1. Protocolo para el uso de varios frascos de cultivo celular <ol><li> Preparación de los buques y la adición de la suspensión de células <ol><li> Preparar el medio de crecimiento de las células según sea necesario. </li><li> Alinee Multi-frasco vertical sobre su lado con la tapa hacia arriba sobre la superficie de trabajo (campana estéril de flujo laminar). <ol><li> Estos frascos están disponibles en tres formatos y de 5 capas y el uso de un similar patrón de flujo de trabajo como un frasco T-175. </li></ol></li><li> Aflojar y remover las tapas. Añadir la cantidad necesaria de pre-calentado medio en un matraz con una pipeta de 50 o 100 ml o por infusión. <ol><li> Pipetas que son ≤ 10 ml puede llegar al fondo de la vasija, cuando varios frascos se colocan verticalmente con la tapa hacia arriba. ≥ 10 ml pipetas pueda llegar hasta el buque inmediatamente pasado el logotipo en el frasco de Multi-, proporcionando así un portal conveniente de añadir un mayor volumen de medios de comunicación para los buques. </li></ol></li><li> Para evitar la propagación del medio, permiten flujo de líquido a flómo lo largo de la pared interna de la tapa del Multi-frasco (logo-lado). </li><li> Añadir suspensión celular de una reserva de células concentradas en un medio de crecimiento a través de la capa superior con una pipeta de 10 ml y frascos de tapa. Consejos: - Transporte Multi-frascos en un carro al sitio de la incubadora y realizar los pasos restantes. - La densidad de siembra de células puede variar dependiendo del tipo de célula, media y duración de la cultura necesita. Comience con la densidad de siembra y el volumen de los medios de comunicación al que se utiliza en el estándar T-175 frascos y se multiplica por 3 o 5 en función del frasco de Multi-formato utilizado. </li></ol></li><li> La mezcla de células <ol><li> Mix posición: Sostenga el frasco en posición vertical Multi-con el logotipo de frente a usted y a su vez hacia la izquierda a un ángulo de 45 ° con el puerto de mezcla frente a usted. </li><li> La celebración en el mismo ángulo, con cuidado de inclinación Multi-frasco de adelante hacia atrás (en el cuello lejos de usted) hasta que el líquido en la capa superior drena totalmente downwards a través del puerto de mezcla. Giran en torno a la mezcla de babor. </li><li> Del mismo modo, agite suavemente Multi-frasco de atrás hacia adelante (el cuello hacia usted) hasta que esté medio drena por completo de la capa de abajo hacia arriba a través del puerto de mezcla. Repita los pasos 1.2.2 y 1.2.3, una vez más para asegurar una mezcla adecuada. </li><li> Lleva Multi-frasco de nuevo a la posición de mezcla (paso 1.2.1) y vaya al paso 1.3 </li><li> Por otra parte, la suspensión de células se pueden preparar externa del frasco Multi-y la suspensión de células se puede agregar a la embarcación con una pipeta o suave vertido. <ol><li> Puerto de combinación permite en recipiente de mezcla de células con los medios de comunicación y elimina la necesidad de hacer grandes cantidades de células en suspensión externa. </li><li> También permite la igualdad de medios a través de las capas de la Multi-frasco </li></ol></li></ol></li><li> El equilibrio de fluidos <ol><li> Luego de mezclar / adición de la suspensión celular, lugar Multi-frasco vertical sobre una superficie plana para igualar el volumen de líquido ecuaciónlly en todas las capas. </li></ol></li><li> Separación líquido en cada capa <ol><li> Sostenga el frasco de Multi-con el logotipo hacia arriba y gire hacia la derecha a un ángulo de 45 ° a la partición del líquido en cada una de las capas. Consejo: - Para obtener mejores resultados, es importante utilizar una superficie plana para los pasos 1.3-1.4 </li></ol></li><li> Transporte <ol><li> Una vez que los medios de comunicación que contiene la suspensión de células se divide, transporte Multi-frasco en el mismo ángulo de 45 ° (a la derecha) como en el paso 1.4.1 con los medios de comunicación del puerto mezcla en incubadora. Esta posición también es adecuado cuando la eliminación de frascos de la incubadora para su visualización en un microscopio. </li></ol></li><li> La colocación de Multi-frasco en incubadora útil <ol><li> La celebración de Multi-frasco en el ángulo de 45 ° (a la derecha, lejos de la mezcla de un puerto), gire suavemente hacia abajo en posición horizontal en la superficie de la incubadora (utilizando la esquina del puerto como una mezclapivote). Coloque Multi-frasco con el logotipo hacia arriba. <ol><li> Falcon Multi-frasco de diseño permite a los barcos que se apilan y se las mantiene en su lugar por una costilla resistente de apilamiento. </li></ol></li></ol></li><li> Distribución de células y los reactivos <ol><li> Después de la colocación de Multi-frasco de planos en la superficie de trabajo, con suavidad hacia adelante y atrás y de lado a lado para distribuir uniformemente sobre las