1. Protocole d&#39;utilisation multi-Flacons pour culture cellulaire <ol><li> Préparation des bateaux et l&#39;ajout de suspension cellulaire <ol><li> Préparer le milieu de croissance cellulaire, au besoin. </li><li> Line up multi-Flacon verticalement sur le côté avec le bouchon vers le haut sur la surface de travail (stérile hotte à flux laminaire). <ol><li> Ces flacons sont disponibles en 3 et 5 couches de formats et d&#39;utiliser un même modèle de flux de travail comme un flacon T-175. </li></ol></li><li> Desserrer et enlever les bouchons. Ajouter la quantité requise de pré-chauffé moyennes dans la fiole à l&#39;aide d&#39;une pipette de 50 ou 100 ml ou en versant. <ol><li> Pipettes qui sont ≤ 10 ml peut atteindre le fond de la cuve lorsque Multi-flacons sont placés verticalement avec bouchon vers le haut. Pipettes ≥ 10 ml peut atteindre dans le navire immédiatement passé le logo sur le flacon multi-, fournissant ainsi un portail pratique pour ajouter de plus grands volumes de médias à la cuve. </li></ol></li><li> Pour éviter des bulles moyennes, permettent flux de liquide vers le FLomment le long de la paroi intérieure du couvercle multi-Flacon (logo-côté). </li><li> Ajouter suspension cellulaire provenant d&#39;un stock de cellules concentrées dans un milieu de croissance à travers la couche supérieure en utilisant une pipette de 10 ml et flacons en casquette. Conseils: - Transport multi-flacons sur un panier sur le site incubateur et effectuez les étapes restantes. - La densité de semis de cellules varie en fonction du type cellulaire, le milieu et la nécessité durée de culture. Commencez avec la densité de semis et de volume de support à celle utilisée dans la norme T-175 flacons et multiplier par 3 ou 5 selon le Flacon multi-format utilisé. </li></ol></li><li> Le mélange des cellules <ol><li> Mélanger position: tenir le ballon multi-debout avec le logo en face de vous et tournez dans le sens antihoraire à un angle de 45 ° avec le port en face de vous mélanger. </li><li> Tenir le même angle, doucement basculer Multi-Ballon d&#39;avant en arrière (cou loin de vous) jusqu&#39;à ce liquide dans la couche supérieure draine entièrement downwarDS via le port mix. Pivot sur le mix à bâbord. </li><li> De même, secouez légèrement Multi-Ballon d&#39;arrière en avant (cou vers vous) jusqu&#39;au support des drains pleinement de la couche du bas vers le haut à travers le port mix. Répétez les étapes 1.2.2 et 1.2.3 une fois de plus pour assurer un mélange adéquat. </li><li> Apportez Multi-Flacon en position mélanger (étape 1.2.1) et passez à l&#39;étape 1.3 </li><li> Alternativement, la suspension de cellules peuvent être préparés à l&#39;extérieur du flacon multi-et la suspension cellulaire peut être ajouté dans la cuve à l&#39;aide d&#39;une pipette ou par douce coulée. <ol><li> Port de Mix permet en cuve de mélange de cellules avec les médias et élimine le besoin de faire de gros volumes de suspensions cellulaires à l&#39;extérieur. </li><li> Il permet également d&#39;égalisation des médias à travers les couches de la fiole multi- </li></ol></li></ol></li><li> L&#39;équilibrage des fluides <ol><li> Après le mélange / ajout de la suspension cellulaire, lieu multi-Flacon verticalement sur une surface plane pour égaliser le volume de liquide équationlly dans toutes les couches. </li></ol></li><li> Partition de liquide dans chaque couche <ol><li> Tenir le ballon multi-avec le logo en face de vous et tournez à un angle de 45 ° à la partition du liquide dans chacune des couches. Astuce: - Pour de meilleurs résultats, il est important d&#39;utiliser une surface de travail plane pour les étapes 1.3 à 1.4 </li></ol></li><li> Transport <ol><li> Une fois que les médias contenant des cellules en suspension est partitionné, le transport multi-ballon à 45 ° d&#39;angle mêmes (sens horaire) comme à l&#39;étape 1.4.1 avec les médias loin du port mélanger dans l&#39;incubateur. Cette position est également adapté pour retirer des flacons de l&#39;incubateur pour une visualisation sur un microscope. </li></ol></li><li> Placer Multi-Flask sur incubateur étagères <ol><li> Tenir Multi-ballon à l&#39;angle de 45 ° (sens horaire, loin de mix-port), doucement pivoter à l&#39;horizontale sur la surface incubateur (en utilisant le coin loin du port comme un mélange depivot). Lay Multi-Ballon avec le logo vers le haut. <ol><li> Falcon multi-Flacon de conception permet aux navires d&#39;être empilés et les maintient en place par une nervure robustes empilage. </li></ol></li></ol></li><li> Distribution des cellules et des réactifs <ol><li> Après avoir placé multi-Flacon à plat sur une surface de travail, doucement d&#39;avant en arrière et de côté à côté pour distribuer uniformément sur les surfaces des cellules de culture en prenant soin de ne pas renverser de liquide de chaque couche. Pile flacons. <ol><li> Ce flacon est faite d&#39;un matériau optiquement clair et cellules sur la dernière couche peut être facilement visualisées sur un microscope. </li></ol></li></ol></li><li> Media Exchange <ol><li> Aspirer tout en inclinant le flacon multi-vers la gauche (mix à bâbord) avec le logo en face de vous. </li><li> Puis tilt, le ballon multi-vers la droite, en continuant d&#39;aspirer tous les médias résiduelle. </li><li> Ajouter la quantité appropriée de médias et de suivre les étapes 01/03 au 01/07 </li></ol></li></ol> 2.Récolte des cellules de Multi-Flacons <ol><li> Pour dissocier les cellules, jusqu&#39;à la ligne Multi-flacons à la verticale et amener chacun à Mix position (étape 1.2.1). Retourner doucement flacons avec col en face de vous, afin de permettre aux médias de vidange pour la couche supérieure de Multi-Flask. </li><li> Insérez un 5 ou 10 ml pointe de l&#39;aspiration par le cou jusqu&#39;à ce que vous atteignez le niveau de liquide près du port mix. Aspirer moyennes épuisées. </li><li> Ajouter la dissociation réactif / tampon de lavage et amener à la position Mix comme dans l&#39;étape 1.2.1, passez et suivez les étapes 1.3 à 1.7. Neutraliser avec un milieu de croissance / agent neutralisant et versez la suspension cellulaire dans un tube de réception ou d&#39;inverser flacon tels que les cellules de vidange pour la couche supérieure de la cuve et de recueillir des cellules à l&#39;aide d&#39;une pipette de 10 mL. Astuce: Pour améliorer la récupération des cellules ou des réactifs, mettre Multi-ballon pour bien mélanger la position (étape 1.2.1), inverser avec le cou vers l&#39;opérateur pour permettre un drainage complet de supports d&#39;al<html> couches l pour la couche supérieure. Ensuite, l&#39;inclinaison multi-Flask le sens horaire pour 45 ° d&#39;angle (loin du port mix) tandis que le flacon multi-reste inversé. Utiliser une pipette (1-10 ml) pour collecter les réactifs restants. </li></ol> 3. Recommandée de volume de travail dans Falcon multi-flacons Les milieux de croissance 3-couche: 75 à 150 mL par flacon multi- 5-couche: 125-250 mL par flacon multi- La dissociation d&#39;agent 3-Layer: ≥ 15 ml par flacon multi- 5-Layer: ≥ 25 ml par flacon multi- Astuce: Commencez avec un volume moyen utilisé dans la norme T-175 flacons et multiplier par 3 ou 5 fois selon le Flacon multi-format évaluées afin que mL par unité de surface reste la même. 4. Les résultats représentatifs: 1. Conception de Falcon multi-Flacon files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg &quot;/&gt; . Figure 1: Multi-Flacon de culture cellulaire bateaux sont disponibles dans une 3 - et 5-couche de forme empilables pour mise à l&#39;échelle de cellules fournissant 525 et 875 cm 2 de surface de croissance, respectivement. Pipette d&#39;accès facilite ajout et la suppression des cellules et des réactifs dans et hors du navire. Présence du mix-port permet rapidement en cuve de mélange et d&#39;égalisation des médias à travers toutes les couches de la fiole multi-. 