can self-assemble into nanoparticles in the nanoprecipitation process through hydrophobic-hydrophilic interactions.
The described polymer nanoparticle is very versatile. The hydrophobic core of the nanoparticle can be utilized to carry poorly soluble drugs for drug delivery experiments6. Furthermore, the nanoparticles can overcome the problem of toxic solvents for poorly soluble molecular biology reagents, such as wortmannin, which requires a solvent like DMSO. However, DMSO can be toxic to cells and interfere with the experiment. These poorly soluble drugs and reagents can be effectively delivered using polymer nanoparticles with minimal toxicity. Polymer nanoparticles can also be loaded with fluorescent dye and utilized for intracellular trafficking studies. Lastly, these polymer nanoparticles can be conjugated to targeting ligands through surface PEG. Such targeted nanoparticles can be utilized to label specific epitopes on or in cells7-10.

This article describes a nanoprecipitation method to synthesize polymer-based nanoparticles using diblock co-polymers. We will discuss the synthesis of diblock co-polymers, the nanoprecipitation technique, and potential applications.

Formulación de nanopartículas poliméricas mediante la técnica de dibloque Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Investigación

Bioingeniería

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays de polímeros de alto rendimiento para el descubrimiento de Biomateriales

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Síntesis combinatoria y de alto rendimiento liberación de proteínas de película de polímero y nanopartículas Bibliotecas

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

De alto rendimiento de síntesis de carbohidratos y funcionalización de nanopartículas polianhidrido

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Fabrication polimérico matriz de microagujas por fotolitografía

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

Fabricación y entrega de medicamentos Aplicaciones de seda nanopartículas

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de IgG1 modelo en células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash NanoPrecipitation para la encapsulación de compuestos hidrofóbicos e hidrofílicos en nanopartículas poliméricas

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...