superficies de las células de la cultura teniendo cuidado de no derramar el líquido de cada capa. Pila de frascos. <ol><li> Este frasco es de un material ópticamente transparente y las células de la última capa se pueden ver fácilmente en un microscopio. </li></ol></li></ol></li><li> Medios de intercambio <ol><li> Aspirar mientras se inclina el frasco Multi-a la izquierda (mezcla de babor) con el logotipo hacia usted. </li><li> A continuación, la inclinación, el frasco de Multi-a la derecha, sigue aspirar todos los medios de comunicación residual. </li><li> Agregue la cantidad adecuada de los medios de comunicación y siga los pasos 1.3-1.7 </li></ol></li></ol> 2.La recolección de células multi-Frascos <ol><li> Para disociar las células, se alinean varios frascos vertical y llevar a cada uno a la mezcla de posición (paso 1.2.1). Invierta suavemente frascos con cuello de frente a usted a fin de que los medios de comunicación para drenar la capa superior de la Multi-Flask. </li><li> Inserte un 5 o 10 ml de la punta de aspiración a través del cuello hasta llegar a nivel de líquido cerca del puerto de mezcla. Aspirar medio agotado. </li><li> Añadir disociación reactivo / tampón de lavado y llevar a la posición de la mezcla como en el paso 1.2.1, a continuación, proceder y seguir los pasos 1.3 a 1.7. Neutralizar con medio de cultivo / agente de neutralización y se vierte la suspensión de células en un tubo receptor o invertir frasco de manera que las células de drenaje para la capa superior de la nave y recoger las células con una pipeta de 10 ml. Consejo: Para mejorar la recuperación de las células o de los reactivos, llevar Multi-frasco para mezclar la posición (paso 1.2.1), invertir con el cuello hacia el operador para permitir el drenaje completo de los medios de comunicación de Al<html> l capas de la capa superior. Luego, incline Multi-frasco de las agujas del reloj a 45 º (distancia desde el puerto de mezcla), mientras que el frasco de Multi-sigue siendo invertida. Utilice una pipeta (1-10 ml) para recoger el resto de los reactivos. </li></ol> 3. Volumen de trabajo recomendado en Falcon Multi-Frascos Medios de cultivo 3-Capa: 75-150 ml por Multi-frasco 5-Capa: 125-250 ml por Multi-frasco La disociación del agente 3-Capa: ≥ 15 mL por Multi-frasco 5-Capa: ≥ 25 ml por frasco de Multi- Sugerencia: Comience con un volumen de medio utilizado en la norma T-175 frascos y se multiplica por 3 o 5 veces dependiendo del frasco de Multi-formato de evaluación para que ml por unidad de superficie sigue siendo el mismo. 4. Los resultados representativos: 1. Diseño de Falcon Multi-frasco files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg &quot;/&gt; . Figura 1: Multi-frasco de cultivo celular barcos están disponibles en 3 - y 5-capa formato apilable para ampliación de las células proporcionando 525 y 875 cm 2 de superficie de crecimiento, respectivamente. Pipeta de acceso facilita la adición y la eliminación de las células y los reactivos en y fuera de la nave. Presencia de la mezcla de puertos permite la rápida en recipiente de mezcla y ecualización de los medios de comunicación en todas las capas de la Multi-frasco. 2. Rendimiento celular utilizando Multi-Frasco: Estas embarcaciones están disponibles en 3 capas y formatos de 5 capas que corresponden a 3 y 5 veces la superficie de la T-175 frascos. En consecuencia, ≥ 3 y 5 veces (130 ± 6,8 x 10 6 y 218 ± 23.6 x 10 6 células, respectivamente), el número de células BHK-21 (riñón de hamster) las células fueron cultivadas y se recuperó de Multi-frasco en comparación con el T-175 frascos (43,2 ± 3,5 x 10 6 células; Fig.2a). Celular rendimiento por uárea de superficie de nit fue equivalente en 3 - y 5-capa y multi-frascos T-175 frascos de BHK-21, LNCaP (adenocarcinoma de próstata humana línea celular), Hep-G2 (línea celular humana hepatocarcinoma), Ecopack 2-293 (humanos línea de células renales) cultivadas por un período de 48-96h (Fig.2b) en medios de cultivo (35 ml por cada capa) según lo recomendado por el fabricante de células (ATCC, Sigma y / o Clontech). Las células fueron enumerados en un sistema automatizado de Vi-contador de células (1). <img alt="Figura 2A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2A.jpg" /> Figura 2A: de tres y cinco veces el número de células BHK-21 se cultivaron y se recuperó de 3 - y 5-capa Multi-Frascos en comparación con el T-175 frascos. Rendimiento esperado se determinó que el rendimiento en media de células de control T-175 frascos multiplicado por tres veces y cinco para el 3 - y frascos Multi-5-capa, respectivamente (n = 4 frascos / formato). <img alt="Figura 2B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2B.jpg" /><br/ 2B&gt; Figura: el rendimiento de la célula por cm 2 fue equivalente en 3 - y 5-capa y multi-frascos T-175 frascos de BHK-21, LNCaP, y las células HepG2 EcoPack2-293. Cada barra representa la media de 4 a 6 frascos. Células BHK-21 (11.000 células/cm2) se cultivaron durante 72 horas, las células LNCaP (20.000 células/cm2) y EcoPack2-293 células (~ 35.000 células/cm2) se cultivaron durante 96 horas y las células HepG2 (25.000 células / cm 2 ) se cultivaron durante 48 horas antes de la cosecha. 