2. Rendement cellulaire en utilisant Multi-Flacon: Ces vaisseaux sont disponibles en 3 couches et 5 couches formats qui correspondent aux 3 et 5 fois la surface de la T-175 flacons. En conséquence, ≥ 3 et 5 fois (130 ± 6,8 x 10 6 et 218 ± 23,6 x 10 6 cellules, respectivement) le nombre de cellules BHK-21 (Baby Hamster Kidney) cellules ont été cultivées et récupéré de Multi-Flask par rapport à T-175 flacons (43,2 ± 3,5 x 10 6 cellules; Fig.2a). Le rendement par cellule unit surface était équivalente dans les 3 - et 5-couche multi-flacons et T-175 flacons pour BHK-21, LNCaP (ligne de la prostate humaine de cellules d&#39;adénocarcinome), Hep-G2 (lignée cellulaire humaine hépatocarcinome), Ecopack 2-293 (humaines lignée cellulaire de rein) cultivés pendant une période de 48-96h (Fig.2b) dans les milieux de croissance (35 ml par couche) comme recommandé par le fournisseur de cellulaire (ATCC, Sigma et / ou Clontech). Les cellules ont été dénombrées sur un système automatisé de Vi-CELL contre (1). <img alt="Figure 2A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2A.jpg" /> Figure 2A: trois et cinq fois le nombre de cellules BHK-21 ont été cultivées et récupérées à partir de 3 - et 5-couche multi-flacons par rapport à T-175 flacons. Rendement attendu a été déterminé en utilisant le rendement moyen des cellules de contrôle T-175 flacons multiplié par trois et cinq fois pour les 3 - et 5-couche multi-flacons respectivement (n = 4 flacons / format). <img alt="Figure 2B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2B.jpg" /><br/ Figure 2B&gt;: le rendement de cellules par cm 2 a été équivalente dans les 3 - et 5-couche multi-flacons et T-175 flacons pour BHK-21, LNCaP, HepG2 et EcoPack2-293 cellules. Chaque barre représente dire de 4 à 6 flacons. Cellules BHK-21 (11000 cellules/cm2) ont été cultivées pendant 72 heures, les cellules LNCaP (20000 cellules/cm2) et EcoPack2-293 cellules (~ 35 000 cellules/cm2) ont été cultivées pendant 96 heures et les cellules HepG2 (25.000 cellules / cm 2 ) ont été cultivées pendant 48 heures avant la récolte. 3. Distribution de médias parmi les couches de Multi-Ballon Milieu de culture cellulaire (DMEM; Invitrogen) a été ajouté à cinq couches multi-flacons (250 navires mL/5-layer) et partitionné en couches selon le protocole décrit ci-dessus. La distribution des médias a été mesurée par forage de trous dans chaque couche et des médias pompée à partir des couches individuelles. Poids du liquide récupéré de chaque couche a été jugée relativement uniforme d&#39;une couche à tel qu&#39;illustré à la figure 3. Ils sont comme suit: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (GM). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig3.jpg" /> Figure 3. Uniforme de distribution des médias dans chacun des cinq couches d&#39;une couche de 5-Multi-Ballon. Milieu de culture cellulaire a été ajouté à multi-flacons (250 navires ml/5-layer), équilibrée et cloisonné à des couches individuelles. Les médias a été pompé à travers des trous percés dans les couches individuelles et le poids du liquide a été enregistré à partir de chaque couche (n = 6 flacons). Distribution de la cellule 4. Entre des couches de Multi-Ballon Les cellules peuvent être ajoutés et mélangés dans le flacon multi-. Nous distribution simulée des cellules entre les couches de Multi-Flacon en utilisant des perles (10 microns; Polysciences Inc) de taille similaire aux cellules. Suspension de billes a été ajouté dans la cuve Flacon multi-aide d&#39;une pipette de 10 mL à travers la couche supérieure et mélangé avec les médias dans le navire comme described dans le protocole ci-dessus. La distribution de billes a été mesuré par des trous de forage dans chaque couche et fluide contenant suspension de billes a été pompée à partir des couches individuelles. La concentration de billes récupérer auprès de chaque couche a été lue sur un compteur Coulter et enregistrées. Ci-dessous sont équivalentes inter-couches distributions billes en 3 couches multi-flacons (fig.4a). Le mix-port permet une répartition homogène de cellules et de réactifs entre les multi-couches Flask. <img alt="Figure 4A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4A.jpg" /> Figure 4A: la distribution de billes dans chacune des trois couches d&#39;une couche de 3-Multi-Ballon. Une suspension de perles (3,6 x10 6 / ml) a été ajouté au milieu distribué dans multi-flacons (suspension de billes: le volume des médias est de 1:10, vol: vol) et mixte, suivie d&#39;équilibration et les étapes partition en utilisant le protocole décrit. La concentration de billes récupérer auprès de chaque couche (moyenne pompée à travers des trous percés sur chaque couche) a été lue sur un comte CoulterER et enregistrées. Ci-dessous sont équivalentes inter-couches distributions de billes dans 3 - la couche multi-flacons (n ​​= 5 flacons) Ci-dessous sont des images représentatives de schémas Ecopack coloration 2-293 de cellules cultivées à confluence&gt; 80% sur le 3-couche multi-flacons dans les milieux de croissance complété. Monocouches de cellules ont été fixées et colorées avec du cristal violet et multi-couches Flask ont ensuite été coupées et les images numérisées (2). Structuration des cellules Remarque, a été homogène sur toutes les couches de Multi-Flacon (Fig.4B). Des résultats similaires ont été obtenus avec plusieurs types de cellules évalués (données non présentées). <img alt="La figure 4B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4B.jpg" /> Figure 4B: Cette figure illustre la croissance des cellules homogènes entre les couches de la multi-flacons. Ecopack-2-293 cellules cultivées jusqu&#39;à confluence&gt; 80% en 3 couches multi-flacons et T-175 ont été fixées et colorées avec du cristal violet. Multi-Flacon navires ont été coupées et chaque couche teinté a été scannée. 5 d&#39;alimentation en air de Multi-Flask.: Analyse des médias consacré à l&#39;utilisation BioProfile FLEX analyseur (3,4) (Nova Biomedical) de EcoPack2-293 cellules cultivées pendant 96 heures n&#39;a révélé aucune différence dans la saturation de l&#39;air des cellules cultivées en 5 couches multi-Flacons vs T-175 flacons (81,03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% ambiante O 2). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig5.jpg" /> Figure 5: Air saturation (% ambiante O 2) des médias a passé étaient similaires dans les médias pré-mélangés de 5 couches multi-Flacons vs T-175 flacons. EcoPack2-293 cellules ont été ensemencées à une densité de 35000 cellules / cm 2 et cultivées pendant 96 heures avant l&#39;analyse des médias (n = 3 flacons).

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	<li>Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+automated+instrument+for+viability+and+concentration+mesurements+of+cryopreserved+hematopoietic+cells.">Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells.</a> Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).</li><li>Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+growth+assay+for+epidermal+cell+cultures+by+their+crystal+violet+binding+capacity.">Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity.</a> Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).</li><li>Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Flux+analysis+of+CHO+cell+metabolism+in+the+late+non-growth+phase.">Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).</li><li>Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+elevated+pCO2+and+osmolality+on+growth+of+cells+and+production+of+antibody&#x2013;fusion+protein+B1:+a+case+study.">Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody&#x2013;fusion protein B1: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 21, (2005).</li><li>Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+culture+medium+volume+on+cell+density+and+life-span+of+human+diploid+fibroblasts.">The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts.</a> Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).</li><li>Flaherty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tips and Techniques for enhancing your cell culture. , (2009).</li><li>Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. , (2011).</li><li>DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+coordinately+modulates+liver+transcription+factors+and+hepatocyte+morphology.">The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology.</a> Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).</li><li>Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crucial+role+of+&#x03B2;1+integrins+for+keratinocyte+migration+in+vitro+and+during+cutaneous+wound+repair.">A crucial role of &#x03B2;1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair.</a> Dev. 129, 2303-2303 (2002).</li></ol>

Tous les auteurs sont des employés de Becton Dickinson, segment Biosciences, Discovery Labware Unité.