3. Medios de distribución entre las capas de Multi-frasco Medio de cultivo celular (DMEM, Invitrogen) a cinco capas múltiples frascos (250 buques mL/5-layer) y se separó en capas de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. Distribución de los medios de comunicación se midió mediante la perforación de agujeros en cada capa y los medios de comunicación bombea desde las capas individuales. Peso del fluido recuperado de cada capa se encontró que era relativamente uniforme de capa a capa, como se muestra en la Fig. 3. Son los siguientes: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (g). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig3.jpg" /> Figura 3. Distribución de los medios de comunicación uniforme en cada una de las cinco capas de una capa de 5-Multi-Flask. Medio de cultivo celular fue introducido en varios matraces (250 buques ml/5-layer), equilibrado y dividido en capas individuales. Los medios de comunicación se bombea a través de agujeros perforados en las capas individuales y el peso de fluido se registró a partir de cada capa (n = 6 frascos). 4. Celular distribución entre las capas de Multi-frasco Las células pueden ser añadidos y mezclados dentro del frasco de Multi-. Nos distribución simulada de las células entre las capas de Multi-frasco con gotas (10μm; Polysciences Inc.) de tamaño similar a las células. Suspensión de bolas se añadió en el recipiente Frasco de Multi-utilizando una pipeta de 10 ml a través de la capa superior y se mezcla con los medios de comunicación en el barco, como described en el protocolo anterior. Distribución de bolas se midió por los agujeros de perforación en cada capa y el líquido que contiene suspensión de bolas se bombea desde las capas individuales. Concentración de bolas recuperadas de cada capa se leyó en un contador Coulter y grabado. Se muestra a continuación son equivalentes entre capas distribuciones de grano de 3 capas múltiples frascos (Fig.4a). La mezcla de puertos permite la distribución homogénea de las células y los reactivos entre las capas Multi-Flask. <img alt="Figura 4A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4A.jpg" /> Figura 4: Distribución de bolas en cada una de las tres capas de una capa de 3 Multi-Flask. Una suspensión de cuentas (3,6 x10 6 / ml) se añadió al medio se distribuye en varios matraces (suspensión de perlas: el volumen de los medios de comunicación es de 1:10, vol: vol) y se mezcla, seguido por el equilibrio y los pasos partición utilizando el protocolo descrito. Concentración de bolas recuperadas de cada capa (medio bombeado a través de agujeros perforados en cada capa) fue leído en un recuento de Coulterer y grabado. Se muestra a continuación son equivalentes entre capas distribuciones de cuentas en 3 - Multi-capa de Frascos (n = 5 frascos) A continuación se muestran imágenes representativas de los patrones de coloración Ecopack 2-293 de las células cultivadas a la confluencia&gt; 80% en tres capas múltiples frascos de medios de cultivo suplementados. Monocapas de células fueron fijadas y teñidas con cristal violeta y Multi-frasco capas fueron cortadas y las imágenes escaneadas (2). Tenga en cuenta, los patrones de células fue homogénea en todas las capas de Multi-Frasco (Fig.4B). Se obtuvieron resultados similares con múltiples tipos de células evaluados (datos no mostrados). <img alt="Figura 4B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4B.jpg" /> Figura 4B: Esta figura ilustra el crecimiento de células homogéneas entre las capas de varios frascos. Ecopack-2-293 células cultivadas a la confluencia&gt; 80% en 3 capas múltiples frascos y T-175 fueron fijadas y teñidas con cristal violeta. Frasco de múltiples vasos fueron cortadas y cada capa manchada escaneado fue. 5 El suministro de aire en el Multi-Flask.: El análisis de los medios de comunicación dedicado al uso de Bioprofile FLEX analizador (3,4) (Nova Biomedical) de EcoPack2-293 células cultivadas durante 96 horas no mostraron diferencias en la saturación del aire de las células cultivadas en varios frascos de 5 capas vs T-175 frascos (81.03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% del ambiente O 2). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig5.jpg" /> Figura 5: saturación del aire (ambiente% O 2) de los medios de comunicación pasaron fueron similares en los medios de comunicación pre-mezclado de varios frascos de 5 capas vs T-175 frascos. EcoPack2-293 células se sembraron a una densidad de 35.000 células / cm 2 y se cultivan durante 96 horas antes a los medios de análisis (n = 3 frascos).