L&#39;étude actuelle démontre l&#39;augmentation de la productivité que la conception du flacon multi-offre aux chercheurs. S&#39;il est important de suivre les étapes décrites ci-dessus pour des performances optimales lors de l&#39;utilisation multi-flacons, il ya quelques étapes cruciales dans ce protocole qui sont jugées les plus essentielles. Il s&#39;agit notamment (i) le mélange de cellules et de réactifs en utilisant le port mélange dans la cuve (ii) en transportant Multi-ballon à un angle de 45 ° vers la droite après un partitionnement de liquide dans chacune des couches (iii) la pose multi-plates Flacon après partitionnement dans le incubateur. L&#39;utilisation appropriée de Multi-Flacon conduit à la production d&#39;une population cellulaire homogène au sein de chaque navire qui est cultivée dans un milieu qui est congru à T-175 flacons (5). Ces navires offrent des cellules 3 et 5 fois plus dans un encombrement similaire à celui du flacon T-175. La cuve 3 et 5-couche fournit 525 et 875cm 2 de surface de croissance, respectivement, et offrent à la fois l&#39;espace et du travail savings aux utilisateurs. Le traitement de surface de culture de tissus est comparable à fioles étalons permettant ainsi mise à l&#39;échelle sans avoir besoin de re-optimiser les conditions de culture existantes ou compromettre la qualité, l&#39;homogénéité ou la performance des cellules (6, 7). Cela fournit également des fins de comparabilité avec les données déjà collectées. Ces navires peuvent être également revêtues avec des réactifs tels que le collagène, la fibronectine, la poly-D-lysine pour fournir un substrat spécialisé pour l&#39;attachement, la croissance et la différenciation de certains types cellulaires comme les hépatocytes 8, 9 kertainocytes, les cellules souches cultivées dans un milieu sans sérum formulations. Solutions de revêtement peut être enlevé avec une rétention de liquide résiduelle minimale afin de réduire le gaspillage de précieux réactifs ainsi que l&#39;élimination effective de la solution de revêtement avant la culture de cellules. Le volume optimal recommandé de médias pour des cellules en culture dans des flacons multi-gamme de 0.142 à 0,287 ml / cm 2, qui se traduisent par 25-50 ml par couche. Contrairement à un autre flacon multicouche, tson produit offre un mélange-port dans la cuve qui permet rapidement en cuve de mélange ainsi que la distribution uniforme des cellules et des réactifs au sein et entre les couches de chaque navire. Lignées cellulaires, cultures primaires et les cellules souches ont été élargis de manière efficace à l&#39;aide multi-flacons. Ces navires sont particulièrement avantageux dans les applications qui exigent un grand nombre de cellules comme dans un haut débit de dépistage, la production de vaccins, transfections de vecteurs viraux et de thérapie cellulaire. Gain de temps, d&#39;espace, le travail et la production de déchets réduits sont les gains clés de la fiole multi-versus cultures conventionnelles en une seule couche navires. Nous pouvons la culture d&#39;environ trois fois le nombre de cellules récoltées à partir de 5, T-175 flacons dans le même espace en utilisant 3, 5-couche multi-flacons. Cet avantage en gain d&#39;espace n&#39;est pas limité seulement à T-175, mais peut aussi être étendue à d&#39;autres navires: un appareil à rouleaux standard bouteille qui s&#39;inscrit dans les incubateurs de laboratoire communs maisons ~ 4 rolbouteilles LER (2200 ml) dont chacune fournit 850cm 2 de surface. Dans la même région, ~ 20, 5-couche multi-flacons peuvent être hébergés offrant ainsi cinq fois la surface de croissance pour les cellules de culture. En outre, avec une augmentation de la «Allez-vert&quot; de sensibilisation, des options pour réduire la production de déchets est hautement souhaitable. À cet égard, il ya un 38% (5, T-175 flacons pèse 640g ~ alors que l&#39;on, à 5 couches multi-Flacon pèse ~ 400g) diminution de la production de déchets à l&#39;aide multi-flacons par rapport à T-175 flacons et ces avantages se traduisent par à diminuer dans le stockage des déchets et les coûts d&#39;élimination et de traduire par des économies pour l&#39;utilisateur.