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	<li>Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+automated+instrument+for+viability+and+concentration+mesurements+of+cryopreserved+hematopoietic+cells.">Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells.</a> Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).</li><li>Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+growth+assay+for+epidermal+cell+cultures+by+their+crystal+violet+binding+capacity.">Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity.</a> Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).</li><li>Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Flux+analysis+of+CHO+cell+metabolism+in+the+late+non-growth+phase.">Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).</li><li>Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+elevated+pCO2+and+osmolality+on+growth+of+cells+and+production+of+antibody&#x2013;fusion+protein+B1:+a+case+study.">Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody&#x2013;fusion protein B1: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 21, (2005).</li><li>Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+culture+medium+volume+on+cell+density+and+life-span+of+human+diploid+fibroblasts.">The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts.</a> Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).</li><li>Flaherty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tips and Techniques for enhancing your cell culture. , (2009).</li><li>Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. , (2011).</li><li>DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+coordinately+modulates+liver+transcription+factors+and+hepatocyte+morphology.">The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology.</a> Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).</li><li>Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crucial+role+of+&#x03B2;1+integrins+for+keratinocyte+migration+in+vitro+and+during+cutaneous+wound+repair.">A crucial role of &#x03B2;1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair.</a> Dev. 129, 2303-2303 (2002).</li></ol>

Todos los autores son empleados de la empresa Becton Dickinson, segmento Biosciences, Discovery diagnóstico, de laboratorios de la Unidad.

El presente estudio demuestra el aumento de la productividad que el diseño del frasco de Multi-ofrece a los investigadores. Si bien es importante que siga los pasos descritos anteriormente para un rendimiento óptimo cuando se utilizan varios matraces, son pocos los pasos críticos en este protocolo que se consideran más esenciales. Estos incluyen: (i) la mezcla de las células y los reactivos a través del puerto de mezcla en el recipiente (ii) el transporte de Multi-frasco en un ángulo de 45 ° hacia la derecha después de la partición de líquido en cada una de las capas (iii) por el Multi-frasco después de la partición en el plano incubadora. El uso adecuado de Multi-frasco lleva a la producción de una población celular homogénea dentro de cada buque que se cultiva en un ambiente que es congruente con el T-175 frascos (5). Estas embarcaciones ofrecen las células 3 y 5 veces más en un tamaño similar a la del frasco T-175. El recipiente 3 y 5 capas proporciona 525 y 875cm 2 de área de crecimiento, respectivamente, y ofrecen el espacio y mano de obra savings a los usuarios. Cultivo de Tejidos Tratamiento de la superficie es comparable a frascos estándar lo que permite ampliación sin necesidad de volver a la optimización de las condiciones actuales la cultura o comprometer la calidad, la homogeneidad o la realización de las células (6, 7). Esto también proporciona la comparabilidad con los datos recogidos anteriormente. Estos vasos pueden ser también revestidos con reactivos tales como colágeno, fibronectina, poli-D-lisina para proporcionar un sustrato especializado para la fijación, crecimiento y diferenciación de ciertos tipos celulares como los hepatocitos 8, 9 kertainocytes, las células madre cultivadas en medio libre de suero formulaciones. Soluciones de revestimiento se puede quitar con una retención mínima de líquido residual con el fin de reducir el desperdicio de reactivos de gran valor, así como la eliminación eficaz de solución de revestimiento que antes el cultivo de células. El volumen recomendado del papel óptimo de las células de cultivo en varios frascos de rango 0,142 a 0,287 ml / cm 2, que se traducen en 25 a 50 ml por cada capa. A diferencia de otro frasco de varias capas, tsu producto ofrece una combinación de puerto en el vaso que le permite rápida en recipiente de mezcla, así como una distribución uniforme de las células y los reactivos dentro y entre las capas de cada buque. Diversas líneas celulares, cultivos primarios y las células madre se han ampliado de manera eficiente el uso de varios frascos. Estos vasos sanguíneos son particularmente ventajoso en aplicaciones que requieren un gran número de células, como en el cribado de alto-, la producción de vacunas, transfecciones vector viral y terapia celular. Ahorro de tiempo, espacio, trabajo y generación de residuos se reducen las ganancias fundamentales de la Petaca Multi-contra las culturas tradicionales en una sola capa de vasos sanguíneos. Podemos cultura aproximadamente tres veces el número de células recolectadas a partir de 5, T-175 frascos en el mismo espacio con 3, 5 capas múltiples frascos. Esta ventaja en ahorro de espacio no se limita sólo a la T-175, pero también se puede extender a otros buques: un aparato giratorio botella estándar que encaja en común incubadoras de laboratorio casas ~ 4 roller botellas (2200 ml) cada una de ellas ofrece 850cm 2 de superficie. En la misma zona, aproximadamente 20, de 5 capas de varios frascos pueden ser mantenidos por lo tanto proporciona cinco veces la superficie de crecimiento de las células de cultivo. Por otra parte, con un aumento en el &quot;Go-Green&quot; la conciencia, las opciones para reducir la generación de residuos es altamente deseable. A este respecto, hay un 38% (5, T-175 frascos de peso ~ 640g, mientras que uno, de 5 capas Multi-frasco pesa ~ 400 g) disminución en la generación de residuos a través de múltiples cofres en comparación con el T-175 frascos y estas ventajas conducen a la disminución de almacenamiento de residuos y los costes de eliminación y el resultado en un ahorro económico para el usuario.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 3-capa de Cultivo de Tejidos tratados con 525cm 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353143 </td><td rowspan="21"> <a href="http://www.bdbiosciences.com/cellculture/multiflasks/index.jsp">BD Biosciences cultivo celular - BD Falcon Multi-Frascos</a> </td></tr><tr><td> De 5 capas de Cultivo de Tejidos tratados con 875cm 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353144 </td></tr><tr><td> 100 ml pipeta </td><td> BD Biosciences </td><td> 357600 </td></tr><tr><td> Pipeta de 10 ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 357551 </td></tr><tr><td> 5 ml de aspiración pipeta </td><td> BD Biosciences </td><td&gt; 357501 </td></tr><tr><td> 50 ml tubo de polipropileno cónico </td><td> BD Biosciences </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> T-175 frasco de cultivo de tejidos tratados con </td><td> BD Biosciences </td><td> 353028 </td></tr><tr><td> Gramo de cristal violeta </td><td> BD </td><td> 212525 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> GMEM </td><td> Sigma </td><td> G5154 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> ATCC </td><td> 30-2001 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> ATCC </td><td> 30-2003 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> El suero fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Triptosa fosfato caldo </td><td> Sigma </td><td> T8159 </td&gt; </tr><tr><td> Células BHK-21 </td><td> Sigma </td><td> 85011433 </td></tr><tr><td> Hep-G2, LNCaP </td><td> ATCC </td><td></td></tr><tr><td> Ecopack 2-293 </td><td> Clontech </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Poliestireno bolas </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 24628-20 </td></tr><tr><td> Bio-Flex Analizador de Perfil </td><td> Nova Biomedical </td><td></td></tr></tbody></table>