<table border="1"><tbody><tr><td> Le nom du réactif / Equipement </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Tissu 3 couches, de la culture traitée 525cm 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353143 </td><td rowspan="21"> <a href="http://www.bdbiosciences.com/cellculture/multiflasks/index.jsp">Culture cellulaire BD Biosciences - BD Falcon multi-flacons</a> </td></tr><tr><td> Tissu à 5 couches de la culture traitée 875cm 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353144 </td></tr><tr><td> 100ml pipette </td><td> BD Biosciences </td><td> 357600 </td></tr><tr><td> Pipette de 10 ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 357551 </td></tr><tr><td> 5 ml aspiration pipette </td><td> BD Biosciences </td><td&gt; 357501 </td></tr><tr><td> Tube de 50 ml en polypropylène coniques </td><td> BD Biosciences </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> T-175 Tissu flacon de culture traitée </td><td> BD Biosciences </td><td> 353028 </td></tr><tr><td> Gram Cristal Violet </td><td> BD </td><td> 212525 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> GMEM </td><td> Sigma </td><td> G5154 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> ATCC </td><td> 30-2001 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> ATCC </td><td> 30-2003 </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Bouillon tryptose phosphate </td><td> Sigma </td><td> T8159 </td&gt; </tr><tr><td> Cellules BHK-21 </td><td> Sigma </td><td> 85011433 </td></tr><tr><td> Hep-G2, LNCaP </td><td> ATCC </td><td></td></tr><tr><td> Ecopack 2-293 </td><td> Clontech </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Perle de polystyrène </td><td> Polysciences Inc </td><td> 24628-20 </td></tr><tr><td> Bio-Flex Analyzer profil </td><td> Nova Biomedical </td><td></td></tr></tbody></table>

scale-up of mammalian cell culture using a new multilayered flask

Un nombre croissant d&#39;applications basées sur les cellules nécessitent un grand nombre de cellules. L&#39;utilisation de simple couche t-flacons, qui sont adéquates lors de l&#39;expansion à petite échelle, peut devenir lourd, laborieux et fastidieux lorsque de grands nombres de cellules sont nécessaires. Pour répondre à ce besoin, la performance d&#39;un nouveau multi-couches récipient de culture cellulaire afin de faciliter l&#39;échelle facile de cellules à partir couches simples flacons T sera discutée. Les flacons testés sont disponibles en 3 - et 5-couche de format et de permettre la récupération complète de la culture et de trois à cinq fois le nombre de cellules, respectivement, par rapport à T-175 flacons. Une caractéristique clé de la BD Multi-Ballon est un port de mix / équilibration qui permet rapidement en cuve de mélange ainsi que la distribution uniforme des cellules et des réactifs au sein et entre les couches de chaque navire et produire constamment des cellules qui peuvent être cultivées dans un milieu qui est congru à T-175 flacons. La conception de ces flacons multi-c permet également del&#39;accès pipette onvenient pour l&#39;ajout de réactifs et de cellules directement dans les flacons ainsi que la récupération efficace des cellules précieuses et des réactifs et réduit les risques de contamination due à la coulée. Pour les applications où versant est préféré au pipetage, la conception permet de rétention de liquide résiduelle minimale afin de réduire le gaspillage de précieuses cellules et des réactifs.

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Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

Cellules jouent un rôle déterminant et croissant dans la recherche et la découverte et le développement de nouvelles thérapeutiques. Avec ce besoin croissant de plus grand nombre de cellules, nous devons trouver des moyens plus efficaces et plus efficace pour cultiver et récolter les cellules de fixation à charge. Un flacon multicouche avec les bonnes caractéristiques peuvent servir à cette fin.

Scale-Up de la culture des cellules de mammifères en utilisant un nouveau flacon multicouches

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Cellules d&#39;imagerie à long terme des mammifères en utilisant la microscopie à champ large

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Développement de nouvelles applications thérapeutiques utilisant la microfluidique

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Détermination du nombre de cellules de mammifères, taille des cellules et la santé des cellules à l&#39;aide du Moxi Mini Z Compteur de cellules automatisé

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Préparation du Rat Serum Convient pour la culture d&#39;embryons de mammifères entier

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Protein livraison directe aux cellules de mammifères en utilisant la cellule perméable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domaines doigt de zinc

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

Système de Culture ou organe de corps gras chez Aedes Aegypti, vecteur de Virus Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that the incubation in normoxic (5% CO2 in air) or hypoxic (low oxygen levels) conditions followed by an anoxic incubation (an absence of free oxygen) results in limited viability (2&#8211;3 days). A novel methodology was developed that enables an anoxic cell cultivation (for at least 17 days; the maximum time tested). The most critical aspect of this methodology is to ensure that no oxygen is introduced into the system. This is obtained by the degassing of media, and by flushing tubes, dishes, flasks, and pipettes with an anaerobic gas mixture (H2, CO2, N2) followed by permitting the materials to equilibrate to the anoxic (non-oxygen) environment prior to usage.&#160;Additional care must be exercised when acquiring photomicrographs to ensure that the micrographs obtained do not contain artifacts. In the absence of oxygen, cell morphology is significantly altered. Two distinct morphotypes are noted for all anaerobically-grown cells. The ability to grow and maintain mammalian cells in the absence of oxygen can be applied to the analysis of cell physiology, polymicrobial interactions, and the characterization of biosynthetic pathways for novel cancer drug development.

Here, we describe a new method that enables the anaerobic long-term cultivation of established cell lines. The maximum survival time that was tested is 17 days. This method is suitable for the testing of cytotoxic agents and exploring the physiology of anoxically replicating cells.

La croissance anaérobie et l’entretien de lignées cellulaires de mammifères

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...