scale-up of mammalian cell culture using a new multilayered flask

Un número creciente de aplicaciones basadas en Cell requieren grandes cantidades de células. El uso de una sola capa frascos T, que son adecuadas en pequeña escala, la expansión, puede llegar a ser complicado, laborioso y requiere mucho tiempo, cuando un gran número de células se necesitan. Para satisfacer esta necesidad, la realización de un nuevo multi-capas recipiente de cultivo de células para facilitar la escala fácil de las células de capa única frascos T serán discutidos. Los frascos de prueba están disponibles en 3 - y el formato de 5 capas y permitir la recuperación de la cultura y completa de tres y cinco veces el número de células, respectivamente, en comparación con el T-175 frascos. Una característica clave de la BD Multi-frasco es un puerto de mezcla / de equilibrio que permite una rápida en recipiente de mezcla, así como una distribución uniforme de las células y los reactivos dentro y entre las capas de cada buque y constantemente producen las células que pueden ser cultivados en un ambiente que es congruente con el T-175 frascos. El diseño de estos frascos multi-también permite cacceso pipeta onvenient para la adición de reactivos y las células directamente en los frascos, así como la recuperación eficiente de valiosas células y los reactivos y reduce el riesgo de contaminación por el vertido. Para aplicaciones donde se prefiere verter más de pipeteado, el diseño permite una retención mínima de líquido residual con el fin de reducir el desperdicio de valiosas células y los reactivos.

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Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

Células juegan un papel fundamental y creciente en la investigación y el descubrimiento y desarrollo de nuevos tratamientos. Con esta creciente necesidad de un mayor número de células que necesitamos maneras más eficientes y eficaces para el cultivo y la recolección de células apego dependiente. Un matraz de múltiples capas con las características adecuadas puede servir para este propósito.

La ampliación de los cultivos celulares de mamíferos con un frasco de varias capas de Nueva

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

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37.4K vistas.  BD Biosciences. Células juegan un papel fundamental y creciente en la investigación y el descubrimiento y desarrollo de nuevos tratamientos. Con esta creciente necesidad de un mayor número de células que necesitamos maneras más eficientes y eficaces para el cultivo y la recolección de células apego dependiente. Un matraz de múltiples capas con las características adecuadas puede servir para este propósito.

Video: Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

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The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Determinación del recuento de células de mamíferos, el tamaño celular y la salud de la célula mediante el Moxi Z Mini contador automatizado de células

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Preparación de suero de rata Adecuado para mamíferos Whole cultivo de embriones

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Proteína entrega directa de células de mamíferos Utilización de Células permeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Su<sub&gt; 2</sub&gt; Dominios de zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

Sistema de cultivo de órganos de grasa corporal en Aedes Aegypti, Vector del Virus Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that the incubation in normoxic (5% CO2 in air) or hypoxic (low oxygen levels) conditions followed by an anoxic incubation (an absence of free oxygen) results in limited viability (2&#8211;3 days). A novel methodology was developed that enables an anoxic cell cultivation (for at least 17 days; the maximum time tested). The most critical aspect of this methodology is to ensure that no oxygen is introduced into the system. This is obtained by the degassing of media, and by flushing tubes, dishes, flasks, and pipettes with an anaerobic gas mixture (H2, CO2, N2) followed by permitting the materials to equilibrate to the anoxic (non-oxygen) environment prior to usage.&#160;Additional care must be exercised when acquiring photomicrographs to ensure that the micrographs obtained do not contain artifacts. In the absence of oxygen, cell morphology is significantly altered. Two distinct morphotypes are noted for all anaerobically-grown cells. The ability to grow and maintain mammalian cells in the absence of oxygen can be applied to the analysis of cell physiology, polymicrobial interactions, and the characterization of biosynthetic pathways for novel cancer drug development.

Here, we describe a new method that enables the anaerobic long-term cultivation of established cell lines. The maximum survival time that was tested is 17 days. This method is suitable for the testing of cytotoxic agents and exploring the physiology of anoxically replicating cells.

Crecimiento anaerobio y mantenimiento de líneas de células de mamífero

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...